一种运用特定区段随机突变法改造漆酶的方法及漆酶菌株lac123
技术领域
1.本发明涉及一种运用特定区段随机突变法改造漆酶的方法及漆酶菌株lac123，属于分子生物学及酶工程技术领域。
背景技术：2.漆酶(ec 1.10.3.2)是一种生物催化剂，能够将氧还原为水而不产生有害的副产物，作用底物也十分广泛，被认为是"环境友好"的一种酶，目前在环境、工业和生物技术领域受到极大关注，但目前现有的漆酶多存在酶活力较低、热稳定性较差等缺陷，且工业生产中伴有高温、强酸、强碱、高盐、有毒介质等特殊反应体系，传统野生漆酶极易失活，已经不能满足生产需求。分子改造作为一种提高酶产量和改善酶学性质的重要手段，日益得到广泛应用也必将带来巨大的经济效益和深远的科学意义。
3.酶分子改造是一种针对酶自身性质上的不足通过定向改造酶分子获得人们所希冀、自然界尚未发现的新酶的技术。随着人们对酶了解的深入，通过对酶基因序列，空间结构及催化方式等信息进行分析，结合先进的分子生物学手段，对酶分子进行改造的思路和手段越来越多。目前可应用于改造酶分子的方法主要分为化学修饰法和生物酶工程法两种。酶的化学修饰通过在酶的侧链基团上接上或去掉一些化学基团来改变酶的催化性质，方法较为简单，但易产生理化性质的改变。理想的方式是调整酶分子关键部位的氨基酸从而产生令人满意的效果，随着基因工程技术及蛋白质组学的发展，人们可以通过对酶氨基酸序列，蛋白质结构进行分析，利用生物信息学方法进行人工模拟，以现有的漆酶序列为基础进行设计改造，使其具有预期优良性能，以达到更好、更广泛的利用目的。
4.目前常用的用来在蛋白质基因中引入突变的方法有定点突变、易错pcr、dna重排、n端融合信号肽等等，尽管具体的操作方法有所不同，但设计思路都是在现有酶的dna序列的基础上构建突变库，再用合适的批量筛选方法，筛选出具有特殊性能的突变体，最终获得在某些方面具有更优异性能的酶。
5.检索国内外文献和专利，目前尚未发现利用同源重组连接随机突变序列构建突变文库技术的相关报道。
技术实现要素：6.本发明所要解决的技术问题是：如何通过特定区段随机突变法获得酶活更高的漆酶。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种运用特定区段随机突变法改造漆酶的方法，包括如下步骤：
8.步骤1：提取白腐真菌漆酶lac1基因的dna序列，与数据库中的漆酶结构域和活性中心序列进行比对，选定lac1第二结构域和第三结构域靠近漆酶活性位点附近的重要功能区段作为靶标序列；
9.步骤2：在对该靶标序列进行化学合成时，采用简并引物法在特定的若干个碱基位点引入随机突变，得到随机突变序列；
10.步骤3：合成随机突变序列的dna片段，通过反向pcr方式获得在lac1基因序列上去除了靶标序列的pet-32a(+)-lac1载体，通过同源重组反应，将所述的随机突变序列的dna片段与载体pet-32a(+)-lac1连接，并转入大肠杆菌dh5α中得到lac1突变库；
11.步骤4：将突变库中的菌落合并抽提质粒，用于二代测序建库以及转入大肠杆菌bl21(de3)细胞中用于活性筛选，通过96孔板高通量摇菌的方法筛选得到酶活提升的漆酶菌株。
12.优选地，所述步骤2中的随机突变序列包括如seq id no：1和seq id no：2所示的序列；所述seq id no：1和seq id no：2所示的序列中n为a、t、c或g。
13.优选地，所述步骤3中如seq id no：1所示的随机突变序列的合成引物包括下列正向序列和反向序列：
14.正向序列：cactccttcctctacgactt；
15.反向序列：cgcaggccgtcacagtactggg。
16.优选地，所述步骤3中如seq id no：2所示的随机突变序列的合成引物包括下列正向序列和反向序列：
17.正向序列：ttcgccatcgtcttcgccga；
18.反向序列：gcagcttgtcgtagatggga。
19.优选地，所述步骤3中同源重组反应的底物包括：
20.载体 140ng；
21.随机突变序列的dna片段 20ng；
[0022]2×
clonexpress mix 5μl；
[0023]
ddh2o 补齐至10μl；
[0024]
所述同源重组反应的程序为：在50℃下反应15min。
[0025]
本发明还提供了一种酶活提升的漆酶菌株lac123，通过上述的运用特定区段随机突变法改造漆酶的方法获得，所述漆酶菌株lac123含有氨基酸序列如seq id no:3所示的表达蛋白。
[0026]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0027]
1.本发明的运用特定区段随机突变法改造漆酶的方法操作方便，突变目的性强，突变位点可以为1个，也可以为n个，其碱基随机掺入，原理上随机突变文库库容量可高达4n，a、t、g、c的重新组合构成了密码子的多样性，本发明的方法针对性强，且有益突变率高，可成功应用于各种性能筛选，如提高蛋白酶活性、增强蛋白稳定性、改变蛋白对底物特异性选择、蛋白对映选择性、增强蛋白可溶性和蛋白亲和力等方面，具有广泛的用途；
[0028]
2.本发明的方法筛选得到了一株酶活较野生型漆酶提升2.3倍的菌株，在工业中具有良好的应用前景。
附图说明
[0029]
图1为随机突变序列重组载体pet-32a(+)-lac1的构建示意图；
[0030]
图2为同源重组连接随机突变序列的示意图；
[0031]
图3为igv可视化分析随机突变序列1；
[0032]
图4为igv可视化分析随机突变序列2；
[0033]
图5为改造的漆酶菌株lac123与lac1序列对比图；
[0034]
图6为改造的漆酶lac123的三维结构模型。
具体实施方式
[0035]
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0036]
本发明将白腐真菌漆酶lac1基因的dna序列(seq id no:4)，与数据库中的漆酶结构域和活性中心序列进行比对，选定lac1第二结构域和第三结构域靠近漆酶活性位点附近的重要功能区段作为靶标序列，在对该序列dna进行化学合成时，采用简并引物法在特定的若干个碱基位点引入随机突变，并将合成好的随机片段通过同源重组的方法，对野生酶的相同片段进行替换，构建包含特异区段特定位点dna序列的随机突变库，通过二代测序对库容量进行检测，并对随机突变库中的大肠杆菌克隆进行漆酶活性的批量筛选，筛选得到了5株酶活明显提高的菌株，经过摇瓶复筛得到一株酶活提升2.3倍的突变漆酶。
[0037]
本发明针对需要在若干个碱基处引入随机突变的dna区段设计包含上下游序列的一段dna序列，长度约为50个碱基，在对该区段dna进行化学合成时，通过简并引物合成法，在这几个靶位点引入随机碱基，并设计包含同源臂的上下游引物，将这段dna片段进行pcr扩增，通过反向pcr方式获得在lac1基因序列上去除了在该片段的pet-32a(+)-lac1载体，将上述突变片段和载体片段通过同源重组的方式，将随机突变序列构入载体，并转入大肠杆菌dh5α中得到lac1突变库，将突变库中的菌落合并抽提质粒，用于二代测序建库以及转入大肠杆菌bl21(de3)细胞中用于活性筛选。
[0038]
本发明参照欧阳凤菊等人的96孔板高通量摇菌，将bl21(de3)转化平板克隆分别接入已预先在各孔加入150μl含有amp的lb培养基的96孔板中，置于37℃恒温培养箱中过夜。后各孔吸取20μl过夜培养的菌液转接到另一个含130μl液体培养基的孔板中培养2-3h，直到od600达到0.6-0.8左右，向各孔添加2μl 100μm的iptg，并在16℃条件下进行诱导表达，隔日将96孔板离心收集菌体，倒掉培养基。向每孔加入溶菌酶裂解细胞，用枪头反复吹打使之形成均匀的悬液，离心，收集上清。另取一96孔板，各孔加入50μlph 4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于酶标仪中37℃孵育3min，利用排枪向各孔中加入50μl上清液，测量在od
420
处1min内吸光度的变化值，对各克隆的酶活进行测定。
[0039]
以下实施例中，除特殊说明外，所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒、sanprep柱式dna胶回收试剂盒、sanprep柱式pcr产物回收试剂盒，一步法细菌活性蛋白提取试剂盒均购自上海生工生物工程，2
×
specific taq master mix购自近岸蛋白质，p520高保真酶，c115同源重组试剂盒购自诺维赞，2,2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(abts)购自碧云天生物。
[0040]
实施例1
[0041]
在ncbi上下载30余条不同来源的漆酶基因，将漆酶lac1基因序列利用分析软件clustalx与不同来源的漆酶基因进行比对，对这些序列的结构域和活性中心进行分析，找出影响酶活和底物特异性的区段，分别在化学合成dna片段时在第二结构域与第三结构域的关键区域特定位置参入任意碱基，委托生工生物进行两条随机突变序列的合成。随机突
变序列如表1所示，漆酶lac1基因序列如seq id no:4所示。
[0042]
表1随机突变序列
[0043][0044]
表1中下划线表示随机突变掺入位点。
[0045]
实施例2
[0046]
针对随机突变序列设计引物，对载体设计反向pcr引物，pet-32a(+)-lac线性化表达载体pcr程序如表2所示，相关引物如表3所示，随机突变序列pcr反应程序如表4所示。
[0047]
表2 lac1基因表达载体pcr反应程序
[0048][0049][0050]
表3随机突变基因表达文库相关引物
[0051]
引物名称引物序列(5
’→3’
)随机突变序列1-fcactccttcctctacgactt随机突变序列1-rcgcaggccgtcacagtactggg随机突变序列2-fttcgccatcgtcttcgccga随机突变序列2-rgcagcttgtcgtagatgggapet32a-1-fcccagtactgtgacggcctgcgpet32a-1-rgtagaggaaggagtggccggpet32a-2-ftctacgacaagctgcccgagpet32a-2-rgaagacgatggcgaagccgg
[0052]
表4随机突变序列pcr反应程序
[0053][0054]
pcr反应程序结束后，pet-32a(+)-lac1线性化载体用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，随机突变序列使用2.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0055]
利用sanprep柱式胶回收试剂盒按照说明书操作回收线性化载体和随机突变序列，测定浓度和纯度后保存于-20℃。
[0056]
实施例3
[0057]
随机突变序列重组载体pet-32a(+)-lac1的构建示意图如图1所示，利用ultra one step cloning kit分别依次将两条突变序列和表达载体进行连接，如图2所示，按照表5配制同源重组反应体系，同源重组反应程序如表6所示。
[0058]
表5同源重组反应体系
[0059]
体系组成用量线性化载体140ng插入片段20ng2
×
clonexpress mix5μlddh2o补齐10μl
[0060]
表5中，最适克隆载体使用量＝[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)，最适插入片段使用量＝[0.04
×
插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)。
[0061]
表6同源重组反应程序
[0062]
步骤温度(℃)反应时间(min)15015
[0063]
表6中，重组时间适当延长至30min，可提高重组效率，但最长不超过1h。
[0064]
实施例4
[0065]
同源重组反应结束后，立即将连接产物转化至dh5α感受态细胞中，转化具体操作如下：
[0066]
(1)将克隆用的50ul e.coli dh5α置于冰上解冻。
[0067]
(2)取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
[0068]
(3)42℃水浴热激90sec后，立即置于冰上冷却3min。
[0069]
(4)加入900μl lb液体培养基(不添加抗生素)，37℃、220rpm摇菌1h，并于超净台下紫外灯灭菌固体lb培养基平板。
[0070]
(5)菌液5000rpm离心5min，用剩余培养基将菌体重悬，在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。
[0071]
(6)涂板后将平板转移至37℃恒温培养箱中正面放置培养10min，然后将其倒置培
养至隔天中午收板。
[0072]
转化感受态细胞e.coli dh5α，构建随机突变基因表达文库从获得随机突变基因文库中随机挑取单克隆进行测序分析每个突变体约有2-6个氨基酸发生变化。在此基础上，提取随机突变基因文库混合质粒并转入e.coli bl21(de3)感受态细胞。
[0073]
实施例5
[0074]
(1)依次向pcr孔板中加入5μl灭菌ddh2o；用10ul枪头随机挑取生长状态好的单菌落在孔中吹打枪头，并在新的含有amp的lb平板上印迹，设计并合成pet-32a(+)-lac1随机突变序列表达载体菌落pcr引物，用于检测目的片段是否正确插入；引物序列如表7所示。
[0075]
(2)将印迹有单菌落的平板于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
[0076]
(3)按照表8依次向pcr孔板每孔中添加剩余菌落pcr反应体系，用黄枪头滴加一滴石蜡油封存液面，菌落pcr反应程序如表9所示。
[0077]
表7 pet-32a(+)-lac1随机突变序列表达载体菌落pcr引物
[0078]
引物名称引物序列(5
’→3’
)rd primer1catccactggcacggcttct随机突变序列1-rcgcaggccgtcacagtactggg随机突变序列2-rgcagcttgtcgtagatggga
[0079]
注：所有pet-32a(+)-lac1随机突变序列表达载体的菌落pcr上游引物均用位于载体上的通用引物rd primer1，下游引物均用随机突变序列的下游引物。
[0080]
表8菌落pcr反应体系
[0081]
体系组成用量模板(单菌落dna)枪头挑取菌落pcr引物(2μm)2.5μl2
×
taq master mix5μlddh2o5μl(已提前加入)
[0082]
表9菌落pcr反应程序
[0083][0084]
各孔取5μl菌落pcr产物用2.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0085]
测序鉴定：对照电泳结果中的阳性条带，在平板上挑取相对应的单克隆菌落，用10μl枪头挑取单克隆于装有5ml液体lb培养基的试管中，并加入5μlamp，置于37℃恒温摇床220rpm过夜培养。于超净台中吸取500ml添加甘油保存于-80℃，剩余利用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒，送至sangon进行测序鉴定。
[0086]
实施例6
[0087]
将未拆封的滤纸剪成平板大小进行高压灭菌，放置于超净台中进行紫外照射，用滤纸轻轻蘸取测序成功的平板的菌落，轻轻按压于新的含有amp的固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中过夜。用枪头轻轻刮下平板上所有质粒，接种于含有5ml lb培养基的试管中，置于37℃恒温摇床220rpm过夜培养。利用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取随机突变基因文库混合质粒，并将混合质粒转入e.coli bl21(de3)感受态细胞。
[0088]
实施例7
[0089]
将培养过夜的平板取出，向96孔板各孔中添加150μl含有amp的lb培养基，用白色枪头随机挑取单克隆，接种于96孔板中，并用封膜进行密封，置于37℃恒温培养箱中过夜。各孔吸取20μl过夜培养的菌液转接到另一个含130μl液体培养基的孔板中培养，直到od
600
达到0.6-0.8左右；原96孔板菌液密封保存置于4℃保存。向各孔添加2μl 100μm的iptg，并在16℃条件下进行诱导表达。隔日将96孔板5000rpm离心15min收集菌体，倒掉培养基。参照一步法细菌活性蛋白提取试剂盒，向每孔加入500μl lysozyme(每1ml提取试剂中加入1μl dtt和10μl pmsf)，用枪头反复吹打使之形成均匀的悬液，将其放置在恒温摇床上220rpm室温振荡30min左右。4℃，10000rpm离心15min，收集上清。向新的96孔板中各孔加入50μlph 4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于酶标仪中37℃孵育3min，利用排枪向各孔中加入50μl可溶性上清液，测量在od420处1min内吸光度的变化值。并利用5ml试管进行摇菌复筛。
[0090]
实施例8
[0091]
测序结果利用生物信息学方法进行分析利用使用实验室自建脚本，将测序结果fasta文件转换为fastq文件，再使用bwa samse与原始序列对比，最后使用igv进行可视化，再人工挑选出符合要求的序列。igv可视化如图3、4所示。
[0092]
实施例9
[0093]
用同源重组的方法获得突变文库后，采用96孔板高通量筛选的方式得到5株酶活有所提升的菌株，摇瓶复筛最终得到一株比野生型酶活提升2.3倍的菌株，命名为lac123。测序表明菌株lac123的碱基与野生型相比有5个碱基发生了突变，碱基突变位点为：1521位的碱基为同义突变gaa-gag，1493位的碱基突变gcc-ggc，1483位的碱基突变auc-cuc，1477位的碱基突变aac-cac，1475位的碱基突变gtc-ggc，相应的氨基酸突变位点为：v490g、n491h、i493l和a496g，其位于漆酶球形三维结构表面loop区，即分别为：490位的缬氨酸突变为甘氨酸，491位的天冬酰胺突变为组氨酸，493位的异亮氨酸突变为亮氨酸，496位的丙氨酸突变为甘氨酸，lac123的氨基酸序列如seq id no：3所示，lac23与lac1序列对比如图5所示。
[0094]
利用swiss-model分子模拟软件同源建模分析漆酶的三维结构并下载pdb文件。用pymol软件并标注突变位点，根据预测的结构信息获得漆酶的三维结构模型，如图6所示。
[0095]
这些结果初步表明通过本实验技术构建随机突变文库可以筛选得到氨基酸突变体来提高酶活力。
[0096]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
