一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法。
背景技术：2.自1978年日本mitsubishi公司首次报导阿加曲班的抗凝血活性以来，众多科研工作者对其化学合成、生物活性以及临床应用进行了深入的研究。阿加曲班于1990年首次在日本上市，2000年经美国fda批准上市，2002年在我国上市。阿加曲班为左旋精氨酸的哌啶羧酸衍生物，具有高选择性，能可逆性直接抑制凝血酶的活性，迅速和循环中游离的血凝块中的凝血酶结合，产生抗凝作用；还能用于与肝素引起血小板减少有关的血栓形成。
3.(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯是合成阿加曲班的重要起始物料，因此，其质量控制对合成阿加曲班的有很大影响。(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯还存在其他三个手性异构体，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯、(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯和(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯，上述异构体均有可能成为合成阿加曲班时的杂质，且目前并没有相关文献报道上述异构体的检测方法，因此，亟需研发一种可以对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的质量进行有效控制的检测方法，进而保证对阿加曲班质量的效控制，以完善行业标准。
技术实现要素：4.鉴于此，本发明提供一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，专属性强、准确度高，并具有优异的线性关系，能够满足(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯中其他三个手性异构体的检测要求。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
7.步骤一、配制对照品溶液和供试品溶液：
8.对照品溶液的配制：取(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品，用溶剂配成对照品溶液；
9.供试品溶液的配制：取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯样品，用溶剂配制成供试品溶液；
10.步骤二、采用气相色谱对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测，所述气相色谱的色谱条件为：
11.采用以14％氰丙基苯基-86％二甲基聚硅烷中加入30％七-(2,3-二-o-甲基-6-o-叔丁基二甲基硅基)-β-环糊精为固定液的毛细管柱；进样口温度为215℃～225℃；程序升温为：起始温度为78℃～82℃，以9℃/min～11℃/min的速率升温至115℃～125℃，维持
10min～20min，再以9℃/min～11℃/min的速率升温至195℃～205℃，维持1min～10min；采用氢火焰离子化检测器，所述检测器温度为245℃～255℃。
12.相对于现有技术，本技术提供的(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，具有以下优势：
13.本技术提供的(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，实现了对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体的定量和定性分析，该方法专属性强，线性关系良好，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.99，并具有优异的准确度、灵敏度和重复性，满足(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体的检测要求，实现了对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯质量的有效控制；此外，该检测方法还能够快速、准确地对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯原料药中其他三个手性异构体进行检测，整个操作过程可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。
14.可选的，所述程序升温为：起始温度为80℃，以10℃/min的速率升温至120℃，维持15min，再以10℃/min的速率升温至200℃，维持5min。
15.升温程序是影响气相色谱柱性能的重要因素，初始温度、升温速率以及最终温度决定着各组分的洗脱能力，因此本技术优选上述初始温度、升温速率和最终温度，能够将(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体进行快速分离，且各组分还具有优异的分离度。
16.可选的，所述进样口温度为220℃。
17.可选的，所述检测器温度为250℃。
18.优选的进样口温度和检测器温度有利于将(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯中存在的异构体从主成分中分离出来，且保证峰型较好，分离度较高。
19.可选的，载气为氮气，分流比为5～20:1。
20.可选的，所述分流比为10:1。
21.优选的分流比使得色谱峰的峰形较好，避免峰变形拖尾等情况的发生。
22.可选的，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，进样体积为1μl。
23.进一步可选的，流速为1ml/min。
24.可选的，所述毛细管柱的型号为cyclosil-b。
25.可选的，所述毛细管柱的规格为30m
×
0.32mm
×
0.25μm。
26.不同的色谱柱对化合物的保留性能差别较大，因此本技术采用型号为cyclosil-b，规格为30m
×
0.32mm
×
0.25μm的毛细管柱，能够实现目标物的快速有效的分离，且峰形较好。
27.可选的，所述溶剂为无水乙醇。
28.优选的溶剂对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体的检测无干扰，保证检测结果的准确性。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附
图。
30.图1是本发明实施例1提供的空白溶液的气相色谱图；
31.图2是本发明实施例1提供的对照品溶液的气相色谱图；
32.图3是本发明实施例1提供的供试品溶液的气相色谱图；
33.图4是本发明实施例1提供的加标供试品溶液的气相色谱图；
34.图5是本发明对比例1提供的对照品溶液的气相色谱图；
35.图6是本发明对比例2提供的对照品溶液的气相色谱图；
36.图7是本发明对比例3提供的对照品溶液的气相色谱图。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
38.实施例1
39.本发明实施例提供一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
40.步骤一、配制空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液：
41.上述空白溶液：以无水乙醇作为空白溶液；
42.对照品溶液的配制：取(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，精密称定，用无水乙醇配成对照品溶液，其中，对照品溶液中(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为50μg/ml，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为20μg/ml，(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为20μg/ml；
43.供试品溶液的配制：取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯样品20mg，精密称定，置20ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；
44.加标供试品溶液的配制：取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯、(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，精密称定，用无水乙醇配制成加标供试品溶液，其中，(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为1000μg/ml，(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为50μg/ml，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为20μg/ml，(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的浓度为20μg/ml。
45.步骤二、采用气相色谱对所述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液进行检测，记录谱图，结果如图1～图4所示，其中，所述气相色谱的色谱条件为：
46.采用以14％氰丙基苯基-86％二甲基聚硅烷中加入30％七-(2,3-二-o-甲基-6-o-叔丁基二甲基硅基)-β-环糊精为固定液的毛细管柱，型号为cyclosil-b，规格为30m
×
0.32mm
×
0.25μm；进样口温度为220℃；程序升温为：起始温度为80℃，以10℃/min的速率升温至120℃，维持15min，再以10℃/min的速率升温至200℃，维持5min；采用氢火焰离子化检测器，所述检测器温度为250℃，载气为氮气，流速为1ml/min，分流比为10:1，进样体积为1μl。
47.从图1～图4中可以看出，无水乙醇溶剂对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体的检测无干扰，保证检测结果的准确性。
48.从图2中可以看出，在保留时间17.363min处出现了(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间19.274min处出现了(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间19.593min处出现了(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，且各组分分离度良好。
49.从图3中可以看出，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯未检出，在保留时间16.293min处出现了(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间17.362min处出现了(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间19.595min处出现了(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，且各组分分离度良好。
50.从图4中可以看出，在保留时间16.289min处出现了(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间17.357min处出现了(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间19.276min处出现了(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，在保留时间19.594min处出现了(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰，且各组分分离度良好。
51.上述各组分的分离度检测结果如下表1所示，从表1中可以看出，各成分间分离度良好，由此说明本技术提供的(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法专属性良好。
52.表1分离度检测结果
53.成分分离度(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯—(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯4.911(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯8.824(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯1.564
54.实施例2检测限和定量限
55.检测限：将实施例1制备的对照品溶液采用无水乙醇逐级定量稀释，然后采用气相色谱进行检测，气相色谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，结果见表2。
56.定量限：将实施例1制备的对照品溶液采用无水乙醇逐级定量稀释，然后采用气相色谱进行检测，气相色谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，按信噪比不低于10:1作为定量限，结果见表2。
57.表2
58.[0059][0060]
将定量限溶液重复测定6次，分别记录其峰面积，结果如下表3所示，从表3中可以看出，峰面积的rsd最大为6.49％，由此说明本技术提供的检测方法，定量限重复性良好。
[0061]
表3定量限重复性检测结果
[0062]
成分123456rsd％(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯2570215723282326216723036.49(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯2486237924582454230524162.73(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯2814286728302983270828173.15(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯2323220422272156206621823.86
[0063]
实施例3线性关系
[0064]
分别取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯、(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，用无水乙醇溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用气相色谱进行检测，气相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表4。从表4中可以看出，(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯在2.38μg/ml～28.57μg/ml的浓度范围内线性关系良好，(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯在2.38μg/ml～142.92μg/ml的浓度范围内线性关系良好，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯在2.14μg/ml～64.11μg/ml的浓度范围内线性关系良好，(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯在2.01μg/ml～60.17μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0065]
表4线性试验结果
[0066][0067]
实施例4回收率
[0068]
分别取(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，精密称定，用无水乙醇定量稀释制成每1ml中约含(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯500μg、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯200μg、(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯200μg的溶液，作为对照品贮备溶液。
[0069]
取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯样品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，平行制备9份，再分别精密加入适量对照品贮备溶液使(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯浓度分别为低、中、高三个水平，用无水乙醇定容至刻度，每个浓度平行3份，作为回收率供试品溶液，采用气相色谱进行检测，气相色谱条件具体如实施例1，结果如表5所示。
[0070]
表5回收率试验结果
[0071]
[0072][0073]
从表5中可以看出，各成分的回收率均在85％～120％质检，rsd最大值为6.94％，由此说明，本技术提供的检测方法准确度良好。
[0074]
实施例5重复性
[0075]
取同一批样品，按照实施例1中供试品溶液的配制方法制备6份供试品溶液，采用气相色谱进行检测，气相色谱的具体条件如实施例1所述，结果如表6所示。从表6中可以看出，6份供试品溶液的检测结果基本一致，表明本技术提供的检测方法重复性良好。
[0076]
表6重复性试验结果
[0077][0078][0079]
实施例6溶液稳定性
[0080]
取实施例1制备的供试品溶液，分别放置0h、2h、4h后，采用气相色谱进行检测，气相色谱的具体条件如实施例1所述，记录其峰面积，计算其rsd(％)，试验结果如下表7所示。
从表7中可以看出，供试品溶液室温放置4h后，(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的含量呈增长趋势，由此可知，供试品溶液建议临用新制。
[0081]
表7溶液稳定性试验结果
[0082][0083]
实施例7耐用性
[0084]
配制加标供试品溶液，具体制备方法如实施例1所述，不再赘述。
[0085]
将上述配制的加标供试品溶液采用气相色谱进行检测，并记录其分离度。
[0086]
初始温度微调，初始温度分别调整为78℃和82℃，其余检测条件与实施例1一致，记录其分离度，结果如表8所示。
[0087]
表8不同初始温度的分离度
[0088][0089][0090]
升温速率微调，将程序升温中的第二步的升温速率分别调整为9℃/min和11℃/min，其余检测条件与实施例1一致，记录其分离度，结果如表9所示。
[0091]
表9不同升温速率的分离度
[0092][0093]
进样口温度微调，将进口温度分别调整为215℃和225℃，其余检测条件与实施例1一致，记录其分离度，结果如表10所示。
[0094]
表10不同进样口温度的分离度
[0095][0096]
检测器温度微调，将检测器温度分别调整为245℃和255℃，其余检测条件与实施例1一致，记录其分离度，结果如表11所示。
[0097]
表11不同检测器温度的分离度
[0098][0099]
从表8～表11中可以看出，微调色谱条件对(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体的检测无影响，各成分分离度均符合要求，说明本发明提供的检测方法耐用性良好。
[0100]
为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。
[0101]
对比例1
[0102]
本对比例提供一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0103]
步骤一、配制定位溶液：
[0104]
分别取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，精密称定，分别用无水乙醇溶解并配制成浓度为0.2mg/ml的单个标准溶液。
[0105]
步骤二、采用气相色谱对上述4个单个标准溶液进行检测，记录谱图，结果如图5所示，其中，所述气相色谱的色谱条件为：
[0106]
采2,3-二-o-甲基-6-叔丁基甲硅烷基改性的β环糊精为固定液的毛细管柱，型号为b-da，规格为30m
×
0.25mm
×
0.12μm；其余检测条件与实施例1一致，不再赘述。
[0107]
从图5中可以看出，(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯、(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的色谱峰均完全重合，由此说明，对比例1提供的检测方法并不能将(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体进行分离。
[0108]
对比例2
[0109]
本对比例提供一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0110]
步骤一、配制对照品溶液：
[0111]
对照品溶液的配制：分别取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，精密称定，用无水乙醇配成对照品溶液，其中，对照品溶液中每种组分的浓度均为20μg/ml。
[0112]
步骤二、采用气相色谱对所述对照品溶液进行检测，记录谱图，结果如图6所示，其中，所述气相色谱的色谱条件为：
[0113]
程序升温为：起始温度为40℃，维持5min，以10℃/min的速率升温至180℃，维持30min；其余检测条件与实施例1相同，不再赘述。
[0114]
从图6中可以看出，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的分离度仅为0.785，即这两个组分没有实现分离，由此可知，对对比例2提供的检测方法并不能将(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体进行分离。
[0115]
对比例3
[0116]
本对比例提供一种(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯异构体的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0117]
步骤一、配制对照品溶液：
[0118]
对照品溶液的配制：分别取(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2s,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品、(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯对照品适量，精密称定，用无水乙醇配成对照品溶液，其中，对照品溶液中每种组分的浓度均为20μg/ml。
[0119]
步骤二、采用气相色谱对所述对照品溶液进行检测，记录谱图，结果如图7所示，其中，所述气相色谱的色谱条件为：
[0120]
程序升温为：起始温度为50℃，以5℃/min的速率升温至120℃，维持15min，再以5℃/min的速率升温至200℃，维持5min；其余检测条件与实施例1相同，不再赘述。
[0121]
从图7中可以看出，(2r,4s)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯和(2s,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的分离度仅为1.153，即这两个组分没有实现分离，由此可知，对对比例3提供的检测方法并不能将(2r,4r)-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯及其三个手性异构体进行分离。
[0122]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
