改善的凝血组合物的制作方法

改善的凝血组合物1.本发明是申请日为2015年10月23日、申请号为201580057842.3、发明名称为“改善的凝血组合物”的分案申请。
技术领域：
：2.本发明涉及用于生产用于分析物测试的高质量血清样品的改善的凝血组合物。特别地，本发明涉及凝血酶原激活剂连同稳定剂如胶体一起的应用，用于生产用于分析物测试的高质量血清样品，如用于病理学测试和其它生物测定。本发明还涉及用于制备凝血组合物、管、试剂盒的相关方法以及诊断、预后(prognosis)和监测对治疗的反应性的方法。3.相关申请的引证4.不适用。5.关于联邦资助的研究的声明6.不适用。
背景技术：
：：7.通常通过允许血液样品凝固然后离心样品来生产血清，以从血清分离血块，包括细胞。塑料管(代替玻璃)现在通常被使用并要求前凝血剂，还称为凝血激活剂，以增强凝血过程。前凝血剂使用内在或外在途径来实现血块形成。8.通过内在途径的血块形成是表面依赖性的，由此较大密度的激活表面位点会增强凝血时间。通常，硅质物质如玻璃、二氧化硅、高岭土、膨润土和硅藻土用于塑料管以加速血块形成，其是通过内在途径来实现接触激活。然而，通过内在途径的凝血是相对缓慢的，通常需要30至60分钟。9.通过外在途径的凝血激活涉及通过添加外在于血液并以浓度依赖性方式涉及生化反应的物质所引发的凝固。通过外在途径进行操作的凝血激活剂包括鞣花酸、凝血酶、蛇毒液成分和促凝血酶原激酶。虽然这些凝血激活剂在10至20分钟内产生快速凝血，但形成的血块经常是胶质的并且不容易从血清分离。10.对于分析物测试，血清通常优先于血浆，除非需要紧急结果，在这种情况下，对于血清管的凝血时间被认为太长。即使借助于现有前凝血剂，在大多数商业管中，由制造商推荐的最低要求的凝血时间对于来自正常患者的血液样品是30分钟，以及对于来自采用抗凝血治疗剂如肝素的患者的样品则更长(通常60分钟或更长时间)。对于来自紧急情况(应急部门、重症监护室、手术室等)的样品来自导管实验室的样品，时间太，因而血浆，其可以产生得更快，通常优先于血清。11.通过在含有抗凝剂的管中收集血液，接着在收集之后可以立即进行的离心以分离细胞来形成血浆，因而获得用于分析的血浆。在这些管中，肝素锂是最常用的抗凝剂。柠檬酸盐、氟化钠/草酸钾和edta是其它抗凝剂，其用于一些管以产生用于少量的其它分析物的估计的血浆。在制备血清样品中的凝固过程消耗纤维蛋白原并在血纤维蛋白的网络内截留血小板和其它细胞。在离心之后，通过在收集装置中的血清分离器，或通过将血清等分到辅助容器来从血块分离血清，以防止与细胞的接触。这种分离允许样品长时间保持稳定。如果不立即分析样品，或如果需要再分析或附加分析，则这种稳定性是特别重要的。12.对于一些血清样品，在推荐的等待时间之后，凝固仍然是不完整的。在进行抗凝血治疗的患者中或在收集自抗凝滴管或插管的样品中，在样品中不完全凝血或潜伏凝血的问题是特别普遍的。为了凝固，这样的血液可能需要比制造商建议的等待时间更长的时间，或实际上在标准血清管(例如，来自被完全肝素化的心脏手术患者的血液)中可能永远不会完全凝固。13.如果在凝血完成以前离心血清样品，则随着剩余的纤维蛋白原被转换为血纤维蛋白，在血清中可以继续凝血，从而导致血块、微小凝块或血纤维蛋白串的形成能够，其引起分析仪或分析物特有的问题。由于缺乏在血液收集之后肝素锂管的及时反转，在样品制备期间在血浆管中还可能发生微小凝块和纤维蛋白原串的形成。虽然肝素会防止血块形成，但在接触之后它不能崩解血块。因此，血块将保持在管中，而不管与肝素的进一步接触。同样在其他抗凝管(例如edta)中，也可能发生凝血。在血小板聚集期间，由于来自血小板的α颗粒的血小板因子4(pl4)的刺激，肝素锂血浆管还可以允许不溶性血纤维蛋白的形成，从而中和肝素。14.另外，其他患者因素如疾病状态和用药都可以减小肝素活性的功效并导致增加的血纤维蛋白形成。随着时间的推移，主要是由于pl4活性，在储存的肝素锂血液样品中肝素活性会降低。当血浆储存在低温下时，会增强不溶性血纤维蛋白的形成。15.即使最小的血块也能够产生临床上显着性误差和/或引起自动分析仪阻塞。确实，随着时间的推移，随着在新的自动化分析仪中的使用量正在不断减少加上越来越多的用抗凝剂的患者，这个问题变得越来越普遍。分析仪的阻塞意味着实验室工作流程被中断，并且分析仪受制于停机时间并要求清洗以及可能需要受影响部件的更换。因此，为了准确性，必须通过眼睛或使用自动检测系统(如果可用来确保它们没有血纤维蛋白丝条或血块)来手动检查样品。如果存在不溶物的丝条或血块，则样品需要子采样到新容器并在测试分析之前再离心。呈现反复潜伏凝血的样品可能需要转移到肝素锂管以停止正在进行的凝血。这些操作需要额外的时间。此外，并不总是检测到血纤维蛋白丝条或血块(例如它们甚至可能发生在分析仪采样之后)，以及相应的采样误差可能导致基于不准确的结果来作出患者护理决策。16.在血浆管中获得的样品，具体地肝素锂血浆，还可能被细胞污染。当离心时，肝素锂凝胶管在血浆的底部的凝胶的顶部上总是会出现小“血沉棕黄层样层”。此层含有血纤维蛋白、细胞和细胞基质。在离心期间，快速凝胶运动会在血浆中留下一些细胞。在离心期间，快速凝胶和血细胞运动会引起凝胶在细胞和血浆之间形成阻挡层并在血浆中留下一些细胞。如果混合血浆样品(例如在子采样或处理期间)，它会变得混浊，这是由于含细胞的材料和血纤维蛋白的悬浮，其会降低样品完整性。此外，血小板聚集体可以形成，其还可以含有血纤维蛋白和/或白细胞。这些聚集体可以足够大到肉眼可见以及已被称为“白色颗粒物”，这是由于它们的典型的白色，并对以上讨论的不完全凝血提出类似的问题。因此在样品中细胞的存在可能影响分析物浓度。可以通过细胞活性来减少某些分析物(例如葡萄糖)以及可以通过渗漏或细胞分解来增加其它分析物(例如乳酸脱氢酶、钾或磷酸盐)。17.虽然在血清或血浆管中测得的分析物的浓度一般没有区别，但存在一些例外。使用肝素的血浆管不适用于肝素分析或基于细胞的测定。肝素锂血浆管不适用于锂分析。对于附加测试或重新测试，血浆可能是不可靠的，这是由于在2-8℃下的长期储存之后细胞的存在和不溶性血纤维蛋白形成。此外，一些血清或血浆管可能产生分析物水平的不准确的结果，这是由于在管内与前凝血剂或抗凝剂的相互作用。18.还是可取的是，减少需要测试的样品量，特别地在危重患者、接受输血的患者、以及婴儿中，以减少从患者采集的血液的容积。因此最佳的是，利用在单采血管中采取的样品，能够运行所有必要的测试。为了实现此目标，已经使用非常小的样品容积(例如2μl)开发了测试方法，以致通常一个血清或血浆管用于至少21项测试，但可以用于50-60或甚至70-80项测试，其取决于每个测试所需要的样品的体积。然而，在其中对测量在血清或血浆管中特定分析物的准确性存在怀疑的情况下，可能需要采用血清管和血浆管来自患者，并且这样做挫败了减少取自患者的血液体积的目标。19.已经开发了和凝血管一样快的含凝血酶管。凝血酶拥有前凝血剂和蛋白水解活性，并且已知凝血酶对于在纤维蛋白原、活化蛋白c(apc)和因子va中的切割键具有高特异性。然而，已经发现，含凝血酶管不能与所有血液样品一起使用。已知，凝血酶被在肝素化血液样品中存在的肝素-抗凝血酶iii复合物快速和完全抑制。例如，据报道，在含有高剂量的肝素的凝血患者样品中bdrst管是无效的(参见，例如，dimeskietal.,2010)。20.产生自使用用于自血液制备血清和血浆的当前方法的问题表明，需要改善以从更广泛的血液样品一般地实现及时、可靠的分析结果。21.响应此需求，以前在国际专利申请号pct/au2011/001221，公布为wo2012/037609(其全部内容通过引用并入本文)中表明，使用分离自蛇毒液的凝血酶原激活剂能够凝血血液样品以产生用于分析物测试程序的高质量血清。22.现在已经证明，当连同一种或多种另外的试剂如胶体一起配制为凝血组合物时，分离自蛇毒液的凝血酶原激活剂的使用会显着增加凝血组合物的稳定性。在先前将损害这种组合物的功效条件下，这种增加的稳定性是显着的，这是由于制造、杀菌、运输和储存凝血组合物的能力(例如，以收集管的形式)，而没有凝血活性的显着损失。例如，在涉及照射的杀菌、高温储存和长时间存储之后，本发明的组合物是稳定的。技术实现要素：23.在本发明的第一方面中，提供了用于制备血清样品的凝血组合物，其中凝血组合物包含凝血酶原激活剂和稳定剂。在一些实施方式中，稳定剂可以是胶体。24.在本发明的第二方面中，提供了用于制备第一方面的凝血组合物的方法，其中上述方法包括提供凝血酶原激活剂和稳定剂。在一些实施方式中，稳定剂可以是胶体。25.在本发明的第三方面中，提供了用于制备血清样品的试剂盒，其中试剂盒包括凝血酶原激活剂和稳定剂。在一些实施方式中，稳定剂可以是胶体。26.在本发明的第四方面中，提供了容器，其包含用于制备血清样品的凝血组合物，其中凝血组合物包含凝血酶原激活剂和稳定剂。在一些实施方式中，稳定剂可以是胶体。在特定实施方式中，容器是采血管，凝血酶原激活剂是ospa或ecarin以及胶体是佳乐施(血定安，gelofusine)或牛血清白蛋白。27.在本发明的第五方面中，提供了用于制备血清样品的方法，其中上述方法包括在足以引起血液样品的凝血的条件下使血液样品接触第一方面的凝血组合物一段时间，以及可选地从凝血细胞分离血清，由此制备血清样品。凝血细胞可以包括红细胞、白细胞、血小板和细胞基质。28.在本发明的第六方面中，提供了通过第五方面的方法所产生的血清样品。29.在本发明的第七方面中，提供了用于诊断受试者的疾病或病症的方法，其中上述方法包括提供来自受试者的血液样品，从血液样品制备血清样品(根据本发明的第五方面)，以及针对血清样品中分析物的存在或不存在，或针对血清样品中分析物的指示水平或浓度，测试血清样品，其中分析物的存在、不存在或指示水平或浓度指示受试者的疾病或病症。30.在本发明的第八方面中，提供了用于为受试者提供预后的方法，其中上述方法包括提供来自受试者的血液样品，根据本发明的第五方面从血液样品制备血清样品，以及，针对血清样品中分析物的存在或不存在，或针对血清样品中分析物的指示水平或浓度，测试血清样品，其中分析物的存在、不存在或指示水平或浓度为受试者指示了预后。31.在本发明的第九方面中，提供了用于监测受试者对治疗的反应性的方法，其中上述方法包括提供来自受试者的血液样品，根据本发明的第五方面，从血液样品制备血清样品，以及针对血清样品中分析物的存在或不存在，或针对血清样品中分析物的指示水平或浓度，测试血清样品，其中分析物的存在、不存在或指示水平或浓度指示受试者对治疗的反应性。32.定义33.除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。34.冠词“一个”和“一种”在本文所用用指冠词的的语法对象的一个或多于一个(即至少一个)。以举例的方式，“元素”是指一种元素或一种以上的元素。[0035]“约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，相对于参比数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，其变化多达15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。[0036]当应用于参比或全长多核苷酸或多肽序列时，术语“生物活性片段”是指这样的片段，其具有参比序列的活性的至少约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。包括在本发明的范围内的是这样的生物活性片段，其包括长度为至少约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000个核苷酸或残基，其包括或编码参比多核苷酸或多肽的活性。代表性的生物活性片段一般参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶相互作用(例如，相互作用可以是短暂的并且形成或破裂共价键)。全长多肽的生物活性片段包括这样的肽，其可以包含充分类似于或源自(假定的)全长多肽的氨基酸序列的氨基酸序列。通常，生物活性片段包含具有全长多肽的至少一种活性的域或基序。适当地，生物活性片段具有从其所衍生的全长多肽的活性的不小于约1％、10％、25％或50％。[0037]“编码序列”是指任何核酸序列，其有助于对基因的多肽产物的编码。相比之下，术语“非编码序列”是指任何核酸序列，其无助于对基因的多肽产物的编码。[0038]在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”、“包括”、“含有”将被理解为暗示，包容陈述的步骤或元件或步骤或元件的组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件的组。因此，术语“包含”等的使用表示，列出的要素是必需的或强制性的，但其它要素是可选的并且可能存在或可能不存在。“由...组成”是指，包括并限于在词组“由...组成”之后的无论什么。因此，词组“由...组成”表示，列出的要素是必需的或强制性的，以及没有其它要素可以存在。“基本上由...组成”是指，包括在上述词组之后列出的任何要素，并限于其它要素，其不干扰或有助于在本公开内容中对于列出的要素指定的活性或作用。因此，词组“基本上由...组成”表示，列出的要素是必需的或强制性的，但其它要素是可选的并且可能存在或可能不存在，其取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。[0039]术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“a-g-t”互补于序列“t-c-a”。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则仅匹配一些核酸碱基。或，在核酸之间可以存在“完全”或“总”互补性。在核酸链之间的互补性程度对在核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。[0040]“对应于”或“相应于”是指(a)多核苷酸，具有核苷酸序列，其基本上相同或互补于参比多核苷酸序列的全部或一部分或编码氨基酸序列，其相同于在肽或蛋白质中的氨基酸序列；或(b)肽或多肽，具有氨基酸序列，其基本上相同于在参比肽或蛋白质中的氨基酸序列。[0041]术语“可衍生的”包括，并且可以与之互换使用，术语“可获得的”和“可分离的”。从特定源或过程“可衍生的”、“可获得的”或“可分离的”本发明的组合物或其它主题不仅包括衍生、获得或分离自上述源或过程的组合物或其它物质，而且包括无论如何来源或生产的相同的组合物或物质，例如，通过重组dna技术或其它遗传工程方法。[0042]如在本文中所使用的，术语“检测分析物”意味着确定在样品中一种或多种分析物的存在、不存在、量、水平或浓度。[0043]“基因”是指遗传单位，其占据在染色体上的特异基因座并由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(即，内含子、5'和3'非翻译序列)组成。[0044]“同系物”是指核酸或氨基酸的百分比数，其是相同的或构成保守取代。可以使用序列比较程序如gap(devereuxetal.,1984)，其通过引用并入本文，来确定同源性。以这种方式，通过将间隙插入序列对比，可以比较与本文引用的那些序列类似或基本不同长度的序列，例如，通过由gap使用的比较算法来确定这样的间隙。[0045]术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明的任何重组载或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单宿主细胞的子代，以及子代可能不一定完全相同(在形态上或在总dna补体方面)于最初亲代细胞，其是由于自然、偶然、或故意的突变和/或变化。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。[0046]“杂交”在本文中用来表示互补核苷酸序列的配对以产生dna-dna杂交体或dna-rna杂交体。互补碱基序列是通过碱基配对规则相关的那些序列。在dna中，a配对与t以及c配对与g。在rna中，u配对与a以及c配对与g。在这方面，如在本文中所使用的，术语“匹配”和“错配”是指在互补核酸链中配对核苷酸的杂交潜力。匹配核苷酸有效地杂交，如上文提到的经典a-t和g-c碱基对。错配是并不有效地杂交的核苷酸的其它组合。[0047]“分离的”是指这样的材料，其实质上或基本上不含在其天然状态下通常伴随它的成分。例如，如在本文中所使用的，“分离的多核苷酸”是指这样的多核苷酸，其已纯化自在自然发生的状态下旁侧它的序列，例如，已从通常与片段相邻的序列除去的dna片段。可替换地，如在本文中所使用的，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子自其天然细胞环境、和自与细胞的其它组分的缔合的体外分离和/或纯化，即，它与体内物质不相关。[0048]术语“源自”和“可衍生的”包括，以及可以互换使用，术语“获得的”、“可获得的”、“分离的”和“可分离的”。从特定源或过程，“源自”、“可衍生的”、“获得的”、“可获得的”、“分离的”或“可分离的”本发明的组合物或其它物质不仅包括如此衍生、获得或分离自上述源或过程的组合物或其它物质，而且包括无论如何来源或生产的相同的组合物或物质。例如，衍生或可源自蛇毒液的凝血酶原激活剂可以不仅包括分离自蛇毒液的凝血酶原激活剂，而且包括通过重组dna技术表达自载体或其它表达系统的同样的凝血酶原激活剂。[0049]如在本文中所使用的，术语“寡核苷酸”是指由通过磷酸二酯键(或其相关结构变体或合成类似物)连接的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或它们的相关结构变体或合成类似物)组成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指核苷酸聚合物，其中核苷酸残基和在它们之间的键是天然存在的，但应当理解的是，上述术语在其范围内还包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(pna)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、2-o-甲基核糖核酸等。分子的精确尺寸可以变化，其取决于特定的应用。寡核苷酸通常具有相当短的长度，通常约10至30个核苷酸残基，但上述术语可以指任何长度的分子，虽然术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大寡核苷酸。[0050]如在本文中所使用的，术语“可操作地连接的”意味着在启动子的调控下放置结构基因，然后其控制基因的转录以及可选的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选将基因序列或启动子定位在离基因转录起始位点一定距离处，其大致相同于在上述基因序列或启动子和在其自然环境下它控制的基因之间的距离；即，基因序列或启动子从其衍生的基因。如本领域中已知的，在此距离内可以容纳一些变化，而不损失功能。类似地，调节序列元件相对于待置于其控制之下的异源基因的优选定位是由上述元件在其自然环境中的定位来限定；即，从其所衍生的基因。[0051]术语“患者”、“受试者”和“个体”可互换使用并且是指人或其他哺乳动物的患者、受试者和个体以及包括任何一种，对其期望利用本发明来检测分析物水平或诊断疾病或病症的存在、不存在或严重性。然而，应当理解的是，“患者”并不意味着，症状是存在的。属于本发明的范围内的合适的哺乳动物包括但不限于灵长类动物(例如人类、黑猩猩)、家畜动物(例如羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如猫、狗)以及捕获的野生动物(例如狐狸、鹿、野狗)。[0052]如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指mrna、rna、crna、cdna或dna。上述术语通常是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型的核苷酸的修饰形式。上述术语包括dna的单链和双链形式。[0053]术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指多核苷酸，相对于参比多核苷酸序列或多核苷酸，在下文中定义的严格条件下其杂交与参比序列，其显示基本序列同一性。这些术语还包括多核苷酸，通过至少一个核苷酸的添加、缺失或取代，其区别于参比多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括这样的多核苷酸，其中一个或多个核苷酸已被添加或删除，或替换为不同的核苷酸。在这方面，在本领域中很好理解的是，可以对参比多核苷酸进行某些改变，其包括突变、添加、缺失和取代，由此改变的多核苷酸保留参比多核苷酸的生物功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括自然发生的等位基因变体。[0054]在本文中“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换用来指氨基酸残基的聚合物以及指变体和其合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非自然发生的氨基酸，如相应的自然发生的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。[0055]术语“多肽变体”是指这样的多肽，通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代，其区别于参比多肽。在某些实施方式中，通过一个或多个取代，其可以是保守或非保守的，多肽变体区别于参比多肽。在某些实施方式中，多肽变体包含保守取代以及，在这方面，在本领域中很好理解的是，可以将一些氨基酸改变为其它氨基酸，其具有广泛相似的性能而没有改变多肽的活性特性。多肽变体还包括这样的多肽，其中一个或多个氨基酸已被添加或删除，或替换为不同的氨基酸残基。[0056]“引物”是指寡核苷酸，当配对与dna的链时，在适宜的聚合剂的存在下，其能够超始引物延伸产物的合成。引物优选是单链，以获得最大扩增效率，但可以可替换地是双链。引物必须足够长以在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的长度取决于许多因素，包括应用、待使用的温度、模板反应条件、其他试剂、以及引物源。例如，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15至35或更多个核苷酸残基，虽然它可以含有较少核苷酸残基。引物可以是大多核苷酸，如约200个核苷酸残基至几千碱基或更多。可以选择引物以“基本上”互补于在被设计来与其杂交的模板上的序列并作为用于引发合成的位点。“基本上互补的”是指，引物是充分互补的以杂交与靶多核苷酸。优选地，引物不含有与被设计来与其杂交的模板的错配，但这不是必要的。例如，可以将非互补的核苷酸残基连接于引物的5'端，其中引物序列的剩余部分互补于模板。可替换地，可以将非互补的核苷酸残基或一段非互补的核苷酸残基散布进入引物，条件是，引物序列与与其杂交的模板的序列具有足够的互补性并从而形成模板，用于合成引物的延伸产物。[0057]“探针”是指分子，其结合于特异性序列或亚序列或另一种分子的其它部分。除非另有说明，术语“探针”通常是指多核苷酸探针，其结合于另一种多核苷酸，通常被称为“靶多核苷酸”，虽然互补碱基配对探针可以结合缺乏与探针的全序列互补性的靶多核苷酸，其取决于杂交条件的严格性。可以直接或间接标记探针。[0058]术语“重组体”，当例如参照细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，表示已通过异源核酸或蛋白质的引入或通过天然核酸或蛋白质的改变加以修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体被，或表示细胞源自如此修饰的细胞。因此，“重组”细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因或表达否则异常表达的、低表达或根本不表达的天然基因。术语“重组核酸”是指一般通过核酸的操作最初在体外形成的核酸，例如，利用聚合酶和内切核酸酶，并以自release7.0,geneticscomputergroup,575sciencedrivemadison,wl,usa)或通过检查来进行用于对比比较窗口的序列的最佳序列对比以及通过任何选择的各种方法来产生最好的序列对比(即，导致在比较窗口上最高百分比同源性)。还可以参考blast程序系列，如例如由altschuletal.,1997披露的。序列分析的详细讨论可以见ausubel等人的单元19.3，“currentprotocolsinmolecularbiology”.johnwiley&sonsinc,1994-1998,chapter15。[0064]如在本文中所使用的，词组“稳定剂”包括任何分子，其能够有助于包含凝血酶原激活剂的凝血组合物的稳定性，如通过保存、增加、延长或以其他方式增强凝血组合物凝固血液的能力(相对于给定的时间单位)。这样的稳定可能因此导致凝血组合物，其能够以比在没有稳定剂的情况下为凝固血液将需要的时间更少的时间来凝固血液。连同稳定剂一起，凝血组合物为凝固血液所需要的时间可以少于在没有稳定剂的情况下为凝固血液所需要的时间，这是由于一系列因素，包括但不限于通过稳定剂来保存、增加、延长或以其他方式增强凝血组合物的凝血活性，特别是在这样的情况下，其中凝血组合物的凝血活性否则会受到损害，例如，由于凝血组合物暴露于各种环境条件，如在制造凝血组合物的过程中，包括暴露于热和灭菌辐射，以及凝血组合物的储存时间和储存条件，包括温度和湿度，以及此外凝血组合物的运输条件，包括温度、湿度和大气压。[0065]如在本文中所使用的，“严格性”是指在杂交和洗涤程序期间的温度和离子强度条件、以及某些有机溶剂的存在或不存在。严格性越高，则在洗涤之后，在固定化靶核苷酸序列和保持杂交于靶的标记探针多核苷酸序列之间的互补性程度就越高。术语“高严格性”是指温度和离子条件，在其下仅具有高频率的互补碱基的核苷酸序列将杂交。需要的严格性是核苷酸序列依赖性的并取决于在杂交期间存在的各种组分。通常，对于特定序列，在确定的离子强度和ph下，选择严格条件为低于热熔点(tm)约10至20℃。tm是温度(在确定的离子强度和ph下)，其下50％的靶序列杂交于互补探针。[0066]术语“转化”意味着，通过外来或内源性核酸的引入，生物体的基因型的改变，例如细菌、酵母、哺乳动物、禽类、爬行动物、鱼或植物。[0067]“载体”是指多核苷酸分子，优选dna分子，其源自例如多核苷酸可以插入或克隆到其中的质粒、噬菌体、酵母或病毒。载体优选含有一个或多个独特的限制位点并且可以能够在限定的宿主细胞中自生复制，包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织，或整合于限定宿主的基因组，以致克隆序列是可重复的。因此，载体可以是自主复制载体，即，存在为染色体外实体的载体，其复制是独立于染色体复制，例如，线性或闭合圆形质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何方式。可替换地，载体可以是一种载体，当被引入宿主细胞时，其被整合到基因组并和它已经被整合到其中的染色体一起被复制。载体系统可以包含单载体或质粒、两种或更多种载体或质粒，其一起包含待引入宿主细胞的基因组的总dna，或转座子。载体的选择将通常取决于载体与载体将被引入其中的宿主细胞的相容性。在目前的情况下，载体优选是病毒或病毒衍生的载体，其在动物以及优选哺乳动物细胞中是可操作地起作用的。这样的载体可以源自痘病毒、腺病毒或酵母。载体还可以包括选择标记如抗生素抗性基因，其可以用于适宜的转化体的选择。这样的抗性基因的实例是本领域技术人员已知的并且包括nptll基因，其赋予对抗生素卡那霉素和g418的抗性，以及hph基因，其赋予对抗生素潮霉素b的抗性。[0068]术语“野生型”和“自然发生的”可互换用来指基因或基因产物，当分离自自然发生的来源时，其具有基因或基因产物的特性。野生型基因或基因产物(例如，多肽)是这样的基因或基因产物，其在群体中是最常见的，因而被任意指定为基因的“正常”或“野生型”形成。[0069]在本说明书中对任何现有技术的参考不是，并且不应当被视为承认或任何形成的建议：现有技术形成本领域技术人员的公知常识的一部分。[0070]所有出版物、专利、专利申请和在本说明书中详述的其它材料的全部内容通过引用并入本文。[0071]序列表的简要描述[0072]seqidno:1是来自锯鳞蝰的ecarin的多肽序列。[0073]seqidno:2是来自粗鳞矛头蝮毒液的basparin的部分多肽序列。[0074]seqidno:3是来自锯鳞蝰毒液的carinactivase-1的部分多肽序列(如在yamada,d.,etal.,(1996)中所述的加以制备)-62kda亚基。[0075]seqidno:4是来自echismultisquamatus毒液的多活化酶的部分多肽序列(如在yamada,d.,etal.,(1997)中所述的加以制备)。[0076]seqidno:5是来自东部拟眼镜蛇的编码ptpa(或pseutarinc)的因子v样组分的核苷酸序列。[0077]seqidno:6是来自东部拟眼镜蛇的编码ptpa(或pseutarinc)的因子v样组分的核苷酸序列。[0078]seqidno:7是来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子v样组分的多肽序列。[0079]seqidno:8是来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子v样组分的多肽序列。[0080]seqidno:9是来自太攀蛇的编码ospa(或oscutarinc)的因子v样组分的核苷酸序列。[0081]seqidno:10是来自太攀蛇scutellatus的编码ospa(或oscutarinc)的因子v样组分的核苷酸序列。[0082]seqidno:11是来自太攀蛇scutellatus的ospa(或oscutarinc)的因子v样组分的多肽序列。[0083]seqidno:12是来自太攀蛇的ospa(或oscutarinc)的因子v样组分的多肽序列。[0084]seqidno:13是来自太攀蛇的ospa(或oscutarinc)的因子v样组分的多肽序列。[0085]seqidno:14是核苷酸序列，其编码来自内陆太攀蛇的omicarinc的因子v样组分。[0086]seqidno:15是核苷酸序列，其编码来自智人的因子v。[0087]seqidno:16是来自智人的因子v的多肽序列。[0088]seqidno:17是核苷酸序列，其编码来自博金牛的因子v。[0089]seqidno:18是来自博金牛的因子v的多肽序列。[0090]seqidno:19是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0091]seqidno:20是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0092]seqidno:21是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0093]seqidno:22是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇textilis的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0094]seqidno:23是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇textilis的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0095]seqidno:24是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0096]seqidno:25是核苷酸序列，其编码来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0097]seqidno:26是来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分的多肽序列。[0098]seqidno:27是来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分的多肽序列。[0099]seqidno:28是来自东部拟眼镜蛇textilis的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分的多肽序列。[0100]seqidno:29是多肽序列，用于来自东部拟眼镜蛇textilis的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0101]seqidno:30是多肽序列，用于来自东部拟眼镜蛇的ptpa(或pseutarinc)的因子x样组分。[0102]seqidno:31是核苷酸序列，其编码来自太攀蛇的ospa(或oscutarinc)的因子x样组分。[0103]seqidno:32是多肽序列，用于来自太攀蛇的ospa(或oscutarinc)的因子x样组分。[0104]seqidno:33是核苷酸序列，其编码来自内陆太攀蛇的omicarinc的因子x样组分。[0105]seqidno:34是多肽序列，用于来自内陆太攀蛇的omicarinc的因子x样组分。[0106]seqidno:35是核苷酸序列，其编码来自澳洲黑蛇的porpharind的因子x样组分。[0107]seqidno:36是多肽序列，用于来自澳洲黑蛇的porpharind的因子x样组分。[0108]seqidno:37是核苷酸序列，其编码来自黄环盔头蛇的hopsarind的因子x样组分。[0109]seqidno:38是多肽序列，用于来自黄环盔头蛇的hopsarind的因子x样组分。[0110]seqidno:39是核苷酸序列，其编码来自虎蛇的notecarind的因子x样组分。[0111]seqidno:40是多肽序列，用于来自虎蛇的notecarind的因子x样组分。[0112]seqidno:41是核苷酸序列，其编码来自澳东蛇的trocarind的因子x样组分。[0113]seqidno:42是多肽序列，用于来自澳东蛇的trocarind的因子x样组分。[0114]seqidno:43是核苷酸序列，其编码来自黑鞭蛇的凝血酶原激活剂的因子x样组分。[0115]seqidno:44是多肽序列，用于来自黑鞭蛇的凝血酶原激活剂的因子x样组分。[0116]seqidno:45是核苷酸序列，其编码来自黑鞭蛇的凝血酶原激活剂的因子x样组分。[0117]seqidno:46是多肽序列，用于来自黑鞭蛇的凝血酶原激活剂的因子x样组分。[0118]seqidno:47是核苷酸序列，其编码来自智人的因子x。[0119]seqidno:48是多肽序列，用于来自智人的因子x。[0120]seqidno:49是核苷酸序列，其编码来自博金牛的因子x。[0121]seqidno:50是多肽序列，用于来自博金牛的因子x。[0122]seqidno:51是部分多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的carinactivase-1(如在yamada,d.,etal.,(1996)中所述的加以制备)-17kda亚基。[0123]seqidno:52是部分多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的carinactivase-1(如在yamada,d.,etal.,(1996)中所述的加以制备)-14kda亚基。[0124]seqidno:53是多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的野生型ecarin的未切割形成。[0125]seqidno:54是多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的ecarin，其中已除去信号肽以及在前肽和成熟域之间的界面处已插入tev蛋白酶位点enlyfqs。[0126]seqidno:55是多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的野生型ecarin的成熟形成。[0127]seqidno:56是多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的ecarin的突变形成，其中已除去信号肽以及在前肽和成熟域之间的界面处已插入tev蛋白酶位点enlyfqs，并且已引入p396s突变。[0128]seqidno:57是多肽序列，用于来自锯鳞蝰毒液的p396s突变型ecarin的成熟形成。附图说明[0129]现将仅以举例的方式并参照以下图来描述本发明。[0130]图1示出sds-page凝胶模式：rfv(泳道2)，通过不同的凝胶分离的5个ospa样品(泳道3、4、5、6和7)以及纯化的fxa(泳道8)。标记是在泳道1中。[0131]图2示出重新钙化的全血的凝血的血栓弹性痕迹，其中通过十个ospa制剂的每个制剂的31ng等分试样。在左边的10个重叠痕迹(快速凝血)表示10个制剂，而标记+ca痕迹则表示仅通过钙的凝血的重复。[0132]图3示出1.05克太攀蛇毒液的色谱法，其中利用superdextm200(凝胶柱：5cm直径，95cm长)(2012年4月17日)。[0133]图4示出在superdex树脂上纯化的浓缩的ospa级分的全血凝血活性曲线。[0134]图5示出示意图，其表示在全血的凝血期间，来自(来自haemostasis分析仪5000系列手册)的图形。[0135]图6示出发展曲线：利用汇集的ospa(17/4/12)进行的s-2222测定(a)和标准曲线(b)。[0136]图7示出，相比与干燥器干燥的ospa的全血凝血活性，新鲜稀释的ospa的全血凝血活性。d0数据是对于加入采血管的ospa的新鲜稀释的液体样品；d1数据是对于在真空干燥器中在采血管中在室温下干燥过夜的样品。[0137]图8示出在含有新鲜稀释的ospa的采血管中以及在类似的管中，其中利用genevac已干燥ospa，的全血凝血时间。[0138]图9示出干燥ospa在佳乐施中在室温下211天的全血凝血时间的稳定性。左手系列：对照，使用在缓冲液ph7.4中的1μg新鲜稀释的ospa；中间系列：测试样品，其中在佳乐施(20μl)的存在下干燥1μgospa；右手系列：没有ospa的再钙化血液样品的凝血时间。[0139]图10示出使用来自图9的数据的线图。a：从零到211天的所有点；b：从零到65天的点。[0140]图11.在采血管中在在室温下存储长达195天之后，通过ospa的再钙化柠檬酸盐化(recalcifiedcitrated)全血的凝血的凝血时间(重复平均值)。左手系列：对照，使用在0.1m乙酸铵缓冲液ph6.8中的1g新鲜稀释的ospa；中间系列：测试样品，其中在0.5％w/v牛血清白蛋白和0.5％w/v葡聚糖的存在下干燥1μgospa；右手系列：没有ospa的再钙化血液样品的凝血时间。[0141]图12示出新鲜对照和ospa/bsa/葡聚糖管的凝血时间的线图。数据来自图11。[0142]图13示出在50c下温育之后再钙化柠檬酸盐化血液的以秒为单位的凝血时间。对于样品的标识代码：‘b’＝bd管；‘7’＝ph7.4；‘f’＝新鲜稀释的ospa，不干燥的；‘dr’＝干燥并保持在室温下；‘d50’＝干燥并保持在50c下；‘0、1、2或5’＝0、1、2或5gospa。垂直条表示存储零、一和七天。[0143]图14.在50℃下温育之后，再钙化柠檬酸盐化全血的以秒为单位的凝血时间。对于样品的标识代码：‘b’＝bd管；‘6’＝ph6.0；‘f’＝新鲜稀释的ospa，不干燥的；‘dr’＝干燥并保持在室温下；‘d50’＝干燥并保持在50℃下；‘0、1、2或5’＝0、1、2或5μgospa。垂直条表示存储零、一和七天。[0144]图15示出在50℃下温育之后，再钙化柠檬酸盐化血液的以秒为单位的凝血时间。对于样品的标识代码：‘g’＝greiner管；‘7’＝ph7.4；‘f’＝新鲜稀释的ospa，不干燥的；‘dr’＝干燥并保持在室温下；‘d50’＝干燥并保持在50℃下；‘0、1’＝0或1μgospa。垂直条表示分别存储零、1、3、7、14和30天。[0145]图16示出在50℃下温育之后，再钙化柠檬酸盐化血液的以秒为单位的凝血时间。对于样品的标识代码：‘g’＝greiner管；‘6’＝ph6.0；‘f’＝新鲜稀释的ospa，不干燥的；‘dr’＝干燥并保持在室温下；‘d50’＝干燥并保持在50℃下；‘0或1’＝0或1μgospa。垂直条表示分别存储零、1、3、7、14和30天。[0146]图17示出来自图15的数据的线图。[0147]图18示出来自图16的数据的线图。[0148]图19a示出在全血凝血测定中对于如上所列的管以及对于新鲜对照和没有ospa的对照的凝血时间。用15kgyγ辐射来处理辐射管。每个条表示两个估计量的平均值。[0149]图19b示出在全血凝血测定中对于如上所列的管以及对于新鲜对照和没有ospa的对照的凝血时间。用15kgyγ辐射来处理辐射管。每个条表示两个估计量的平均值(bd和gbo是两种不同的纯血液收集塑料管的代码)。除了对照以外，用溶解在佳乐施中的海藻糖来配制所有管。[0150]图19c示出对于如上所列的管以及对于新鲜对照和没有ospa的对照的凝血时间。用15kgyγ辐射来处理辐射管。每个条表示两个估计量的平均值(bd和gbo是两种不同的纯血液收集塑料管的代码)。除了对照以外，用溶解在佳乐施中的海藻糖来配制所有管。[0151]图20示出在全血中对于含有ecarin的管以及对于新鲜对照和没有ospa的对照的凝血时间。用25kgyγ辐射来处理辐射管并存储在室温下212天。除了对照以外，用佳乐施来配制所有管。图21示出在凝血再钙化全血中在50℃下在纯血收集塑料管中并在不同的糖和其他配方中干燥ospa的活性。[0152]图22示出在凝血再钙化全血中在室温下在纯血收集塑料管中并在不同的糖和其他配方中干燥ospa的活性。[0153]图23示出在室温下在凝血再钙化全血中以及在纯血收集管中配制在佳乐施和半乳糖果糖(6和10％)中的干燥ospa的活性。[0154]图24示出在凝血再钙化全血中在室温下在纯血收集塑料管中以及在不同的糖和其他配方中干燥ecarin的活性。具体实施方式[0155]本发明人已经发现，当连同一种或多种另外的试剂如胶体一起配制时，包含凝血酶原激活剂的凝血组合物的稳定性显着增加。这种增加的稳定性是显着的，这是由于制造、杀菌、运输和储存凝血组合物(例如，以收集管的形式)的能力，而没有在先前将损害这种组合物的功效条件下凝血活性的显着损失。例如，在涉及辐射的杀菌、在高温下存储以及长时间存储之后，本发明的组合物是稳定的。用来确定ospa的有效剂量以用于凝血管喷雾干燥程序的剂量反应和范围研究旨在实现在大约5分钟内全血的凝血。清楚地表明，在4ml的非抗凝血中ospa的0.1-1.0μg的浓度将实现这一点。上述研究首先在实施例1中说明，使用凝胶过滤色谱法，高度纯化的太攀蛇毒液凝血酶原激活剂(ospa)，c组凝血酶原激活剂，可以纯化自粗盾尖吻蛇(os)毒液，例如，在superdex200柱上，可以通过在再钙化柠檬酸盐化全血中的凝血、通过设计用于因子xa的检测的s-2222显色测试、或通过设计用于凝血酶的测试的s-2238显色测试来确定其活性。实施例1还详述了如何利用，例如，amicon超滤装置来浓缩含有汇集的ospa的级分以及制备为50％甘油溶液，用于在-20℃下长期存储。如在实施例1中详述的，然后可以透析和冷冻干燥甘油原液。购买在实施例中使用的ecarin(提取自锯鳞蝰毒液)并如在实施例1中详述的加以测定。[0156]为了达到在实验之间的类似的结果，开发了标准化方法。实施例2详述了用凝血酶原激活剂溶液和制剂组分来制备采血管的标准化方法，其中涉及用来涂布管底部的标准表面活性剂以及标准化的管干燥方法。实施例3详述了标准照射协议才近似在商业采血管制造中发现的杀菌过程。使用如在实施例4中详述的标准方法来测试待用于评估采血管的血液样品，从而确保正常凝固参数并因而确保用于测试的适用性。使用如在实施例5中详述的标准方法来测试ospa或其它凝血酶原激活剂的凝血性能，包括血浆凝血测定、凝血的目测评估、血栓弹性描记法(teg)和生色测定。在实施例5中还包括用于产生的血清的稳定性测试和分析物测量的标准，从而完成标准测试描述。[0157]在实施例6中披露了用来改善ospa在采血管中的稳定性的制剂，其比较了使用和不使用表面活性剂和胶体，bsa，的管干燥条件。结果表明，当借助于genevac、真空干燥法加以干燥时，表面活性剂和bsa胶体的存在会产生改善的凝血活性(减少的凝固时间)。在实施例6中的数据还表明在没有表面活性剂的管中通过将0.1％bsa加入ospa会产生改善，然而借助于表面活性剂涂层的添加剂会实现最佳功效。所有后续实施例在管中使用表面活性剂涂层。实施例7继续此实验程序，其表明，当来自实施例6的制剂在25℃下存储85天时，自t0，凝血活性下降。实施例8建立在实施例6和7上，其中通过测试一系列附加剂以增强包括胶体bsa(在较高的浓度下)和葡聚糖的制剂的稳定性。结果表明，相比于单独的缓冲液，在25℃下99天，bsa(0.5％)和葡聚糖(0.5％)均增加ospa的稳定性，其中1μgospa能够在大约5分钟内凝固血液。实施例9使用胶体佳乐施(4％琥珀酰明胶)并对于1μgospa在25℃下存储211天之后实现稳定性(具有5分钟凝血时间)。还包括在含有此制剂管上使用新鲜血液的数据。佳乐施显示出比0.5％bsa或0.5％葡聚糖对稳定性具有更大的影响，但所有胶体赋予比缓冲液更大的稳定性。实施例10表明，0.5％葡聚糖和0.5％bsa的组合产生在25℃下超过195天的稳定性，以及在99天下比任何单独的胶体更大的稳定性，如在实施例8中所说明的。在实施例11中佳乐施制剂在50c下成功稳定30天，其说明，长期稳定性是可实现的。在实施例12中，用ospa管来试验如在商业管的杀菌中所使用的γ辐射，其中使用bsa/葡聚糖和佳乐施制剂以及含有佳乐施和非还原糖(海藻糖)的制剂，将所有样品暴露于15kgy剂量。结果表明，在照射之后，用bsa/葡聚糖或佳乐施配制的ospa保留在基线以上的活性，从而借助地于海藻糖的添加会增加对佳乐施的保护效应。借助于佳乐施和海藻糖制剂，成功试验了另一种凝血酶原激活剂。实施例13将配制有4％佳乐施的ecarin暴露于25kgy的γ辐射，其表明凝血活性的显著％的保留。在已被照射的在t0时的管和在室温下存储212天之后未经辐照的那些管之间，凝血活性无显着性差异。实施例14测试了在室温和50℃下用佳乐施以及一系列糖类和其它剂配制的ospa并且表明，佳乐施和海藻糖/蔗糖制剂能够提供在50℃和室温下10周之后超过12个月的可接受的凝血时间。虽然具有较为有限的稳定性数据，但半乳糖果糖显示出作为另一种稳定糖的希望。实施例15在室温下测试了用佳乐施以及一系列糖类和其它剂配制的ecarin并且表明在室温下在超过12个月之后佳乐施和海藻糖/蔗糖制剂能够提供可接受的凝血时间。实施例16说明了，对在采血管中佳乐施的存在的分析物测试没有影响。[0158]总之，实施例说明，需要用于ospa的提取过程和制剂以实现在暴露于存储时间、温度和照射的采血管对于凝血酶原激活剂如ospa或ecarin的商业上可接受的稳定性(凝血活性的保留)。在这方面，清楚地表明了胶体的稳定性增强性能，特别地，单独的佳乐施或bsa，或连同附加剂一起。[0159]凝血酶原激活剂[0160]本发明部分基于以下发现：当连同一种或多种另外的试剂如胶体一起加以配制时，会显着增加包含凝血酶原激活剂的凝血组合物的稳定性。[0161]在一些实施方式中，凝血酶原激活剂是外源性凝血酶原激活剂。如在本文中所使用的，“外源性凝血酶原激活剂”意味着这样的凝血酶原激活剂，其获自来源，上述来源不同于从其制备血清样品的血液样品。[0162]在本发明中使用的凝血酶原激活剂可以包含凝血酶原激活剂的野生型或天然存在的、重组的、突变的或遗传工程化的形式，包括获自、衍生自或可源自任何适宜的生物体的那些凝血酶原激活剂，包括蛇、人、牛和细菌凝血酶原激活剂。[0163]在一些实施方式中，本发明的凝血酶原激活剂是蛇凝血酶原激活剂。适当地，凝血酶原激活剂是蛇毒液凝血酶原激活剂。蛇毒液凝血酶原激活剂通常分为四组(a、b、c、和d)，其取决于它们的结构、功能以及对辅因子的要求。[0164]在特定实施方式中，蛇毒液凝血酶原激活剂是a组凝血酶原激活剂。a组凝血酶原激活剂是由三个域组成的金属蛋白酶：金属蛋白酶、分解素、和富含半胱氨酸的域。金属蛋白酶域含有共有序列hexxhxxgxxh，其对应于锌螯合活性位点。这些凝血酶原激活剂至少在几种毒蛇毒液中被发现，并包括来自锯鳞蝰毒液的ecarin和来自粗鳞矛头蝮毒液的basparin。[0165]在特定实施方式中，蛇毒液凝血酶原激活剂是b组凝血酶原激活剂。b组凝血酶原激活剂是由非共价保持的两个亚基组成的金属蛋白酶：金属蛋白酶和c型凝集素样二硫化物状二聚体。这些凝血酶原激活剂在几种毒蛇毒液中被发现，以及包括来自锯鳞蝰毒液的carinactivase-1和carinactivase-2以及来自echismultisquamatus毒液的多活化酶。[0166]在特定实施方式中，蛇毒液凝血酶原激活剂是c组凝血酶原激活剂。c组凝血酶原激活剂是丝氨酸蛋白酶并且类似于哺乳动物因子xa-因子va复合体。pseutarinc(或ptpa)和oscutarinc(或ospa)是分别来自东部拟眼镜蛇和太攀蛇的毒液的c组凝血酶原激活剂。omicarinc是来自内陆太攀蛇毒液的凝血酶原激活剂。[0167]在特定实施方式中，蛇毒液凝血酶原激活剂是d组凝血酶原激活剂。d组凝血酶原激活剂是丝氨酸蛋白酶并且功能上类似于哺乳动物因子xa。porpharind(来自澳洲黑蛇)、notecarind(来自虎蛇)、trocarind(来自澳东蛇)、hopsarind(来自hoplocephalusstephensi)、以及notenarind(来自半岛黑虎蛇)都是d组凝血酶原激活剂。[0168]在kini,r.m.(2005)中提供了蛇凝血酶原激活剂的述评，以及在st.pierreetal.(2005)中提供了具体来自澳大利亚的眼镜蛇的毒液的那些凝血酶原激活剂(c和d组凝血酶原激活剂)，各自的全部内容以引用方式结合于本文。上述两个述评使用蛇凝血酶原激活剂的分为a-d组的分类(如上所述)。此分类替代以前的分类系统，其中使用组i-iii(i组包括a和b组；ii组是现在的d组以及iii组是现在的c组)，以及有时另外的组iv(蛇毒液激活剂，其切割在凝血酶原中的肽键，但并不将凝血酶原转换到酶活性产物-即凝血酶或meizothrombin)和v(细菌凝血酶原激活剂)，如在早期述评文章中描述的，包括rosing,j.etal.(1991)和rosing,j.etal.(1992)，通过引用将其全部内容并入本文。关于对分类系统的变化的解释，见kini,r,m.,etal.(2001)，其全部内容以引用方式结合于本文。[0169]在具体实施方式中，蛇凝血酶原激活剂获自眼镜蛇科，其说明性实例包括物种，其来自褐眼镜蛇属、盔头蛇属、澳大利亚的一属剧毒蛇、太攀蛇属、拟蝮蛇属、拟眼镜蛇属、澳西蛇属、和澳东蛇属，包括但不限于黑鞭蛇、黄环盔头蛇、notechisaterhumphreysi、半岛黑虎蛇、notechisaterserventyi、notechisflinkders、notechishumphreysi、notechisniger、notechisoccidentalis、虎蛇、虎蛇scutatus、notechisserventyi、内陆太攀蛇、太攀蛇、澳洲黑蛇、pseudonajaaffinis、pseudonajainframaculata、西部拟眼鏡蛇、东部拟眼镜蛇、小眼澳西蛇、和澳东蛇。[0170]在具体实施方式中，蛇凝血酶原激活剂获自蝮蛇科，其说明性实例包括物种，其来自botrhops、小蝰属和竹叶青属，包括但不限于美丽矛头蝮、粗鳞矛头蝮、大具窍蝮蛇、bothropsatroxasper、bothropsbrasili、bothropscastelnaudi、bothropscolumbiensis、bothropserythromelas、丰氏矛头蝮、圣保罗矛头蝮、巴西具窍蝮蛇、bothropsneuwiedi、bothropsvenezuelensis、锯鳞蝰、彩锯鳞蝰、echismultisquamatus、和trimeresurusokinavensis。[0171]在具体实施方式中，蛇凝血酶原激活剂获自黃頜蛇科，其说明性实例包括物种，其来自多鳞蛇属、颈槽蛇属和thelotomis，包括但不限于树栖鳞蛇、虎斑颈槽蛇、克氏树蛇、和荒原藤蛇。[0172]在一些实施方式中，蛇凝血酶原激活剂是来自或获自蛇毒液。来自p.textilis蛇毒液的ptpa的纯化和表描述于masci(1986)和mascietal..(1988)，以及来自太攀蛇毒液的ospa描述于speijeretal.,(1986)，其全部内容均以引用方式结合于本文。来自锯鳞蝰毒液的ecarin的纯化和表征描述于morita,tetal.(1981)和nishida,setal.(1995)，来自锯鳞蝰毒液的carinactivase的纯化和表征描述于yamada,detal.(1996)，来自echismultisquamatus的多活化酶的纯化和表征描述于yamada,d.etal.,(1997)，以及来自虎蛇的notecarin的纯化和表征描述于tans,getal.,(1985)，各自的全部内容以引用方式结合于本文。[0173]在某些实施方式中，凝血酶原激活剂是哺乳动物凝血酶原激活剂。哺乳动物凝血酶原激活剂包括源自人血和/或组织的那些凝血酶原激活剂以及源自牛血和/或组织的那些凝血酶原激活剂或这些蛋白质的重组形式。[0174]在某些实施方式中，凝血酶原激活剂是细菌凝血酶原激活剂。细菌凝血酶原激活剂包括来自金黄色葡萄球菌、产吲哚消化球菌、产黑素拟杆菌、和绿脓假单胞菌的那些细菌凝血酶原激活剂(rosing,j.etal.(1991)。[0175]如本领域技术人员将理解的，凝血酶原激活剂可以包含一个或多个多肽，基本上由一个或多个多肽组成，或由一个或多个多肽组成。在一些实施方式中，凝血酶原激活剂包含单多肽，基本上由单多肽组成，或由单多肽组成。在其他实施方式中，凝血酶原激活剂包含一个以上的多肽，基本上由一个以上的多肽组成，或由一个以上的多肽组成，包括但不限于多肽的复合体。在凝血酶原激活剂包含一个以上的多肽，基本上由一个以上的多肽组成，或由一个以上的多肽组成的情况下，每个多肽可以是来自属于相同或不同属的生物体，和/或相同或不同的物种。[0176]在某些实施方式中，凝血酶原激活剂包含氨基酸序列，其选自在seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56和57中阐述的那些氨基酸序列，或包含由选自在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、和49中阐述的那些核苷酸序列编码的氨基酸序列。[0177]在一些实施方式中，凝血酶原激活剂是衍生或可源自蛇毒液。[0178]在一些实施方式中，凝血酶原激活剂是丝氨酸蛋白酶c组凝血酶原激活剂，其类似于哺乳动物因子xa-因子va复合体。[0179]在特定实施方式中，凝血酶原激活剂选自由pseutarinc(或ptpa)和oscutarinc(或ospa)组成的组，其分别衍生自或可源自东部拟眼镜蛇和太攀蛇的毒液。[0180]在优选实施方式中，凝血酶原激活剂是oscutarinc(或ospa)，其衍生或可源自太攀蛇的毒液。[0181]在特别优选的实施方式中，凝血酶原激活剂包含在seqidno:11、12、13或32中阐述的氨基酸序列，或包含由选自在seqidno:9、10或31中阐述的那些核苷酸序列编码的氨基酸序列。[0182]嵌合凝血酶原激活剂和融合多肽[0183]本发明还设想包含嵌合多肽的凝血酶原激活剂的使用。如在本文中所使用的，“嵌合多肽”包括包含获自第一生物体的多肽的第一多肽组分，其连接于获自第二生物体的第二多肽组分。在一些实施方式中，第一生物体和第二生物体是来自不同属。在其他实施方式中，第一生物体和第二生物体是相同属的不同物种。在某些实施方式中，凝血酶原激活剂包含嵌合多肽，其类似于因子xa-因子va复合体，其中第一多肽包含因子xa样多肽以及第二多肽包含因子va样多肽。在某些特定实施方式中，第一多肽包含氨基酸序列，其选自在seqidno:26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、和50中阐述的那些氨基酸序列，或包含由选自在seqidno:19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、和49中阐述的那些核苷酸序列编码的氨基酸序列，以及第二多肽包含氨基酸序列，其选自在seqidno:7、8、11、12、13、16、和18中阐述的那些氨基酸序列，或包含由选自在seqidno:5、6、9、10、14、15、和17中阐述的那些核苷酸序列编码的氨基酸序列。[0184]本发明还设想包含融合多肽的凝血酶原激活剂的使用。如在本文中所使用的，“融合多肽”包括第一多肽组分，其连接于第二多肽组分。第一多肽组分可能获自第一生物体以及第二多肽组分可能获自第二生物体。在一些实施方式中，第一生物体和第二生物体是来自不同属。在其他实施方式中，第一生物体和第二生物体是相同属的不同物种。融合多肽的第一多肽组分或第二多肽组分可以对应于野生型或自然发生的氨基酸序列的全部或一部分(例如，如本文所述的片段)。第二多肽组分可以融合于第一多肽组分的n端或c端。[0185]野生型或自然发生的多肽的片段[0186]凝血酶原激活剂可以包含全长野生型或自然发生的多肽的片段，其中凝血酶原激活剂呈现凝血酶原激活活性。[0187]通常，全长多肽的片段可参与相互作用，例如，分子内或分子间相互作用。这样的片段包括包含在seqidno:2、3、4、51、和52中所示的氨基酸序列的肽，以及包含充分类似于或源自(假定的)全长多肽的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，例如，在seqidno:1、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、53、54、55、56和57中所示的氨基酸序列，或由选自在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、和49中阐述的那些核苷酸序列编码的氨基酸序列，其包括比全长多肽更少的氨基酸，以及呈现上述多肽的一种活性。[0188]自然发生的凝血酶原激活剂(多肽)的变体[0189]本发明还设想包含多肽的凝血酶原激活剂，其中上述多肽是野生型或自然发生的多肽的变体。包括在本发明中的包含一种或多种变体多肽的凝血酶原激活剂是生物活性的，即，它们继续拥有凝血酶原激活活性。[0190]这样的“变体”凝血酶原激活剂包括源自天然多肽的多肽，其中，通过对天然多肽的n末端和/或c末端的一个或多个氨基酸的缺失(所谓的截短)或添加；在天然多肽的一个或多个位点处一个或多个氨基酸的缺失或添加；或在天然多肽的一个或多个位点处一个或多个氨基酸的取代，多肽源自相应的天然多肽。这些变体凝血酶原激活剂可能来自，例如，遗传多态性或人操作。[0191]变体多肽的进一步的非限制性实例包括酶原形式的全长或前体多肽或多肽的酶原形成加工形式的多肽或多肽。[0192]野生型或自然发生的多肽的变体相对于野生型或自然发生的多肽的氨基酸序列将具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列相似性或同一性，包括但不限于在seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53和55中的序列，或由在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、和49中的核苷酸序列编码的氨基酸序列，如由本文中别处描述的序列对比程序并使用默认参数所确定的。野生型或自然发生的多肽的变体，其属于变体多肽的范围内，可能不同于上述多肽，通常多达200、100、50或20个氨基酸残基，或适当地少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或甚至1个氨基酸残基。在一些实施方式中，变体多肽不同于在seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53和55中的相应的序列或由在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49中的核苷酸序列编码的氨基酸序列，至少1个但少于15、10或5个氨基酸残基。在其他实施方式中，它不同于在seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53和55中的相应的序列，或由在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49中的核苷酸序列编码的氨基酸序列，至少一个残基但小于20％、15％、10％或5％的残基。[0193]可以以各种方式来改变多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短、和插入。用于这样的操作的方法是本领域中通常熟知的。例如，多肽的氨基酸序列变体可以通过在dna中的突变加以制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是公知的。见，例如，kunkel(1985),kunkeletal.,(1987)，美国专利4,873,192,watsonetal.,(1987)和其中引用的参考文献。关于并不影响感兴趣的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以见dayhoffetal.,(1978)的模型。用于筛选通过点突变或截短所构建的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选具有所选性能的cdna文库的基因产物的方法在本领域中是已知的。这样的方法适用于快速筛选通过多肽的组合诱变所生成的基因文库。递归集合诱变(rem)，一种增强在文库中功能突变体的频率的技术，可以连同筛选测定一起用来识别多肽变体，见例如arkinetal.(1992)和delagraveetal.(1993)。保守取代，如交换一个氨基酸与具有类似性能的另一个氨基酸，可能是所期望的(如下面更详细地讨论的)。[0194]相比于亲本(例如，自然发生的或参比)氨基酸序列，变体多肽可能沿着它们的序列在各个位置处含有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一种取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。已经在本领域中定义具有相似侧链的氨基酸残基的家族，其通常可以细分如下：[0195]酸性：当肽是在生理ph下的水性介质中时，残基具有负电荷(由于在生理ph下h离子的损失)以及残基被水溶液吸引以寻求在肽(它被含有在其中)的构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。[0196]碱性：当肽是在生理ph下的水性介质中时，残基具有正电荷(由于在生理ph下或在其一个或两个ph单位内，与h离子的缔合)(例如组氨酸)以及残基被水溶液吸引以寻求在肽(它被含有在其中)的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。[0197]带电荷的：残基在生理ph下是带电荷的，因而包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。[0198]疏水性的：当肽是在水性介质中时，残基在生理ph下是不带电荷的以及残基被水溶液排斥以寻求在肽(它被含有在其中)的构象中的内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。[0199]中性/极性的：当肽是在水性介质中时，在生理ph下残基是不带电荷的，但残基没有被水溶液足够排斥，所以它会寻求在肽(它被含有在其中)的构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。[0200]此描述还将某些氨基酸表征为“小的”，这是因为它们的侧链是不足够大的，即使极性基团是缺乏的，以赋予疏水性。除脯氨酸以外，“小的”氨基酸是那些氨基酸，当至少一个极性基团是在，其具有四个碳或更少，以及当不在侧链上时，其具有三个碳或更少。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码二级氨基酸脯氨酸是特殊情况，其是由于其对肽链的二级构象的已知的影响。脯氨酸的结构不同于所有其它自然发生的氨基酸，因为其侧链结合于α-氨基的氮，以及α-碳。然而，几种氨基酸相似性矩阵(例如pam120矩阵和pam250矩阵，如例如由dayhoffetal.(1978)和由gonnetetal.(1992)所揭露的)，包括在和甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸相同组中的脯氨酸，因此，为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小”氨基酸。[0201]为分类为极性或非极性的所需要的吸引或排斥的程度是任意的，因此，本发明特别考虑的氨基酸已被分类为一种或另一种。可以在已知行为的基础上来分类没有具体命名的大多数氨基酸。[0202]氨基酸残基可以，相对于残基的侧链取代基，进一步细分为环状或非环状、以及芳族或非芳族的自解释分类，以及细分为小或大。如果它含有总共四个碳原子或更少，包括羧基碳，则残基被认为是小的，只要存在另外的极性取代基；三个或更少(要不)。小残基当然总是非芳族的。取决于它们的结构性能，氨基酸残基可能属于两个或更多类。对于自然发生的蛋白质氨基酸，根据此方案的子分类列于表1。[0203]表1：氨基酸子分类[0204]子类氨基酸酸性的天冬氨酸、谷氨酸碱性的非环状、精氨酸、赖氨酸、环状、组氨酸带电荷的天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸小的甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸极性/中性的天冬酰胺、组氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸极性/大的天冬酰胺、谷氨酰胺疏水性的酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸芳族的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸影响链取向的残基甘氨酸和脯氨酸[0205]保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，合理的是，期望，用异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸的替代、用谷氨酸对天冬氨酸的替代、用丝氨酸对苏氨酸的替代、或用结构相关的氨基酸对氨基酸的类似替代不会对造成的变体多肽的性能有很大的影响。通过测定其活性，可以容易确定是否氨基酸变化导致功能多肽。在表2中在示例性和优选取代的标题下示出保守取代。一般通过选择在它们对下述的影响中并不显著不同的取代来完成在本发明的范围内的氨基酸取代：维持(a)在取代的区域中肽骨架的结构、(b)在目标位点处分子的电荷或疏水性、或(c)侧链的体积。在引入取代之后，可以筛选变体的生物活性。[0206]表2：示例性和优选的氨基酸取代[0207][0208][0209]可替换地，基于侧链的类别，用于使得保守取代的类似的氨基酸可以分为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其均具有带电荷侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；以及第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸，如在zubay,g.(1993)中所描述的。[0210]因此，通常将在多肽中的预测的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。可替换地，可以沿着全部或部分多肽基因编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变，以及可以筛选所得突变体的亲本多肽的活性以识别保留上述活性的突变体。在编码序列的诱变之后，可以重组表达编码肽并可以确定肽的活性。“非必需”氨基酸残基是这样的残基，其可以改变自多肽的野生型序列而不消除或实质上改变其一种或多种活性。适当地，上述改变基本上不改变这些活性之一，例如，活性是野生型的至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。“必需”氨基酸残基是这样的残基，当改变自参比多肽的野生型序列时。其导致母体分子的活性的消除，以致存在小于20％的野生型活性。[0211]因此，本发明还设想自然发生的多肽序列的变体或它们的生物活性片段，其中，通过一个或多个氨基酸残基的添加、缺失、或取代，变体区别于自然发生的序列。一般，相对于亲本或参比多肽序列，如例如，在seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56和57中阐述的多肽序列，或亲本或参比多肽序列，如例如，由在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49中阐述的核苷酸序列编码的多肽序列，变体将显示至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相似性。愿望地，相对于亲本多肽序列，如例如，在seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56和57中阐述的多肽序列，或亲本多肽序列，如例如，由在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49中阐述的核苷酸序列编码的多肽序列，变体将具有至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性。此外，设想通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多氨基酸的添加、缺失。或取代而不同于天然或亲本序列但其保留亲本多肽的性能的序列。多肽还包括由多核苷酸编码的多肽，其在严格性条件下(如本文所定义的)，特别地高严格性条件，杂交于亲本编码多核苷酸序列、或其非编码链(如下所述)。在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中阐述了说明性亲本多核苷酸序列。[0212]在一些实施方式中，变体多肽不同于参比序列至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在其他实施方式中，变体多肽不同于seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56和57的相应的序列，或由seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49的核苷酸序列编码的氨基酸序列，至少1％但小于20％、15％、10％或5％的残基。(如果这种比较需要序列对比，则应对齐序列以获得最大相似性。从缺失或插入、或错配“去环”序列，被认为是不同的)。上述差异适当地是在非必要残基或保守取代处的差异或变化。[0213]可以通过筛选蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库来确定蛋白质的变体。文库或片段，例如，蛋白质编码序列的n端、c端、或内部片段可以用来生成片段的杂色群体，用于蛋白质的变体的筛选和后续选择。[0214]用于筛选通过点突变或截短所构建的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选cdna文库的具有所选性能的基因产物的方法是本领域中已知的。这样的方法适用于通过蛋白质的组合诱变所产生的基因文库的快速筛选。[0215]蛇凝血酶原激活剂ecarin的一些变体描述于美国专利号6,413,737，其全部内容以引用方式结合于本文。[0216]自然发生的凝血酶原激活剂的变体(核苷酸)[0217]本发明还设想包含多肽的凝血酶原激活剂，其中上述多肽是由编码野生型或自然发生的多核苷酸的野生型或自然发生的多核苷酸的变体编码的。[0218]相对于野生型或自然发生的多核苷酸的核苷酸序列，包括但不限于由seqidno:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56和57的序列或seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、和49的序列编码的序列，或它们的补体，野生型或自然发生的多核苷酸的变体将具有至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％(和其间的所有部分整数百分比)序列相似性或同一性，如由本文中别处描述的并使用默认参数的序列对比程序确定的。[0219]编码多肽的示例性核苷酸序列包括全长基因以及基因的全长或基本上全长核苷酸序列的部分或它们的转录物或这些转录物的dna拷贝。核苷酸序列的部分可编码多肽部分或段，其保留天然多肽的生物活性。编码多肽的生物活性片段的核苷酸序列的一部分可编码至少约20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300或400个连续氨基酸残基，或几乎达到在全长多肽中存在的氨基酸的总数。[0220]还设想核苷酸序列的变体。核酸变体可以是自然发生的，如等位基因变体(相同基因座)、同系物(不同基因座)、和直向同源物(不同的生物体)或可以是非自然发生的。可以通过使用公知的分子生物学技术，如例如，借助于聚合酶链反应(pcr)和杂交技术(如本领域中已知的)来确定自然发生的变体如这些变体。可以通过诱变技术，包括适用于多核苷酸、细胞、或生物体的那些诱变技术，来构建非自然发生的变体。[0221]变体可以包含核苷酸取代、缺失、倒置和插入。可以在编码和非编码区的任何之一或两者中发生变异。变异可以产生保守和非保守氨基酸替代(当在编码产物中比较时)。对于核苷酸序列，保守变体包括那些序列，由于遗传密码的简并性，其编码参比多肽的氨基酸序列。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，如例如，通过利用定位诱变所产生的但其仍然编码多肽的那些核苷酸序列。通常，相对于如由本文中别处描述的并使用默认参数的序列对比程序确定的特定核苷酸序列，特定核苷酸序列的变体将具有至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性。[0222]核苷酸序列可以用来从其它生物体，特别是其它蛇，分离相应的序列和等位基因。在本领域中容易获得用于核酸序列的杂交的方法。可以按照众所周知的技术并基于相对于在本文中所阐述的编码序列的它们的序列同一性，来分离来自其它生物体的编码序列。在这些技术中，全部或部分已知的编码序列用作探针，其选择性地杂交于在来自选择的生物体(例如，蛇)的克隆基因组dna片段或cdna片段(即，基因组或cdna文库)的群体中存在的其它编码序列。因此，本发明还设想这样的多核苷酸，在下面所描述的严格性条件下，其杂交于参比核苷酸序列，或杂交于它们的补体。如在本文中所使用的，术语“在低严格性、中等严格性、高严格性、或非常高严格性条件下的杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。[0223]用于进行杂交反应的指导可以见ausubeletal.,(1992),章节6.3.1-6.3.6。在上述参考文献中描述了水性和非水性方法并且可以使用任何一种。本文中提到低严格性条件包括至少约1％v/v到至少约15％v/v甲酰胺和至少约1m到至少约2m盐，用于在42℃下的杂交，以及至少约1m到至少约2m盐，用于在42℃下的洗涤。低严格性条件还可包括1％牛血清白蛋白(bsa)、1mmedta、0.5mnahpo4(ph7.2)、7％sds(用于在65℃下杂交)、以及(i)2xssc、0.1％sds；或(ii)0.5％bsa、1mmedta、40mmnahpo4(ph7.2)、5％sds，用于在室温下洗涤。低严格性条件的一种实施方式包括在6x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中在约45℃下杂交，随后在0.2xssc、0.1％sds中并至少在50℃下洗涤两次(可以增加洗涤的温度至55℃，对于低严格性条件)。中等严格性条件包括至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5m至至少约0.9m盐，用于在42℃下杂交，以及至少约0.1m至至少约0.2m盐，用于在55℃下洗涤。中等严格性条件还可包括1％牛血清白蛋白(bsa)、1mmedta、0.5mnahpo4(ph7.2)、7％sds，用于在65℃下杂交，以及(i)2xssc、0.1％sds；或(ii)0.5％bsa、1mmedta、40mmnahpo4(ph7.2)、5％sds，用于在60-65℃下洗涤。中等严格性条件的一种实施方式包括在6xssc中在约45℃下杂交，接着在0.2xssc、0.1％sds中并在60℃下一次或多次洗涤。高严格性条件包括至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和约0.01m至约0.15m盐，用于在42℃下杂交，以及约0.01m至约0.02m盐，用于在55℃下洗涤。高严格性条件还可包括1％bsa、1mmedta、0.5mnahpo4(ph7.2)、7％sds，用于在65℃下杂交，以及(i)0.2xssc、0.1％sds；或(ii)0.5％bsa、1mmedta、40mmnahpo4(ph7.2)、1％sds，用于在超过65℃的温度下洗涤。高严格性条件的一种实施方式包括在6xssc中并在约45℃下杂交，接着在0.2xssc、0.1％sds中并在65℃下一次或多次洗涤。[0224]在某些实施方式中，多肽是由多核苷酸编码，其中上述多核苷酸在低、中、高、或非常高严格性条件下杂交于所披露的核苷酸序列。非常高严格性条件的一种实施方式包括在0.5m磷酸钠、7％sds中并在65℃下杂交，接着在0.2xssc、1％sds中并在65℃下一次或多次洗涤。[0225]其它严格性条件在本领域中是公知的并且本领域技术人员将认识到，可以操纵各种因素以优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性的优化可以用来确保高度杂交。关于详细实施例，见ausubeletal.,(1992)在2.10.1至2.10.16页以及sambrook,j.etal.(2001)在1.101至1.104部分。[0226]虽然通常在约42℃至68℃的温度下进行严格洗涤，但本领域技术人员将理解，其它温度可以适合于严格条件。通常在低于用于dna-dna杂交体的形成的tm约20℃至25℃下发生最大杂交率。本领域中公知的是，tm是熔化温度，或在其下两种互补多核苷酸序列解离的温度。用于估计tm的方法在本领域中是公知的(见ausubeletal.,同上，在2.10.8页)。一般，可以通过以下公式来将dna的完美匹配的双链体的tm预测为近似值：[0227]tm＝81.5+16.6(log10m)+0.41(％g+c)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)[0228]其中：m是na+的浓度，优选在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％g+c是鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的总和，作为碱基总数的百分比，在30％至75％g+c的范围内；％甲酰胺是％甲酰胺浓度(按体积计)；长度是在dna双链体中碱基对的数量。随着随机错配的碱基对的数量每增加1％，则双链体dna的tm降低大约1℃。通常在tm下进行洗涤：对于高严格性为15℃，或对于中度严格性为30℃。[0229]在杂交程序的一个实施例中，在42℃下，在含标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺，5xssc，5xdenhardt溶液(0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)，0.1％sds以及200mg/ml变性鲑鱼精子dna)中，杂交含有固定化dna的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)过夜。然后对膜进行两个连续的中等严格性洗涤(即，2xssc，0.1％sds，在45℃下15分钟，接着2xssc，0.1％sds，在50℃下15分钟)，接着两个连续的更高严格性洗涤(即，0.2xssc，0.1％sds，在55℃下12分钟，接着0.2xssc和0.1％sds溶液，在65-68℃下12分钟。[0230]制备凝血酶原激活剂[0231]可以通过本领域技术人员已知的任何合适的程序来制备凝血酶原激活剂。例如，可以通过任何方便的方法如通过从自然发生的来源纯化或分离多肽，包括但不限于蛇毒液、血液和血液衍生产物(例如，血清)，来产生凝血酶原激活剂。可替换地，可以通过重组dna技术。或其它形式的基因工程，包括例如，利用细菌、昆虫、酵母、哺乳动物或其它表达系统，来产生在本发明中使用的凝血酶原激活剂。[0232]纯化的方法包括亲和色谱法，包括凝集素(例如麦胚凝集素)亲和色谱法、阴离子/阳离子交换色谱法或任何其它分离技术，例如，hex-his标记分离技术。可以例如通过sds-聚丙烯酰胺电泳或色析法地如通过高效液相色谱法(hplc)来确定衍生的凝血酶原激活剂的同一性和纯度。例如，pseutarinc(还缩写为ptpa)自p.textilis蛇毒液的纯化和表征描述于masci(1986)和mascietal.(1988)，以及oscutarinc(ospa)自太攀蛇毒液的纯化和表征描述于speijeretal.(1986)，两者的全部内容以引用方式结合于本文。ecarin自e.carinatus毒液的纯化描述于morita,tetal.(1981)，其全部内容也以引用方式结合于本文。[0233]可替换地，利用本领域中已知的方法，包括例如在yamanouye,n.,etal.(2007)中描述的方法，其描述了来自巴西具窍蝮蛇的毒腺的分泌细胞的原代培养，用于体外毒液生产，其全部内容以引用方式结合于本文，凝血酶原激活剂可以产生自在培养中的毒液腺细胞。[0234]可替换地，可以化学合成，例如利用溶液合成或固相合成，如例如在chapter9ofathertonandshephard(1989)以及在robergeetal.(1995)中描述的，来合成凝血酶原激活剂。[0235]可替换地，可以通过重组技术来制备凝血酶原激活剂。例如，可以通过程序来制备在本发明中使用的凝血酶原激活剂，其中上述程序包括以下步骤：(a)制备构建物，包含多核苷酸序列，其编码多肽以及其可操作地连接于调节元件；(b)将构建物引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达多肽；(d)从宿主细胞分离多肽。如果凝血酶原激活剂包含复合物或两种多肽，那么可以通过程序来制备凝血酶原激活剂，其中上述程序包括以下步骤：(a)制备构建物，包含多核苷酸序列，其编码第一多肽以及其可操作地连接于调节元件；(b)将构建物引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达第一多肽；(d)从宿主细胞分离多肽；重复步骤(a)至(d)，用于获得第二多肽；以及连接第一多肽和第二多肽。以上程序同样适用于制备凝血酶原激活剂，其是野生型凝血酶原激活剂的片段、变体、突变形式或嵌合形式。在说明性实例中，编码多肽的核苷酸序列编码在seqidno:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49中阐述的序列、或其变体的至少生物活性部分。[0236]可以使用标准协议，如例如描述于sambrook,j.etal.(2001)，特别地章节16和17，以及ausubeletal.(1992)，特别地章节10和16，来方便制备重组凝血酶原激活剂。例如，蛇因子v和蛇因子x的重组生产，其可以用来产生c组和d组凝血酶原激活剂，描述于filippovic,i.etal(2005)和bos,m.h.a.etal(2009)，其各自以全文并入本文。用于ecarin以及ecarin的变体的重组生产的说明性过程提供于yonemura,h.etal.(2004)和美国专利6,413,737，各自的全部内容以引用方式结合于本文。[0237]胶体[0238]在一个方面，本发明包括凝血组合物的制剂，其包含凝血酶原激活剂和稳定剂如胶体。[0239]胶体是三种主要类型的混合物之一，而其它两种是溶液和悬浮液。胶体通常具有直径为1至1000纳米的颗粒，其中颗粒能够保持均匀分布在整个胶体中。因此，胶体涉及均匀分散在另一种物质中的一种物质。因而，胶态分散体保持分散的并且并不沉降到容器的底部。被分散的物质是在分散相中，而它被分散在其中的物质是在连续相中。[0240]如果物质在分散相中的尺寸小于1纳米，那么混合物被称为溶液。如果物质在分散相中的尺寸大于1000纳米，那么混合物被称为悬浮液。[0241]一种用于分类胶体的常见方法是基于分散物质的相以及它被分散在什么相中。使用这种分类，胶体的类型包括溶胶、乳状液、泡沫和气溶胶，其中溶胶是固体颗粒在液体中的胶态悬浮液，乳状液是分散在另一种液体中的一种液体，泡沫是其中气体颗粒被捕获在液体或固体中，以及气溶胶含有分散在气体中的液体或固体的小颗粒。当分散介质是水时，胶态体系可以称为水胶体。表3举例说明不同类型的胶体。[0242]表3：示例性胶体[0243][0244][0245]胶体常用于用于关键或重症监护室患者的液体复苏。在患者中的液体容量缺乏可能是的过多的体液丢失、液体摄入量不足或上述两种的组合的结果，包括例如失血、呕吐、腹泻和脱水。在循环性休克的治疗中，胶体最常用作血浆增量剂。胶体具有大分子，其不容易穿过毛细管壁并被保留在血管中。因而，当严重出血发生时，可以恢复血管容积，可以稳定循环血流动力学以及可以维持组织灌注。胶体的常见实例包括血浆替代品和其由改性流体明胶组成，以及其促进渗透性利尿。这些胶体具有几个小时的半衰期，提供长期容积替代以及通常与它们通常在容积基础上所替换的血液是等膨胀压的。在液体复苏中使用的胶体的其它类型包括葡聚糖类胶体、淀粉类胶体如和以及白蛋白类胶体如人白蛋白。聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和其它合成聚合物也被分类为胶体。[0246]明胶类胶体已被用作血浆替代品近100年。它们是最有用的容积替代品，具有大约80％的容积效应。然而，它们具有增加的过敏反应或过敏样反应的风险。明胶类胶体是在盐水中的4％w/v琥珀酰明胶。它通常是通过牛胶原的水解和琥珀酰化加以制备，并具有40g/l明胶、154毫摩尔/l钠、120毫摩尔/l氯化物、30,000的平均mw、22,600的平均mn、7.4+/-0.3的ph、在37℃下1.9的相对粘度、ph4.5+/-0.3的等电点、453mmh2o的胶体渗透压、0℃的胶凝点、274mosm/l的摩尔渗透压浓度以及约4小时的半衰期。其它市售的明胶类胶体包括(琥珀酰明胶)和(脲连接的改性流体明胶)。[0247]淀粉类胶体包含羟乙基淀粉溶液并且自20世纪60年代中期以来已使用。市售版本如用作容积膨胀剂，通过使用高分子量羟乙基淀粉和化学取代，其有利地抵制α-淀粉酶的生物降解。其它淀粉类胶体如elo-使用较小但重度取代的羟乙基羟乙基淀粉。此外，甚至更小和更少取代的羟乙基淀粉如haes-喷他淀粉或四淀粉似乎具有改善的安全性以及实际上的100％的容积取代效应，其可以维持长达6小时。[0248]白蛋白类胶体具有若干优点，包括没有来自制造过程的疾病传播的风险，不存在容积限制，低变应原性，没有显著的肾毒性以及没有固有凝血病。然而，对于容积替代而言，白蛋白类胶体是比类晶体、淀粉类胶体和明胶类胶体显著更昂贵的。牛血清白蛋白用于实验室应用如在细胞和微生物培养中的蛋白质浓度标准和营养物并且是便宜的。[0249]除胶体之外，类晶体也可以用于液体复苏。类晶体是自由穿过毛细管壁的平衡盐溶液。它们由水和电解质组成并且被设计成保留在血管内室中比胶体更短的时间。常见实例包括正常盐水和乳酸钠制剂如hartmann和ringer-lactate溶液。类晶体可用于当患者不能喝时维持流体平衡如在手术后的时间或在突然失血之后替换血管内容积。[0250]本发明证明，当将稳定剂如胶体加入组合物时，会显着改善包含凝血酶原激活剂的凝血组合物的稳定性。在本发明的一些实施方式中，胶体选自或组成自明胶类胶体、淀粉类胶体、白蛋白类胶体或葡聚糖类胶体。[0251]在一些实施方式中，明胶类胶体选自或组成自琥珀酰明胶胶体或脲连接的改性流体明胶胶体。在特定实施方式中，琥珀酰明胶胶体选自或组成自体明胶胶体。在特定实施方式中，琥珀酰明胶胶体选自或组成自或在可供选择的具体的实施方式中，脲连接的改性流体明胶胶体是在优选实施方式中，琥珀酰明胶胶体是[0252]在一些实施方式中，白蛋白类胶体选自由通过科恩冷乙醇治疗或色谱方法所产生的人或牛白蛋白组成的组。在特定实施方式中，白蛋白类胶体是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。在优选实施方式中，白蛋白类胶体是牛血清白蛋白。[0253]在一些实施方式中，淀粉类胶体选自或组成自羟乙基淀粉类胶体、六淀粉类胶体、喷他淀粉类胶体或四淀粉类胶体。在特定实施方式中，羟乙基淀粉类胶体是在可供选择的具体的实施方式中，六淀粉类胶体是elo-在可供选择的具体的实施方式中，喷他淀粉类胶体是haes‑‑在可供选择的具体的实施方式中，四淀粉类胶体选自由式中，四淀粉类胶体选自由和组成的组。[0254]组合物[0255]本发明提供了包含凝血酶原激活剂和稳定剂如胶体的凝血组合物。[0256]在一些实施方式中，凝血酶原激活剂与胶体(w/w)的比率是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150、1:160、1:170、1:180、1:190、1:200、1:210、1:220、1:230、1:240、1:250、1:260、1:270、1:280、1:290、1:300、1:310、1:320、1:330、1:340、1:350、1:360、1:370、1380、1:390、1:400、1:410、1:420、1:430、1:440、1:450、1:460、1:470、1:480、1:490、1:500、1:510、1:520、1:530、1:540、1:550、1:560、1:570、1:580、1:590、1:600、1:610、1:620、1:630、1:640、1:650、1:660、1:670、1:680、1:690、1:700、1:710、1:720、1:730、1:740、1:750、1:760、1:770、1:780、1:790、1:800、1:810、1:820、1:830、1:840、1:850、1:860、1:870、1:880、1:890、1:900、1:910、1:920、1:930、1:940、1:950、1:960、1:970、1:980、1:990、1:1000、1:1100、1:1200、1:1300、1:1400、1:1500、1:1600、1:1700、1:1800、1:1900、1:2000、1:3000、1:400、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、或1:10000或更大，或在陈述的整数之间的任何整数或部分整数。在特定实施方式中，凝血酶原激活剂与胶体(w/w)的比率是1:100至1:800。[0257]组合物的量应足以有效凝固血液样品以及通过从凝血细胞分离清来产生血清样品。在一些实施方式中，凝血血液样品所需的时间小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟。在特定实施方式中，凝血血液样品所需的时间小于2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在优选实施方式中，凝血血液样品所需的时间小于2、3、4或5分钟。[0258]在一些实施方式中，本发明的组合物能够在存储之后在有利的快速时间内实现凝血或在小于-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-44、-45、-46、-47、-48、-49、-50、-51、-52、-53、-54、-55、-56、-57、-58、-59、-60、-61、-62、-63、-64、-65、-66、-67、-68、-69、-70、-71、-72、-73、-74、-75、-76、-77、-78、-79、-80、-81、-82、-83、-84、-85、-86、-87、-88、-89、-90、-91、-92、-93、-94、-95、-96、-97、-98或-99摄氏度或大于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99摄氏度的温度下运输。在优选实施方式中，本发明的组合物能够在存储之后在有利的快速时间内实现凝血或在室温下或在20、21、22、23、24或25摄氏度或更高的温度下运输。在另一种优选实施方式中，本发明的组合物能够在50摄氏度或更高的高温储存之后在有利的快速时间内实现凝血。[0259]在一些实施方式中，本发明的组合物能够在存储大于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000或3000或更多天、或在陈述的整数之间的任意天数之后，在有利的快速时间内实现凝血。在一些实施方式中，本发明的组合物能够在存储大于200天之后在有利的快速时间内实现凝血。[0260]在一些实施方式中，本发明的组合物能够在通过照射来杀菌组合物之后在有利的快速时间内实现凝血。在一些实施方式中，杀菌是通过电子束或环氧乙烷暴露。在特定实施方式中，辐射是γ辐射以及组合物受到的辐射量是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50kgy。在优选实施方式中，辐射是γ辐射以及组合物受到的辐射量是约15kgy至约25kgy。在最优选的实施方式中，辐射是γ辐射以及组合物受到的辐射量是约15kgy。[0261]在一些实施方式中，可以喷雾干燥组合物或以其他方式将组合物粘附于适合收集受试者的血液的容器的内表面。在其他实施方式中，可以以适于加入以前取自受试者的血液样品的分离的形式来提供组合物。在其它实施方式中，可以在以前取自受试者的血液样品加入其中的反应容器中提供组合物。在进一步的实施方式中，可以以水性形式来提供组合物，例如，以容器如对其添加血液样品的血液凝固管。[0262]在本发明的组合物中使用的凝血酶原激活剂的量将取决于各种因素，包括待测试的受试者和任何相关病症的严重性，例如，凝血酶原激活剂和/或胶体的活性，患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食，和受试者正使用的任何药物，以及在本领域中众所周知的其它相关因素，如是否受试者已经被给予抗凝剂处方如肝素或华法令。因此，通过常规实验，本领域技术人员将能够确定为凝固血液样品和提供用于分析物测试的血清样品将是必需的凝血酶原激活剂的有效量。可以确定凝血酶原激活剂的量以确保在特定患者组中适当的血液凝固，如具有正常血液以实现快速凝血的患者，或以确保来自更广泛的患者组的适当的血液凝固，包括，例如，进行抗凝剂治疗的患者。[0263]在特定实施方式中，组合物可以用作统计管的一部分，例如，用于肌钙蛋白，或连同心脏手术和/或导管插入术一起，或连同血液透析一起。在其他实施方式中，组合物可以用作标准采血管的一部分。[0264]在一些实施方式中，在本发明的组合物中使用的凝血酶原激活剂的量是0.00、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3μg的凝血酶原激活剂。在其他实施方式中，在本发明的组合物中使用的凝血酶原激活剂的量是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10μg的凝血酶原激活剂。[0265]在其他实施方式中，借助于基于肽对硝基酰苯胺底物或凝血酶底物的测定，以单位测量凝血组合物。在特定实施方式中，ospa包含0.001-0.2单位，如在标准测定中在生色底物s-2222或s2238的水解中测得的。[0266]表面活性剂也可以用作凝血组合物的一部分，以提供在血液成分和含组合物的容器(这样的采血管)的壁之间的物理屏障。表面活性剂的存在并不影响凝固机制。[0267]因此组合物还可以包含任何合适的表面活性剂如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。适宜的表面活性剂还可以包括十二烷基硫酸钠(sds)、月桂基硫酸铵、十二烷基醚硫酸钠、和肉豆蔻醇聚醚硫酸钠。表面活性剂通常用来降低非特异性吸附，并需要仔细选择和优化。表面活性剂还可以改善血流量，分配凝血激活剂，以及防止蛋白质、rbc、和血小板吸附到管壁。还可以包括悬浮剂如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料如硅质二氧化硅、以及其它成分如羊毛脂。[0268]在优选实施方式中，表面活性剂是亲水性表面活性剂。在另一种实施方式中，表面活性剂可以是疏水性表面活性剂。在降低在血液蛋白和血细胞与容器如采血管的壁之间的相互作用方面，亲水性和疏水性表面活性剂可以具有类似的有效性。在优选实施方式中，表面活性剂可以是亲水性聚硅烷聚合物，如dowcorning7-9245。[0269]组合物可以按照本领域普通技术人员已知的方法加以制备并且可以包括另外的载体、赋形剂或稀释剂。就相容与组合物的其它成分以及无害于血清样品的形成而言，载体、赋形剂和稀释剂必须是“可接受的”，其具有某些有利的特征如降低的纤维蛋白原浓度。更少的微小凝块、更少的细胞、将能够存储更长的时间(如果需要的话)以及将导致更可重复的分析物结果。这样的载体、赋形剂和稀释剂可用于进一步增强本发明的组合物的完整性和半衰期。[0270]载体如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、和聚环氧乙烷，还可以用来允许将凝血组合物加入管。这样的载体允许快速凝血激活剂悬浮液进入血液，以致，当引发凝血时，载体溶入血清和血块。pvp和水溶性表面活性剂还可以将凝血激活剂释放进入血液样品以减小对混合的需要。[0271]可接受的载体或稀释剂的进一步实例是软化或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性有机硅；矿物油如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇：低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄芪树胶或阿拉伯树胶、以及凡士林。[0272]可以包括在本发明的组合物中的另外的载体包括非还原糖如蔗糖和还原糖如半乳糖果糖。这样的载体、以及糖醇如甘露醇、木糖醇、甘油和山梨醇，也可用于包容在本发明的组合物中，因为它们可以充当抗氧化剂和潜在的稳定剂。[0273]在一些实施方式中，凝血组合物可以包含蛇毒液，包括但不限于粗蛇毒液。在一些其它实施方式中，凝血组合物可以包含通过蛇毒液的部分或全纯化所制备的凝血酶原激活剂的制剂。可以通过本领域中已知的任何合适的方法来制备这类制剂，包括色谱和凝胶过滤方法，包括在本文中和其它地方描述的那些方法。在一些其它实施方式中，凝血组合物可以包含纯化的凝血酶原激活剂或分离的凝血酶原激活剂。可以通过本领域中已知的任何合适的方法来制备纯化和分离的凝血酶原激活剂，包括在本文中和其它地方描述的那些方法。在其它实施方式中，可以重组产生凝血酶原激活剂，其中凝血酶原激活剂可源自蛇毒液。[0274]可以通过辅因子的添加来引发或借助于辅因子的添加来改善如本文所定义的组合物将凝血酶原激活到凝血酶的能力，包括但不限于钙、磷脂和多肽(包含fva活性)、以及其它凝血剂或促凝剂。在一种实施方式中，在缺乏辅因子的情况下，或其中将辅因子分开提供到凝血组合物，例如，其中将凝血组合物和辅因子分布在容器如采血管的内表面上的分开的位置，初始产生凝血组合物。在管被填充或部分填充患者的血液之后，然后辅因子接触血液并借助于凝血酶原激活剂来引发或改善凝血反应。[0275]依据刺激的血液级联，将凝血剂或促凝剂分类为固有凝血剂或外在凝血剂(见例如美国专利号6,686,204)。适宜的凝血剂包括但不限于硅藻土、无机硅酸盐的微粒或颗粒、微粒硅、玻璃微粒、鞣花酸、凝血酶、肝素酶、促凝血酶原激酶、巴曲霉、水滑石、高岭土、高岭土颗粒、凝血酶原(包括微粒化凝血酶原)、纤维蛋白原、和解聚胶原。[0276]在一些实施方式中，组合物包含可逆凝血酶原激活剂，其可能保留被附加剂的抑制直到凝血过程的激活是所期望的。这样的附加剂可能包括蛋白酶抑制剂如苯甲脒盐酸盐、氨基苯甲脒二盐酸盐、抗蛋白酶二盐酸盐、抑肽酶、egta或亮肽素半硫酸盐，所有这些都是可商购，例如，自carlrothgmbh&cokg，或自sigma-aldrichco.llc。[0277]在一些实施方式中，组合物包含凝血酶原激活剂、胶体和表面活性剂。在特定实施方式中，组合物包含凝血酶原激活剂，其源自或可源自蛇毒液、基于明胶或白蛋白的胶体和表面活性剂。在优选实施方式中，组合物包含c组凝血酶原激活剂，其源自或可衍生自蛇毒液或其重组形式、基于明胶或白蛋白的胶体和亲水性表面活性剂。在特别优选的实施方式中，组合物包含c组凝血酶原激活剂oscutarinc(ospa)，其源自或可源自太攀蛇的毒液，明胶类胶体胶类胶体其是在盐水中的4％w/v琥珀酰明胶并含有40g/l明胶、154毫摩尔/l钠、120毫摩尔/l氯化物，以及亲水性表面活性剂。[0278]容器[0279]本发明涉及用于制备适宜的血清样品的任何合适的容器。许多合适的容器在本领域中是公知的，包括在美国专利号4,227,620、美国专利号4,256,120、美国专利号6,416,717、美国专利号6,592,613、美国专利号6,686,204、美国专利号7,488,287、美国专利号7,699,828、欧洲专利号0628816中描述的那些容器，以及商业上可获得的容器包括在本说明书的实施例中使用的那些容器。[0280]在一些实施方式中，按照本发明使用的容器是管，包括玻璃或塑料管。合适的塑料包括聚氯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、和聚苯乙烯。[0281]可以排空容器并借助于适当的可穿孔的隔膜或帽来密封端部。这允许使用双头针，其中将一端插入患者的静脉以及针的另一端刺孔覆盖管的端部的隔膜或盖，以致在管中的真空通过针将血液样品引入管。[0282]容器可以是任何合适的尺寸。在一些实施方式中，容器被设计成容纳50μl至10ml的血液样品。适当地，容器被设计成容纳至少50μl、70μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、8ml、或10ml的血液样品。在特定实施方式中，容器容纳4ml血液样品，从而提供在4ml血液样品中25ng/ml至2.5μg/ml的凝血酶原激活剂的最终浓度。[0283]在一些实施方式中，容器含有凝血组合物，该组合物包含、基本上组成自。或组成自凝血酶原激活剂和附加剂如胶体。[0284]在一些实施方式中，在将血液样品加入容器以前，在容器内可以含有凝血组合物。在一些实施方式中，在将血液样品加入容器之后，可以将凝血组合物加入容器。在添加血液样品以前在容器内含有凝血组合物的情况下，可以通过本领域中已知的任何合适的方法，已将组合物加入容器。在一些实施方式中，将凝血组合物溶解于合适的溶剂，然后加入容器并干燥到容器的内表面上。溶剂可以是中性缓冲液。可以通过喷雾干燥，通过冷冻干燥，通过热干燥或通过本领域中已知的任何其他合适的方法，将在溶液中的凝血组合物干燥到容器的内表面上。在一些实施方式中，使用一股加热至60℃-70℃的温暖的空气，将凝血组合物干燥到容器如采血管的内表面上。在一些其它实施方式中，将凝血组合物溶解于合适的溶剂并加入容器而没有干燥，以致容器含有包含凝血组合物的水溶液。溶剂可以是中性缓冲液。在进一步的实施方式中，通过雾化，使凝血组合物接触容器如采血管的内表面。[0285]在一些实施方式中，用凝血组合物来涂布珠，然后将这些珠加入容器。珠可以是玻璃珠或合成树脂珠，包括聚苯乙烯和丙烯珠。珠可以具有球形形状。[0286]在一些实施方式中，珠的平均直径是0.1mm至1mm。[0287]在特定实施方式中，利用在37℃下的温和真空，例如，通过使用gene-vac机，将凝血酶原激活剂快速干燥到容器的内表面上。在特定实施方式中，通过在50℃或更高温度的热空气射流，直接将凝血酶原激活剂快速干燥进入容器如采血管。[0288]在一些实施方式中，在已发生凝血之后，容器提供血清自凝血细胞的分离。在一些实施方式中，容器包含或含有血清分离剂凝胶，其提供在凝血细胞和血清样品之间的屏障。在一些实施方式中，容器具有合适的形状和合适的材料以允许离心，从而分离或协助维持凝血细胞和血清样品的分离。在一些实施方式中，从凝血细胞除去血清样品，或从血清样品除去凝血细胞。例如，这样的实施方式是相容与市售血清分离管和血浆分离管的使用。[0289]在一些实施方式中，容器可以包含一种或多种另外的组分。除凝血组合物之外，其它组分可能包括，例如，一种或多种辅因子、一种或多种表面活性剂、和/或一种或多种凝血剂。[0290]在优选实施方式中，容器是greinerbio-onewhitetop或redtop管、或bectondickinson静脉采血管。这样的优选收集管制成自聚对苯二甲酸乙二酯并且可以根本不含添加剂，或可以涂布有表面活性剂，以及含有作为凝血激活剂的二氧化硅、凝胶分离器和涂布有有机硅的橡胶塞。[0291]血清样品[0292]如以上所讨论的，本发明的前提是部分基于以下发现：当连同附加剂如胶体一起加以配制时，凝血酶原激活剂导致凝血组合物具有增强的稳定性，从而保存凝血活性并提高用于免疫测定或分析物检测的血清样品的质量，其可以是在实验室中、在护理点或在临床或研究情况下。适用于检测分析物的血清样品是这样的血清样品，其具有合适的质量(如本文所讨论的)，和/或在合适的时间内加以制备(如本文所讨论的)。[0293]在适用于检测分析物的血清样品的制备中的一个重要因素是凝血过程从血清除去纤维蛋白原的程度。由于不完全凝血的结果，含有残留纤维蛋白原或部分降解纤维蛋白原或血纤维蛋白的血清可能导致分析精度问题，这是由于沉淀物(微小凝块或串)的形成、在血清的离心和存储之后的潜伏凝血。因此，在确保最高质量血清和准确的测试结果中，完全或基本完全凝血是关键的。[0294]因此，本发明的一些实施方式提供了在用于检测分析物的血清的制备中使用凝血组合物，该给组合物包含，基本上组成自，组成自凝血酶原激活剂和胶体，其中血清包含≤30μg/ml的纤维蛋白原或纤维蛋白原/血纤蛋白相关产物。在更具体的实施方式中，血清包含≤25μg/ml、≤20μg/ml、≤15μg/ml、≤10μg/ml、≤8μg/ml、或≤6μg/ml的纤维蛋白原或纤维蛋白原/血纤蛋白相关产物。[0295]在一些实施方式中，血清包含≤30％、≤20％、≤10％、≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1％、≤0.5％、≤0.2％、≤0.1％的纤维蛋白原或纤维蛋白原/血纤蛋白相关产物，其存在于从其产生血清的原始样品中。[0296]可以通过本领域中已知的任何合适的方法来检测纤维蛋白原和/或纤维蛋白原/血纤蛋白相关产物的水平，包括夹心免疫测定，其中利用来自mpbiomedicals的抗体和购买自nibsc,pottersbar,hertsfordshire,london,uk的标准纤维蛋白原制剂。[0297]在适用于检测分析物的血清样品的制备中的另一个重要因素是在凝血之后留在血清中的细胞或细胞碎片的活性或数目。在血清或血浆的存储和分析期间，细胞的存在可以有两种效应。首先，细胞可能裂解，从而将细胞内容物(例如钾、乳酸脱氢酶)释放进入血清或血浆。这可能导致在离心之后立即作出的测量结果和在一段时间的存储之后的测量结果之间的显着差异。其次，细胞继续具有代谢活性并可能会耗尽大量的营养素(例如葡萄糖)以及释放代谢产物(例如乳酸盐)(在存储之后)。当存储样品通常推荐的30分钟凝血时间时以及当样品来自健康参与者时，甚至可以在许多管的样品中观察到变化。因而，细胞污染程度是血清样品的重要质量标准以及使用血清而不是血浆的重要优势。[0298]因此，在一些实施方式中，在从其已制备血清样品的血液样品，血清样品包含少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％的细胞。[0299]在一些实施方式中，在24小时、12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟的时间内，血清样品包含《25％、《20％、《15％或《10％的乳酸脱氢酶活性或磷酸盐浓度的变化(通常分别以u/l和毫摩尔/l为单位测得)。在一些实施方式中，在24小时、12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟的时间内(例如，自制备血清样品的时间)，血清样品包含《5％、《4％、《3％、《2％、《1％、《0.5％、或《0.1％的葡萄糖浓度或钾浓度的变化(两者通常以毫摩尔/l为单位加以测量)。用于测量乳酸脱氢酶活性的方法在本领域中是公知的，见例如，dimeski,g.,etal.(2004)，其全部内容以引用方式结合于本文。[0300]血清样品的血红蛋白浓度还可以用来确定血清样品是否适用于检测分析物。因此，在一些实施方式中，血清样品包含《150mg/l、《100mg/l、《90mg/l、《80mg/l、《70mg/l、《60mg/l、《50mg/l、《40mg/l、《30mg/l、《20mg/l、或《10mg/l的血红蛋白浓度。[0301]作为用于测试的样品，血清通常优先于血浆，除非需要紧急结果，因而用于血清管的凝血时间被认为太长。延长的凝血时间的另一个缺点是它可能导致临床上显著的分析物浓度变化，这是由于在血液样品中的细胞活性，在白细胞增多中此问题是最明显的(dimeskiandbird2009)。[0302]因此，在一些实施方式中，本发明提供了用于产生用于检测感兴趣的分析物的血清样品的方法，该方法包括使血液样品接触凝血组合物，该组合物包含，基本上组成自，或组成自凝血酶原激活剂和胶体(如本文所定义的)，其中在自接触凝血组合物的25、20、15、10、8、6、5、4、3、2、1、或0.5分钟内制备血清样品。[0303]血液样品[0304]如本文所讨论的，期望提供凝血组合物，其适用于从大多数(如果不是所有)血液样品生产血清样品，或包含凝血组合物的容器，其将在合适的时间内，即，在一段时间内，其允许符合患者的临床需要来进行分析物测试，凝固大多数(如果不是所有)血液样品。[0305]对其测试可以是所期望的不同类型的血液样品的实例包括来自健康个体的新鲜血液、柠檬酸盐化血液、添加有edta的血液、这样的血液，其来自进行抗凝血治疗的患者如肝素、华法令、柠檬酸盐、因子xa抑制剂(例如利伐沙班)的口服抗凝剂、或直接凝血酶抑制剂(例如达比加群)类，采用抗血栓形成剂的患者，包括阿司匹林，血小板减少患者(具有低血小板计数的患者)，以及具有延长ptt的患者。[0306]在一些实施方式中，血液样品是全血样品。在一些其它实施方式中，血液样品是源自全血样品的血清样品。在这种情况下，示例性血清样品包括这样的血清样品，其中更优质的血清样品是所期望的，包括那些样品，其中，对于为适用于检测分析物的样品的血清样品来说，在血清样品中纤维蛋白原或纤维蛋白原/血纤蛋白相关产物的量和/或细胞或细胞材料的量和/或血红蛋白的量被认为太高。例如，血清样品可以呈现微小凝块或潜伏凝血。在一些其它实施方式中，血液样品是源自全血样品的血浆样品。例如，血浆样品可以呈现微小凝块或不溶性血纤维蛋白形成、或潜伏凝血。[0307]检测分析物[0308]在一些实施方式中，本发明进一步提供了检测分析物的方法，该方法包括分析通过本发明的方法所制备的血清样品中感兴趣的分析物的存在或量。[0309]在具体实施方式中，通过本发明的方法所制备的血清样品适用于一种以上的分析物测试，以致血清样品可以用来检测一种以上的分析物。如本文所讨论的，通常临床医生会希望对来自患者的血液样品进行一种以上的分析物测试，以及不常见的是，一个血清样品用于至少20项测试，或甚至更多，有时50-60或甚至70-80项测试。本领域技术人员将理解，在具体实施方式中，本发明提供了血清样品的生产，其中血清样品具有足够的容积和质量以能够对一个血清样品进行所有所期望的分析物测试。这样做的优点是，减少了取自受试者的血液的容积和为进行分析物测试所花费的时间。[0310]下面描述说明性分析物测试。可以以许多方式来进行用于进行这些分析物测试的方法并且在本领域中是公知的。[0311]肌钙蛋白：此试验测量在血清或血浆样品中肌钙蛋白t和/或肌钙蛋白i的水平，其中高水平可以指示急性心肌梗塞。[0312]钠(na+)：此试验测量在血清或血浆样品中钠的量。钠在体内的盐和水平衡中起着重要作用。低钠水平可以指示太多的水摄入、心脏衰竭、肾衰竭、或由腹泻或呕吐引起的钠自身体的损失。高钠水平可以指示过量盐摄入或摄水量不足。[0313]钾(k+)：此试验测量在血清或血浆样品中钾的量。太高的钾水平(高钾血症)可能是肾脏疾病、糖尿病、酮症酸中毒或药物的结果，其降低从身体排出的钾的量。太低的钾水平(低钾血症)可能起因于脱水，例如来自腹泻或呕吐，或出汗过多。钾的水平也可能较低，其由于采用药物的结果，其导致肾损失钾，例如利尿药。在那些患者中，其采用利尿药或心脏药物，患有高血压或肾脏疾病、临界酸中毒和碱中毒病症，以及接收肾透析或静脉治疗(通过滴注)，经常监测钾水平。[0314]氯化物(cl-)：此试验测量在血清或血浆中氯化物的量。通常测量氯化物以评估在患者中是否存在电解质不平衡。低氯化物和正常钠以及升高的碳酸氢盐可以指示呕吐或胃液的损失。[0315]碳酸氢盐(hco3-)：此试验测量在血清或血浆中二氧化碳的三种形式(碳酸氢盐、碳酸、和溶解二氧化碳)的量。在血浆中碳酸氢盐/碳酸缓冲液是最重要的：在体ph的调节方面非常有效。在确定代谢酸/碱状态中，经常进行此测试。通过肾脏来调节缓冲液浓度。响应于氯化物(呕吐)的丢失、利尿治疗、盐皮质激素过量或糖皮质激素过量(例如库欣病)，可以观察到高水平。低水平可能起因于有机酸的生产，如在糖尿病酮症酸中毒、在肾衰竭中酸的减少的排泄、碳酸氢盐的过度损失(肾病)、腹泻和毒药如甲醇滥用中看到的。[0316]葡萄糖：此试验测量在血清或血浆中葡萄糖的量。在那些患者中经常测试葡萄糖水平，其呈现高血葡萄糖(高血糖症)或低血糖症的症状，其是妊娠的，其患有糖尿病。[0317]脲：此试验测量在血清或血浆中脲的量。此测试可以帮助评估肾功能以及监测透析的有效性。[0318]肌酸酐：此试验测量在血清或血浆中肌酸酐的量。在帮助评估肾功能以及监测肾脏疾病的治疗方面，此测试是关键的。[0319]尿酸盐：此试验测量在血清或血浆中尿酸盐(或尿酸)的量。尿酸的高水平可以是痛风的征兆。在正在接受化疗或放疗的患者还监测尿酸水平以检测肿瘤溶解综合征。[0320]总蛋白质(tp)：此试验测量在血清或血浆中蛋白质的总量。虽然总蛋白质测试的结果不会指示特定疾病，但高或低蛋白质水平经常表示需要额外的测试以确定是否有问题。总蛋白测试经常用来筛查某些肝脏疾病、肾脏疾病、多发性骨髓瘤和水合状态。[0321]白蛋白(alb)：此试验测量在血清或血浆中白蛋白的量。经常测量白蛋白水平以筛查肝脏或肾脏疾病，或以评估营养状况，特别是在住院患者中。[0322]总胆红素：此试验测量在血清或血浆中胆红素的量。测量胆红素水平以筛查和监测肝脏疾病，如黄疸，或肝病，如肝硬化。还在婴儿中测量胆红素水平以帮助检测某些罕见遗传疾病以及以避免在患有黄疸的那些婴儿中的脑损伤。[0323]碱性磷酸酶(alp)：此试验测量在血清或血浆中碱性磷酸酶的量。通常进行此测试以筛查或监测肝或骨疾病.的治疗。[0324]γ-谷氨酰转移酶(ggt)：此试验测量在血清或血浆中γ-谷氨酰转移酶的量。此测试用来筛查肝病和酒精滥用。它还可以用来确定是否alp的提高水平是由于肝或骨疾病。[0325]丙氨酸氨基转移酶(alt)：此试验测量在血清或血浆中丙氨酸氨基转移酶的量。此测试用来筛查肝病。[0326]天冬氨酸氨基转移酶(ast)：此试验测量在血清或血浆中天冬氨酸氨基转移酶的量。此测试用来检测肝损伤、肌肉损伤、和其它病症，因为上述酶存在于许多器官和组织细胞中。[0327]乳酸脱氢酶(ldh)：此试验测量在血清或血浆中乳酸脱氢酶的量。此测试通常用来确定在体内组织损伤的原因和位置、组织缺血，以及用来,监测其进展。[0328]肌酸激酶(ck)：此试验测量在血清或血浆中肌酸激酶的量。在患有胸痛或肌肉痛或乏力的患者中测量肌酸激酶以确定是否他们心脏病发作以及是否在体内的其它肌肉已被损害。[0329]总钙(tca)：此试验测量在血清或血浆中钙的量。在患有肾、骨或神经疾病的患者中，或当存在显着增加或减少的钙的症状时，经常测量钙水平。[0330]磷酸盐：此试验测量在血清或血浆中磷酸盐的量。作为对异常钙水平的测试结果的后续行动，可以测量磷酸盐水平。在患有肾脏疾病、不受控制的糖尿病的患者中，或在患者正在服用钙或磷酸盐补充物的情况下。还可以测量磷酸盐水平。[0331]镁(mg2+)：此试验测量在血清或血浆中镁的量。如果患者具有镁太多或太少的症状，包括乏力、应激性、心律失常、恶心或腹泻，可以进行此测试。如果已检测出异常钙或钾水平。则还可以测量镁水平。[0332]脂酶：此试验测量在血清或血浆中脂酶的量。此测试通常用来诊断胰腺炎或其它胰腺疾病。[0333]胆固醇：此试验测量在血清或血浆中胆固醇的量。测量胆固醇水平以筛查发展心脏病的风险。[0334]甘油三酯：此试验测量在血清或血浆中甘油三酯的量。至于胆固醇水平，此测试通常用来筛查发展心脏病的风险。[0335]高密度脂蛋白(hdl)：此试验测量在血清或血浆中hdl胆固醇的量。此测试通常用来确定发展心脏病的风险。[0336]铁(fe2+)：此试验测量在血清或血浆中铁的量。测量铁以检查是否患者具有低或高铁水平。低铁水平可以引起贫血，并且通常是由于长期或重度出血、妊娠或快速生长(在儿童中)。高铁水平可以是由于遗传病症或大量输血。[0337]运铁蛋白：此试验测量在血清或血浆中运铁蛋白的量。运铁蛋白是血浆蛋白质，其通过血液将铁转动到肝、脾和骨髓。因此，测试血液运铁蛋白水平以确定贫血的原因，以检查铁代谢(例如，在铁缺乏贫血中)以及以确定血液的携铁能力。[0338]c反应蛋白(crp)：此试验测量在血清或血浆中c反应蛋白的量。此测试用来确定炎症的存在，用来确定其严重性，以及用来监测对治疗的响应。[0339]皮质醇：此试验测量在血清或血浆中皮质醇的量。测量皮质醇水平以帮助诊断库欣综合征或艾迪生病。[0340]游离甲状腺素：此试验测量在血清或血浆中游离甲状腺素的量。此测试通常用来诊断甲状腺功能减退或甲状腺机能亢进。[0341]促甲状腺激素(tsh)：此试验测量在血清或血浆中促甲状腺激素的量。此测试通常用来筛查、诊断和监测甲状腺疾病。[0342]铁蛋白：此测试用来测量在血清或血浆中的铁蛋白。低铁蛋白水平指示铁缺乏。高水平指示铁过载如在血色素沉着症中。[0343]溶血指数：溶血指数测试测量红细胞溶解的程度。溶血是在生物化学实验室中遇到的最常见的干扰。此测试主要用来体外检测溶血和用于报告某些或所有分析物的样品适用性，以及用于检测溶血性贫血(遗传性球形红细胞增多症、自发性溶血、rbc酶缺乏)。目前通过所有普通化学分析仪来估计溶血或溶血指数(在血清或血浆中自由血红蛋白的浓度)。然后上述值在确定何种分析物和在什么溶血水平下可能受到影响或未报告中用作指导(dimeskietal.2005)。[0344]黄疸指数：黄疸指数测试返回值，通过纯分光光度法，其说明在测试样品中胆红素的相对水平。在总胆红素光度估计方法的干扰的极少数情况下，它用于确定用于报告某些分析物的样品适用性以及胆红素结果的交叉检查的准确性。在检测roche总胆红素方法(sheppardetal.,2005)的癌症副蛋白干扰(沉淀和假高总胆红素)中，黄疸指数已被表明是值，其中黄疸指数一直保持不受影响。如在dimeskietal.,2008中讨论的，在高浓度(例如》200μμ/l)下，胆红素可以干扰一些肌酸酐测定。[0345]脂血症指数：脂血症指数已被用来预测由于脂血症而引起的对测定的可能的干扰(dimeski2009)。[0346]除上述分析物测试之外，还可以利用血清或血浆样品并通过不同的分析技术如免疫测定，包括竞争性、非竞争性、反向或夹心酶联免疫测定，来进行其它测定。[0347]诊断，预后和监测对治疗的反应性的方法[0348]本发明提供了用于在受试者中诊断疾病或病症的方法，其中上述方法包括提供来自受试者的血液样品，通过使血液样品接触本发明的凝血组合物从血液样品制备血清样品，以及测试血清样品：在血清样品中分析物的存在或不存在，或在血清样品中分析物的指示水平或浓度，其中分析物的存在、不存在或指示水平或浓度指示在受试者中的疾病或病症。[0349]本发明还提供了用于对受试者提供预后的方法，其中上述方法包括提供来自受试者的血液样品，通过使血液样品接触本发明的凝血组合物从血液样品制备血清样品，以及测试血清样品：在血清样品中，分析物的存在或不存在，或在血清样品中，分析物的指示水平或浓度，其中分析物的存在、不存在或指示水平或浓度指示对受试者的预后。[0350]本发明还提供了用于监测受试者对治疗的反应性的方法，其中上述方法包括提供来自受试者的血液样品，通过使血液样品接触本发明的凝血组合物从血液样品制备血清样品，以及测试血清样品：在血清样品中，分析物的存在或不存在，或在血清样品中，分析物的指示水平或浓度，其中分析物的存在、不存在或指示水平或浓度指示受试者对治疗的反应性。[0351]在一些实施方式中，本发明的方法涉及比较分析物测试的结果与参比间隔或截止限度以获得诊断。[0352]疾病或病症可以是利用血清样品容易诊断、预后或确定对治疗的反应性的任何疾病或病症，包括但不限于上文参照不同分析物测试所概述的疾病或病症。[0353]在一些实施方式中，上述方法可以包括诊断受试者未先前呈现的疾病或病症的存在或不存在。在其他实施方式中，上述方法可以包括诊断受试者已先前呈现的疾病或病症的存在、不存在或严重性。上述方法可以包括参考在较早时间获自受试者的结果。可替换地，参比结果可以是标准分析参考。[0354]在一些实施方式中，在测试设施如病理实验室中进行上述方法。在一些其它实施方式中，上述方法是“现场护理”方法。如在本文中所使用的，“现场护理方法”意味着，在患者护理的现场或附近进行上述方法。在需要快速获得结果的医院及其他环境中，现场护理方法越来越受欢迎。这经常通过使用移动式、便携式、和手持式仪器以及测试试剂盒来完成。[0355]现场护理测试的优点包括在医院的床边获得快速分析结果的能力(特别是在紧急情况下)，以及在家中、在医生手术中、在偏远地区等(例如，利用小容积的动脉、静脉或毛细血管血)获得分析结果的能力。[0356]目前市场上可用的用于现场护理方法的装置包括i-stat(abbottdiagnostics)、retro-statushiv/cd4350快速测试装置(milleniumbiotechnology,inc.)、以及triageplgf测试(alereinternational)。[0357]试剂盒[0358]本发明提供了用于制备血清样品的试剂盒，其中试剂盒包括凝血酶原激活剂和胶体。[0359]本发明的试剂盒促进本发明的方法的采用。通常，用于进行本发明的方法的试剂盒含有所有为进行上述方法所必要的试剂和方式。例如，在一种实施方式中，试剂盒可以包含本发明的凝血组合物以及可选的用来进行分析物检测的装置，如用于如本文所定义的现场护理方法的装置。[0360]通常，本文描述的试剂盒还将包含一个或多个容器。在本发明的上下文中，区室化试剂盒包括其中在单独的容器中含有化合物或组合物的任何试剂盒，以及可能包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条。这样的容器可以允许化合物或组合物从一个区室有效转移到另一个区室，同时避免样品的交叉污染，以及以定量方式将每个容器的剂和溶液从一个区室加入另一个区室。在优选实施方式中，包含试剂盒的一个或多个容器是采血管。[0361]通常，本发明的试剂盒还将包括利用试剂盒组分来进行适当方法的用法说明。[0362]本发明的方法和试剂盒同样适用于任何动物，包括人类，例如包括非人灵长类动物、马科动物、牛科动物、羊、公山羊、野兔、禽类、猫和犬科动物。因此，为了应用于不同物种，本发明的单试剂盒可能是适用的，或可替换地，可能需要不同试剂盒，例如含有专用于每个单独的物种的化合物或组合物。[0363]本发明的方法和试剂盒可应用于其中期望产生血清样品的任何情况。[0364]研究工具[0365]本发明还设想采用按照本发明产生的血清样品的研究工具的使用。这些方法通常包括提供按照上述概括地描述的方法制备的血清样品；以及在研究工具研究中采用血清样品，包括但不限于基因组学、蛋白质组学、代谢组学、系统生物学、分子成像或测定研究。[0366]适宜的研究工具在本领域中是公知的并且包括在scaros,o.etal.,2005中描述的那些研究工具，其全部内容以引用方式结合于本文。基因组学包括药物基因组学，其研究在遗传学和响应与疗法的基因表达模式之间的相关性。蛋白质组学允许分析蛋白质在系统中的丰度和分布。代谢组学、或生化分析是在系统中代谢物的研究。系统生物学将整个生物系统看着为功能单元，从而产生行为模型，其可以潜在地预测上述系统将如何响应刺激。分子成像技术具有表明体内特定分子靶的水平和上述靶的功能状态的能力，并且可以用于诊断方法。[0367]本领域技术人员将理解和领会，可以组合本文所公开的不同特点以形成特点的组合，其是在本发明的范围内。[0368]现将参照以下实施例，其仅是说明性的而非限制性的。来进一步描述本发明。[0369]实施例[0370]在凝血组合物中使用凝血酶原激活剂的需求在于，随着时间的推移以及在可变条件如暴露于热和/或灭菌辐射下，凝血酶原激活剂的活性保持稳定。例如，如果凝血酶原激活剂连同容器如采血管一起用于凝血组合物，则在纯化或重组生产之后以及在管生产以前在凝血酶原激活剂的存储期间，必须保留凝血酶原激活剂的凝血活性。[0371]此外，通常在生产线上以非常大数量来制造市售的采血管，其中产品可以是塑料管，其含有添加剂如前凝血剂、表面活性剂和成层胶。通常干燥、在真空下密封以及灭菌管的内含物。在前凝血剂是凝血酶原激活剂的情况下，在干燥、在真空下密封以及灭菌(例如，利用辐射)的过程之后，凝血酶原激活剂必须能够保留活性。通常应横跨广泛的温度来表明稳定性(如本文所公开的)。在特定实施方式中，在室温下的稳定性应允许至少6个月的保质期，优选大于12个月，以及更优选大于18个月。[0372]实施例1-凝血酶原激活剂：分离和表征[0373]在哺乳动物中，体内凝血酶原激活剂复合物通常由丝氨酸蛋白酶、因子xa、和蛋白质辅因子、因子va组成，其在钙离子的存在下复合在磷脂膜上(jacksonandsuttie,1977)。单独的因子xa可以但效率低下地激活凝血酶原。在因子va、钙离子和磷脂的存在下，会增强凝血酶原激活几个数量级。[0374]众所周知的是，许多蛇的毒液导致血液的快速凝固。在蛇毒液中凝血酶原激活剂复合物的第一份报告是来自speijeretal(1986)，其报告了来自太攀蛇(太攀蛇)毒液的凝血酶原激活剂复合物的发现，其具有至少4个多肽链，其中的两个似乎是因子va-样组分以及通过二硫键连接的两个是因子xa-样组分。[0375]在本研究中用于纯化凝血酶原激活剂的方法基本上是由mascietal1988和mascietal2000先前描述的方法。简要地说，利用单步柱色谱法过程，其涉及在适宜的凝胶过滤树脂(例如sephacryls300、superdex200)上的再溶解的毒液，以1克批量，来纯化10克毒液(购自毒液供应商ptyltd,southaustralia)。然后，在重钙化柠檬酸盐化全血和重钙化柠檬酸盐化血浆凝血测定中以及通过利用设计用于因子xa的分光光度法底物，s-2222，来确定含有级分的浓缩ospa的活性。[0376]实施例1.1-凝血酶原激活剂的纯化[0377]sephacryls-300、superdex200、toyopearlh55s和toyopearlh65sresins购买自gehealthcaresydneyandtoyo,japan。用柱缓冲液，0.05mtris-hcl，ph7.4，含有0.1mnacl和0.01％叠氮化钠，来150％稀释每种树脂的淤浆。在冷室中在4℃下，用每种树脂填充玻璃柱(5.0x95cm；或2.5x95cm)。在流率1ml/分钟下平衡柱过夜并在280nm处监测吸收率，直到稳定在零处(其间运行最少10柱容积的缓冲液)。[0378]以2x5克批，购买太攀蛇(太攀蛇，os)毒液(毒液供应商ptyltd,southaustralia)以及商业供应商，毒液供应商，证实两个5克批均来自相同批次的毒液乳品。在37℃水浴中在45ml柱缓冲液中重建大约1.0-1.5克批的os毒液，直至完全溶解。这花了大约30分钟。制备1/50稀度的os毒液溶液并a280测量，然后记录总蛋白质浓度。从上述储备溶液，将2x1.0ml等分试样，1x0.5ml，在50％甘油中以及1/50稀度，存储在-20℃下。然后将剩余的40-42ml的os毒液溶液加载到平衡的凝胶过滤柱上。在0.8-1.0ml/分钟流率下展开色谱法超过24小时。利用lkbredirac级分收集并以时基模式来收集级分，从而收集8-10ml级分。利用alex双uv(a280nm)通道监测系统和双笔记录仪，其设置为基于2.48和1.24吸收率单位的满量程，来连续监测洗脱液在280nm处的吸收率(a280)。[0379]通过重钙化柠檬酸盐化血浆凝血测定和s-2222产色水解活性测定(如下所述)，来确定含有ospa凝血活性的级分。汇集和浓缩具有高特异性凝血活性的级分(如下所述)。[0380]实施例1.2-ospa的浓缩和存储[0381]汇集来自superdex200、sephacryls300和toyopearlh55s以及toyopearlh65s层析的级分，其含有血浆凝血和s-2222水解活性(指定为“汇集的ospa级分”)，用于表征。通过测量汇集的ospa级分在280nm处的吸收率来确定蛋白质浓度以及利用对于1mg/ml溶液为1.0的吸收系数来计算以mg/ml为单位的蛋白质浓度。[0382]利用加压amicon细胞模型402并利用ym10膜(摩尔截止为10,000da)，将汇集的ospa级分浓缩至2-4mg/ml的浓度。在初始实验中，在浓缩步骤中蛋白质的损失是20-25％。在后面的实验中，在浓缩(目的在于减少起因于蛋白质结合的损失)之前，将5％甘油加入汇集的含有ospa的级分。当使用5％甘油时，在浓缩步骤中蛋白质的损失是0-5％。然后将高纯度甘油加入浓缩的ospa溶液以实现50％甘油浓度。轻轻混合ospa/甘油溶液以避免发泡直至溶液是均匀的，然后在-20℃下存储在用铝箔覆盖的深色玻璃瓶中。利用1/10稀度并测量在处280nm的吸收率来确定ospa/甘油溶液的蛋白质浓度。ospabatch17-apr-2012用于所有实验。[0383]表4示出10种不同制剂的表征数据，其表明，不同的分离方法产生功能相似的制剂，其是合适的并且均能够产生高质量血清，如可以推断自生色底物s-2222。[0384]表4.凝血酶原激活剂制剂的表征数据[0385][0386][0387]就洗脱曲线和sdspage带型而言，表4提供了关于以上描述的十个ospa制剂的定量信息。总之，(1)利用sephacryl或superdex，在ospa制剂中蛋白质的产率是126±17mg/克干毒液，(2)1克毒液的血浆凝血活性是(1.031±0.194)x106单位，(3)在4个sephacryl或superdex制剂中血浆凝血活性是526,417±44433单位，从而产生加载到柱上的毒液样品的大约52％的总血浆凝血活性的产率，以及(4)两次toyopearl65s运行产生活性的较高回收率(60％和75％)，并具有在凝血酶原激活剂级分和太攀蛇毒液素级分之间的非常少的纯化。[0388]图1示出利用来自ospa的六个制剂(包括自1989年存储的一个制剂)的样品所获得的带型。在所有情况下，在高分子量区中，存在非常一致的带型。唯一明显的差异是在toyopearl制剂中较大量的低分子量材料的存在。这一致与利用toyopearl色谱法所实现的毒液级分的差得多的分辨率。[0389]通过血栓弹性描记法研究了这十个制剂(是浓缩的ospa级分，存储在50％甘油中，源自每个制剂)中的每一个的样品的全血的凝血。痕迹示于图2以及每个痕迹的参数示于表5。[0390]表5：10个ospa制剂的血栓弹性描记数据[0391][0392]所有ospa制剂均引起快速和完整凝血，如由r、k和角度值(速度)以及ma值(凝固强度)所示。[0393]基于所取得的结果，指定为17/4/2012的ospa制剂用于所有剂量和稳定性实验。针对此制剂的superdex200色谱法洗脱曲线示于图3以及sdspage带型示于图1。此制剂的洗脱曲线和带型的比较说明，它是一种典型的制剂。如表1所示，组成此制剂的汇集的级分含有159mg，相当于151mg/克毒液。在血浆凝血测定中，比活性是3534u/mg以及回收的总活性是534,987u/克干毒液，产率为59％。这些数字是一般一致与在几个制剂中实现的平均值(如表1所示)。3534u/mg的比活性说明，1μg的ospa，如在许多剂量和稳定性实验中使用的，含有3.5血浆凝血单位。通过此制剂的全血的凝血的参数是在表5中。[0394]相对于因子xa选择性底物s-2222，毒液和17/4/2012ospa制剂的测定的结果示于表6。[0395]表6.17/4/2012ospa制剂的s-2222测定数据[0396][0397]实施例1.3-在凝胶色谱法物之后的洗脱曲线[0398]对含有大约1-1.5g太攀蛇毒液的溶液(通过溶解冷冻干燥毒液加以制备)进行凝胶过滤色谱法，具体如下：在sephacryl300上(一次)；在superdex200上(6次)，在toyopearlhw55-s上(一次)以及在toyopearlhw65-s上(两次)。图3示出太攀蛇毒液的洗脱曲线，其中利用superdextm200(凝胶柱：5cm直径，95cm长)。[0399]实施例1.4-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)[0400]制备nuviewprecastminigels(#nb10-420,4-20％)sdspage凝胶。其具有tris-甘氨酸非还原样品缓冲液(#bg-145)(nusep)，以及还原样品缓冲液，其具有5％β-巯基乙醇。在五分钟温育之后，将来自每个样品的40μl等分部分转入等效容积的还原样品缓冲液。然后在100℃下并在加热块中温育样品10分钟。在凝胶上加载每个样品的25μl的等分试样和12μl的预染色分子量标记(#sm0671pagerulerprestainedproteinladder,fermentas,hanover.md,usa)。在100v下利用mini-proteiniicellpage仪器(bio-rad)运行凝胶直至染料前沿达到凝胶的底部。用考马斯亮蓝g(#b-0770,sigma)(0.25％w/v考马斯亮蓝g、45％甲醇、10％乙酸)来染色凝胶，然后通过脱色溶液(45％甲醇、45％水和10％乙酸)来除去过量染色剂。[0401]实施例1.5-冷冻干燥为冷冻干燥粉的ospa的存储[0402]除纯化ospa在50％甘油中的存储之外，ospa可以产生为冷冻干燥蛋白质，其然后可以存储在-20c下。这可以通过转换自50％甘油ospa储备溶液或直接自直接来自柱的ospa浓缩物来实现。[0403]将30cm长度的透析管(23mm宽度，12kda截止)浸泡在含有1mmedta和0.2％叠氮化钠的蒸馏水中1-2小时。然后用蒸馏水洗涤管10次，然后每件填充在含有0.2％叠氮化钠的h2o中的80ml10％bsa并在4℃下存储在蒸馏水中8周。确保管总是被淹没。使用前，除去bsa溶液并在内部用100容积的蒸馏水洗涤管。[0404]将ospa甘油储备溶液(2.0mg/ml，在50％甘油-0.05mtrishclph7.4中)加入每个管，然后添加10％bsa(以1％的最终浓度)和10％叠氮化钠至0.2％的最终浓度，接着捆扎管。在4℃下，以250-300倍透析液容积，在0.02m羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)缓冲液ph7.4(透析缓冲液)中透析在透析管中的ospa过夜，同时连续缓慢磁力搅拌以产生10-15mm的近似最终甘油浓度。此比率确保，在含有ospa的收集管中，在血液(4ml)中甘油的最终浓度小于0.1mm。[0405]在达到平衡之后(即在4℃下24小时)，从管小心除去透析的ospa。将ospa分开并进入深色玻璃瓶，其经表面活性剂(2.41g/l)加以预处理和干燥，并具有10mg的ospa/瓶。利用在用于冷冻干燥的制剂中的干冰来壳冷冻回收的ospa/bsa悬浮液。按照实施例2，利用christ冷冻干燥机(设置为0.08毫托和-60c)，进行冷冻干燥24小时。[0406]在冷冻干燥之后，用5ml的佳乐施来重建ospa的样品瓶以产生1.0-2.0mg/ml的ospa浓度。建立未透析的ospa在0.125、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0和3.0μg下的标准浓度曲线，用于确定透析的和冷冻干燥的ospa的回收。四种不同稀度的透析的和冷冻干燥和ospa用于重新钙化的全血凝血测定。计算在两个步骤中ospa的回收，结果表明，大约100％的ospa回收自透析和冷冻干燥步骤。[0407]已成功存储冷冻干燥ospa，并在-20c下保留活性6个月。[0408]注意：在实施例中使用的ospa是来自50％甘油储备溶液。[0409]实施例1.6ecarin的表征[0410]分离自锯鳞蝰毒液的ecarin来自sigmaaldrich目录号ec0504，在45-55单位的小瓶中，作为冷冻干燥粉。通过lowry蛋白测定(bioraddc蛋白质测定目录号500-01116)，确定蛋白质含量为110-110mg/小瓶。将ecarin存储在-20c下。[0411]在ecarin凝血时间(ect)测试中来自锯鳞蝰毒液的ecarin是主要试剂，其用来监测抗凝固和凝血酶抑制。一个单位被定义为在ph8.4和37℃下为激活凝血酶原以产生一个单位的酰胺分解活性所需要的量。在ph8.4和37℃下，一个酰胺分解单位将水解1.0μmol的n-对甲苯磺酰基-gly-pro-arg-对硝基酰苯胺/分钟。利用色谱测定并按照实施例5来确定ecarin活性。[0412]实施例2-管制备[0413]在本研究中使用的管是塑料greinerwhitetop光滑管(编码#456001,greinerbio-onegmbh,austria)或塑料bectondickinsonredtop光滑管(编码#3276916,becton,dickinsonandcompany,franklinlakes,usa)。[0414]实施例6说明了，在管制剂中表面活性剂的存在是有利于来自管壁的最佳释放，因此有利于凝血酶原激活剂的活性。虽然在此实施例中，相比与没有bsa和没有表面活性剂的管，对于没有表面活性剂的管，胶体载体(在这种情况下0.1％bsa)的添加表明有利的，但在添加表面活性剂所有情况下活性是最佳的。因此，已借助于表面活性剂的添加来产生用于实施例的管。[0415]为了制备管，将20μl的表面活性剂溶液(作为液体制剂)加入管，接着涡旋10秒以确保涂布管的底部。此过程模仿了通常由管制造商采用的商业喷涂过程。然后在真空干燥器中过夜或利用genevac离心干燥器来干燥管。然后将20μl凝血酶原激活剂溶解于缓冲液或其它制剂(按照实施例1)并加入管，接着通过在0.1t真空和29-30℃下利用genevacz-22进行离心真空干燥30分钟加以干燥。然后用原盖重新加盖管并紧贴包裹以防止灰尘和水分，接着存储在室温下直到需要。[0416]可替换地，在受控环境温度下空气干燥管样品过夜而没有盖子。然后用原盖重新加盖管并紧贴包裹以防止灰尘和水分，接着存储在室温下直到需要。[0417]利用christ冷冻干燥器来进行冷冻干燥。在0.01t真空和-60℃下干燥样品1小时。然后用原盖重新加盖管并紧贴包裹以防止灰尘和水分，接着存储在室温下直到需要。[0418]实施例3-辐射[0419]进行制备管的辐射以确保完成品的无菌。可以通过暴露于γ辐射或电子束(电子束)技术来完成辐射。在本研究中，通过商业设施，其利用采用γ辐射的gammacel220系统(gc220)来进行辐射。[0420]将含有制备的凝血组合物的采血管放置在校准装备(gc220)中，然后放入gc220辐射室并经受γ辐射(钴-60)。基于在此校准装备中的已知的剂量率，然后辐射产品所期望的一段时间以确保获得所需的剂量。结果表示为靶剂量(kgv)；实际剂量(kgv)；以及辐射时间。[0421]验证测量可追溯性和不确定性，如下。在钴-60辐射场中校准剂量计，其中剂量率确定自在类似条件下进行的参比剂量计测量。参比剂量计测量结果可追溯到用于吸收剂量的澳大利亚标准物。基于在校准辐射场中确定的参比剂量率来进行此辐射。[0422]相关与参比剂量率的总体不确定性包括剂量计的批次的校准的不确定性和起因于在批次内的变差的不确定性，并且计算为2.0％。这种扩展不确定性是基于标准不确定性乘以2的覆盖因子，从而提供大约95％的置信水平。根据iso测量中不确定性表达指南来进行不确定性评估。质量管理体系符合以下许可证和标准：tgalicenceno.1182；iso9001:2008的iso13485:2003(不包括设计和开发)。质量管理体系还坚持下列标准和准则的原则：rso11137国际剂量学最佳实践(iso17025和iso/astm标准，用于辐射处理的剂量测定)。[0423]实施例4-用于评估血液样品的标准化方法[0424]收集用于所有实施例的柠檬酸盐化全血取自健康个体和正接收口服抗凝剂治疗的患者(具有书面同意)。使用的凝固参数是：凝血酶原时间(pt)、激活的部分促凝血酶原激酶时间(aptt)和血浆纤维蛋白原浓度。[0425]还用sysmexxe-5000血液学分析仪(sysmex,kobejapan)来测量血小板数。[0426]正常凝固参数是：pt:10-12秒；aptt:30-35秒；纤维蛋白原血浆浓度1.5-2.5g/l以及血小板计数150-450x109/ml血液。[0427]利用国际标准化比率(inr)来监测接收口服华法林治疗的患者。通过绘制接收抗凝治疗的患者与健康个体的pt的比率来确定inr。用于有效的华法令治疗的inr是2.0-3.0。[0428]在大约n＝50下汇集或基于个体使用来自健康个体的柠檬酸盐化全血。健康个体捐赠～500ml血液，对其检查重新钙化的全血凝血时间、pt、aptt、纤维蛋白原浓度和血小板计数。[0429]在每个实施例中测量全血再钙化时间并且数据记录每批的柠檬酸盐化全血。正常全血再钙化时间是15-20分钟。具有正常凝血分布或抗凝患者的汇集的或单个样品适用于血液凝固测试。[0430]在一些实施例中使用新鲜血液，其直接取自没有柠檬酸盐化/再钙化的志愿者的单个或多个样品。通达使用平行于待测试管的对照管，来测试样品的正常凝血分布。在一些研究中，还平行柠檬酸盐化和测试来自同样的志愿者的血液，包括包括teg测量(按照实施例5)。[0431]实施例5-凝血组合物性能评估[0432]实施例5.1-血浆凝血测定[0433]利用如由austenetal(1975)描述的hyland-clotek仪器来进行重钙化柠檬酸盐化血浆凝血测定。来自正常志愿者的新鲜汇集的柠檬酸盐化血浆用于每组实验。测定容积是250μl。将柠檬酸盐化正常人血浆(100μl)加入玻璃凝血管(1ml)，其含有100μl的0.2m羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液和0.1mnacl(ph7.4)。将样品放置在hyland-clotek血浆凝血机的37℃加热块中，并在至少1分钟之后，添加25μl的0.2mcacl2(至20mm的最终浓度)(当需要时)，紧接着20μl的含有ospa活性的溶液，在其时启动定时器。[0434]ospa的浓度，其基于蛋白质浓度和因子v-因子xa复合物的250,000的分子量，为0.01pm至1.9μμ。柠檬酸盐化血浆通常含有20mm柠檬酸盐(作为柠檬酸三钠)，以及在稀释之后，在反应混合物中柠檬酸盐浓度是8mm，从而产生在反应混合物中12mm的净钙浓度(超过柠檬酸盐的摩尔过量)。以秒为单位记录凝血时间。重复进行每个测定。[0435]图4示出标准曲线，其相对于来自april17,2012ospa级分的蛋白质的量绘制凝血时间。[0436]实施例5.2-凝血的目测评估[0437]将汇集的柠檬酸盐化正常血液，其具有pt＝10-12秒、aptt＝35-40秒、纤维蛋白原浓度＝1.5-4.0g/l以及150-400x109/ml的血小板计数，放置在在生物危害品罩中的塑料瓶中。使用含有真空干燥亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l表面活性剂，在ro水中)的greiner白顶管或bd光滑红顶管。此外，将ospa或ecarin，有或没有佳乐施(20μl)，加入管。作为湿溶液或作为genevac/真空干燥器干燥组合物，添加ospa或ecarin，对其添加50μl的1m氯化钙。然后利用gilsonp5000吸管，将3.95ml的柠檬酸盐化血液分配到管并启动定时器。立即重新盖上管，然后通过倒置来轻轻地倾斜。由两位研究者进行血液样品重复测试。不断反转含有血液的管直到观察到初始凝固块，在其时，记录时间作为“起始凝血时间”。当在倒置之后观察到固体凝块时，将时间记录为“完成凝血时间”。[0438]实施例5.3-血栓弹性描记法(teg)测定[0439]在haemostasis分析仪5000系列(haemscopecorporation,il,usa)操作手册和附带软件中提供了血栓弹性描记器(teg)的操作程序以及产生自每个测定的参数。[0440]使每个反应混合物直接进入专用一次性杯(cat号6211,haemscope公司)并且每个反应混合物由360μl的最大容积组成。全柠檬酸盐化血液是所有测定的成分并保持在320μl的恒定容积。[0441]按以下顺序，添加其它成分：1.ospa稀释液，2.钙，当存在时(最终浓度为20mm＝3.6μl的2m溶液)，以及3.柠檬酸盐化全血(320μl)，从而产生相对于柠檬酸盐的约10mm的过量的钙，其取决于10个血液样品的池的血细胞比容。[0442]图5示出来自血栓弹性描记法实验的痕迹的示意图。监测每个测试直到建立最大幅度(ma)值。图形是通过teg配套软件所生成。分析仪测量凝块(当它形成或裂解时)的剪切弹性。通过配套软件所计算的相关参数是：r-反应时间。从样品运行的起始直到第一可检测血块形成的时间。这是以秒为单位测得的大多数传统的血浆凝血测定到达它们的终点的点；角度-α。血纤维蛋白积聚和交联(凝块强化)的快速性的测量；ma-最大幅度。发展的凝块的最大刚度或强度(最大剪切模量)；a-幅度。在任何时候痕迹的宽度并且等于ma直到建立ma；g-剪切弹性模量强度(sems)。利用关系g＝5000*ma/(100-ma)，此值可以计算自最大幅度值。[0443]以5秒的间隔，记录血栓弹性描记器曲线图的幅度并利用在teg软件中的裂解追踪器功能加以检索。然后这些数据用来计算血块形成和溶解的动力学参数。记录每个样品的参数并对重复结果加以平均。通过首先计算标准偏差，然后此值除以重复次数的平方根，来确定标准误差。[0444]实施例5.4-产色/s-2222测定[0445]s-2222是基于肽的生色底物，在水解之后其释放对硝基苯胺，其可以在405nm处加以测量。s-2222被设计成对于通过因子xa的水解是特异性的。[0446]利用分光光度计，在细胞中的测定混合物具有1ml的总容积，其组成自：(1)900μl羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，ph7.4；(2)50μls-2222(3mm溶液，在水中)，从而产生150μμ的初始底物浓度；以及50μl凝血酶原激活剂，如ospa。将其稀释至10nm的最终工作浓度。对于对硝基苯胺的摩尔消光系数a405是9600m-1，其中分光光度计提供a405的增加率(以吸收率单位/秒为单位)。[0447]图6示出在ospa(使用指定为17/04/2012的ospa级分)的不同浓度下对硝基苯胺的释放的发展曲线。发展曲线是线性的。速率相对于ospa的量的重新绘图是线性的并构成测定的标准曲线。依据在测定中速率和凝血酶原激活剂的量，凝血酶原激活剂的比活性可以计算为蛋白质的单位/ml，其中1单位(u)是在标准测定中为水解1微摩尔s-2222/分钟所需要的蛋白质的量。[0448]实施例5.5-产色/s-2238两阶段测定[0449]可以使用的另一种生色测定是s-2238，基于肽的生色底物，其在水解之后释放对硝基苯胺，其在405nm处加以测量。s-2238被设计成对于通过凝血酶(因子ila)的水解是特异性的。上述测定取决于从第一阶段测定混合物(凝血酶原和激活剂)采样定时等分试到含有s-2238的第二阶段测定混合物，以测量在第一阶段中产生的凝血酶。[0450]在96孔微量滴定板中进行上述测定并在读板器上读取吸收率。第一阶段测定混合物具有100μl的总容积，其组成自：(1)25μl羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，ph7.4，5mmcacl2、0.1％bsa：(2)25μl激活剂(0.25μgospa/ml)；以及(3)50μl凝血酶原(2um)以起始反应。[0451]每隔5分钟，将10μl的第一阶段测定混合物加入在微量板的相邻孔中的90μl的0.2mms2238并监测吸收率2分钟。在这些条件下，利用对硝基苯胺标准物，对于对硝基苯胺的有效消光系数a405被确定为2271m-1。此因数用来将以吸收率单位/s为单位的增加率转换到每秒水解的微摩尔s2238。[0452]产生线性发展曲线，其斜率给出在第1阶段中s2238水解的速率。利用michaelis-menten方程，并用文献值替代kcat和km(sondersaandfentonjw,clin.chem.1986,32(6),934-937a)，炮塔它们转换到凝血酶浓度。这些凝血酶浓度相对于采样时间的重新绘图也是线性的，其斜率给出在阶段2测定中凝血酶原激活剂的浓度(作为单位/ml)，其中1单位(u)是在标准测定中为水解1微摩尔的凝血酶原/分钟所需要的激活剂的量(例如)(9.98e-6微摩尔/分钟)。还表明，相对于ospa浓度，凝血酶生产的速率的线性，其斜率给出凝血酶原激活剂的比活性，作为蛋白质的单位/mg(例如)(5.0e-3单位/mg)。[0453]实施例5.6-稳定性测试[0454]为了确定制剂在使用条件下的稳定性，在以下条件下存储样品：(1)用于冷冻稳定性测试：4℃，在冷藏环境中(恒温控制冷室)；(2)对于室温稳定性测试，定义为25℃(23.5-26.5℃)样品存储在环境温度下；(3)对于加速稳定性测试：50℃，在恒温控制的烘箱(49-51℃)中。[0455]实施例5.7-分析物测量[0456]在如本文所述所制备的血清中测量以下小组的分析物。使用的设备是beckmandxc800一般化学分析仪和beckmandxl800免疫测定分析仪(beckmancoulter,brea,ca,usa)：[0457][0458][0459]实施例6.凝血组合物相对于干燥条件和表面活性剂的稳定性[0460]实施例6.1-介绍[0461]本实验旨在探讨干燥条件以及表面活性剂的使用对凝血时间的影响。在本实施例中，将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，0.25μg或1μg)的样品放置在greinerwhitetop光滑(编码#456001)采血管(+/-亲水性表面活性剂20μ的2.41g/l，在水中)、+/-0.1％bsa)在hepes缓冲液中)中。按照实施例2来制备这些管，然后，按照实施例4，用来自50位健康供者或个别患者的池的4ml血液加以测试并经受视觉凝血测定和teg分析(按照实施例5)。在血液凝固实验之前，通过真空干燥器或genevac来干燥管(按照实施例2)。在室温下进行所有步骤。[0462]实施例6.2-结果和讨论[0463]在图7中的结果示出，相比与真空干燥器干燥ospa的全血凝血活性，新鲜稀释的ospa的全血凝血活性。d0数据是关于加入采血管的ospa的新鲜稀释的液体样品。d1数据是关于按照实施例2在真空干燥器中在采血管中在室温下干燥过夜的样品。在暗柱(d0)的比较之后，可以看到包括表面活性剂和bsa对新鲜样品的影响。对于对照血液样品(没有ospa)，在血液之前，将表面活性剂和/或bsa加入管对凝血时间没有显着影响，如按照实施例5利用标准凝血测定所测得的。对于含有0.25μgospa的样品，表面活性剂的存在减少了凝血时间：从330到132秒，其中对于1μgospa，值分别是180和72.5秒。单独的bsa还显著地减少凝血时间(但不如表面活性剂那么多)，但bsa和表面活性剂的影响不是加和的。不希望受理论束缚，对于表面活性剂的影响的可能的解释是，它以这样的方式防止ospa与管表面的结合以致它是不可用的功能。[0464]对于每组条件，比较图7中的方格柱和暗柱(d0和d1)表明，相比与新鲜稀释的ospa样品，如按实施例2进行的在真空干燥器中的干燥的影响。通常存在由干燥过程引起的凝血活性的损失。例如，使用1μgospa，干燥增加了凝血时间：在没有表面活性剂的情况下为从180到255秒，以及在表面活性剂的存在下为从72.5到127.5秒。表面活性剂和bsa的存在单独或一起导致在干燥之后较低的凝血时间，但损失仍然很大。在所有情况下，有表面活性剂的管比没有表面活性剂的管更快地凝固。例如，没有表面活性剂的1μgospa的湿样品在180秒内凝固，而在添加表面活性剂的情况下则为72秒。具有溶解在0.1％bsa中的ospa以及没有添加的表面活性剂同一管在97秒内凝固。这种模式重复于湿和干燥样品并且说明，虽然胶体如bsa可以改善活性(如果凝血酶原激活剂在管环境中)，但表面活性剂的添加是最佳的。[0465]在图8中的结果涉及使用genevac真空干燥器(按照实施例2)，其比在图7中使用的真空干燥器更快地实现ospa样品的干燥。对于50μl的总容积，干燥时间是30分钟(按照实施例2)。图8示出，干燥样品具有和相应的新鲜样品相同的凝血时间。还包括hepes对照。此实验表明，在genevac中的干燥产生凝血活性的100％保留。因此，genevac干燥用于大多数后续实验以制备含有干燥ospa的采血管。[0466]图8还示出，在室温下在存储8天之后，样品维持活性，如由凝血时间证明的。[0467]实施例7-凝血组合物相对于存储时间的稳定性[0468]实施例7.1-介绍[0469]本实验旨在探讨存储时间对凝血时间的影响。将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，0.25μg或1μg)的样品放置在greinerwhitetop光滑(编码#456001)采血管(+/-亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)、+/-0.1％bsa)，在hepes缓冲液中。然后利用genevac真空干燥器(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储在干燥的环境中(按照实施例2)长达85天。每周使用按照实施例4收集的柠檬酸盐化、汇集的血液来进行全血凝血测定(按照实施例5)。在存储之后，借助于视觉凝血和teg分析，管用于血液凝固测定(见实施例5)。在室温下进行所有步骤。每周使用液体形式的新鲜稀释的ospa来进行对照，以及仅使用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行对照。[0470]实施例7.2-结果[0471]表7示出对于0.25μg和1μgospa样品，到第85天时，凝血活性的损失。有时在第15天和第22天之间发生活性的损失。[0472]表7.在含有干燥ospa的采血管中重钙化柠檬酸盐化全血凝血(χ以秒为单位的凝血时间)[0473][0474][0475]实施例7.3-结论[0476]依据表7，可以看到，使用新鲜制备的液体ospa的对照管在整个85天的实验期间始终给出预期凝血时间(见行1、2、5和6)。对于干燥样品，对于最初三个测量(第1、8和15天)，凝血时间保持稳定。然而，在第22天的时间点，存在凝血时间的显着增加并且凝血活性的这种损失继续直到第85天(见行3、4、5和6)。因此，本实施例表明，当仅配制有表面活性剂时，随着时间的推移，以及当在室温下存储含有ospa的采血管时，ospa活性的逐渐损失。[0477]实施例8-相对于存储时间和其它添加剂，凝血组合物的稳定性[0478]实施例8.1-介绍[0479]本实验旨在探讨在一些条件下已知稳定蛋白质的十种试剂对凝血时间的影响。将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，0.25μg或1μg+/-乙酸铵ph6.8)的样品放置在hepes缓冲液中的greiner白顶光滑(编码#456001)采血管(+/-亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)+/-0.5％bsa；以及其它潜在稳定剂：+/-0.1％peg；+/-0.5％+/-1mm甘氨酸/精氨酸；+/-534nm肌肤蛋白；+/-1mm柠檬酸三钠；+/-0.5％甘露醇；+/-0.5％山梨醇；+/-0.5％葡聚糖；+/-0.5％明胶)中。管是按照实施例2加以制备，利用加以干燥，并在室温下存储在干燥的环境中长达99天。每周使用按照实施例4制备的柠檬酸盐化、汇集的血液进行全血凝血测定。在存储之后，按照实施例5利用视觉凝血方法，管用于血液凝固测定。在室温下进行所有步骤。每周使用液体形式的新鲜稀释的ospa进行对照，以及仅使用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行对照。[0480]实施例8.2-结果[0481]表8示出，对于1μgospa样品，到第85天时，凝血活性的损失。有时在第15天和第22天之间发生活性的损失。[0482]表8.在含有干燥ospa的采血管中重钙化柠檬酸盐化全血的凝血[0483][0484]表8示出实验的结果，上述实验包括在室温下存储长达99天(超过3个月)。示出的图是血块形成所需要的秒数。相比与单独的缓冲液，bsa和葡聚糖分别稳定ospa的血液凝固活性。例如，在99天存储之后，相比与新鲜对照(95秒)、仅ospa(510秒)和没有ospa的对照(710秒)，ospa/bsa和ospa/葡聚糖管的凝血时间分别是380和310秒。此结果表明，在室温下，在存储三个月之后(有葡聚糖或bsa)，在大约5分钟内，1μg的ospa凝固4ml重钙化柠檬酸盐化全血的能力。产生一定程度的稳定的其他试剂是山梨醇、明胶和甘露醇。[0485]实施例9-相对于存储时间、温度和胶体佳乐施的添加，凝血组合物的稳定性[0486]实施例9.1-介绍[0487]在寻求进一步改善干燥凝血酶原激活剂如ospa的凝血活性的稳定性中，测试了血浆膨胀剂佳乐施。胶体佳乐施(b.braun)是琥珀酰明胶在等渗盐水中的无菌溶液(4％w/v)并且是低成本和容易获得的。[0488]本实验旨在探讨，随着时间的推移，作为用来保持凝血时间功能的稳定剂的蛋白质胶体的影响。按照实施例2来制备管，其中将胶体滚动到管的内表面。将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，1μg+/-乙酸铵ph6.8)在20μl佳乐施ph7.4中的样品放置在greiner白顶光滑(编码#456001)采血管(+/-亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)中。然后利用并按照实施例2来干燥管，然后存储在室温下长达211天(图9和10)。按照实施例4制备的全血用于全血凝血测定并且在本实施例中通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在存储之后以及在每个时间点，将血液样品(柠檬酸盐化的、汇集的)等分入最终容积为4ml的管，并对含有样品的管进行标准全血凝血测定(按照实施例5)。在室温下进行所有步骤。除缺乏ospa的适当对照之外，在每个时间点，利用液体形式的新鲜稀释的ospa进行对照。[0489]此外，利用新鲜血液(按照实施例4)并借助于按照实施例5进行的视觉凝血评估来测试12个管。按照实施例2来制备管，其含有放置在bectondickinson光滑(编码#3276916)采血管中的新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，1μg，在20μl佳乐施ph7.4中)的样品+亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)。然后利用(按照实施例2)来干燥管。在t0时的视觉凝血时间是158.9+/-95秒，其可相比与用在bd光滑管中的柠檬酸盐化血液进行的实验。[0490]实施例9.2-结果和讨论[0491]结果示于图9(直方图)和10(线图)。在室温下在七个月(211天)之后，相比与新鲜对照的84秒和重钙化柠檬酸盐化血液样品对照(没有添加物)的950秒，4ml血液的使用1μgospa的凝血时间是265秒。观察到优良的稳定性长达121天，但然后在121和157天测量结果之间存在活性的损失。‘干燥ospa’线图的斜率是1.0秒/天(如果考虑所有时间点)以及0.79秒/天(如果仅考虑从第1天至第121天的时间点)。[0492]然后比较在实施例10和本实施例中凝血活性的损失的速率。活性损失的初始速率在实施例10(存在bsa和葡聚糖)中是1.67秒/天以及在实施例9(存在佳乐施，作为示例性胶体)中是0.79秒/天。如果考虑在每个试验中的所有数据点，则相应速率在实施例11中是1.29以及在实施例10中是1.0。因此这些数据表明，胶体葡聚糖、bsa和佳乐施有效地稳定ospa，其中在测试的样品中佳乐施似乎有最大的效应。[0493]实施例10-相对于存储时间、温度以及bsa和葡聚糖的添加，凝血组合物的稳定性[0494]实施例10.1-介绍[0495]本实验旨在探讨，随着时间的推移，合并为稳定剂的bsa和葡聚糖对保存凝血功能的影响(图11和12)。按照实施例2来制备管。将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，1μg，在20μl乙酸铵溶液中，其含有+/-0.5％葡聚糖、+/-0.5％bsaph6.8)的样品放置在greiner白顶光滑(编码#456001)采血管(+/-亲水性表面活性剂(20μ的2.41g/l，在水中)中。然后利用(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储长达195天(按照实施例5)。按照实施例4制备的全血用于全血凝血测定，在本实施例中通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在存储之后以及在每个时间点，将血液样品(柠檬酸盐化的、汇集的)等分入管，对4ml的最终容积和含有样品的管进行标准全血凝血测定(按照实施例5)。在室温下进行所有步骤。除缺乏ospa的适当对照之外，在每个时间点，使用液体形式的新鲜稀释的ospa进行对照。[0496]实施例10.2-结果和讨论[0497]图11示出实验的结果，上述实验包括在室温下存储长达195天(约6.5个月)，作为直方图，以及图12示出相应线图。比较这些结果与在表8中的那些结果说明，bsa和葡聚糖一起给出比任何一种材料更大的稳定。在6.5个月存储之后，相比与新鲜对照(83秒)和没有ospa的对照(957秒)，ospa/bsa/葡聚糖管的凝血时间是247秒。在图12中包括所有时间点的线图的斜率是1.29秒/天(凝血时间/天的增加)。如果排除最后四个时间点，则斜率是1.67秒/天(r2＝0.87)。[0498]实施例11-相对于温度和胶体佳乐施的添加，凝血组合物的稳定性[0499]实施例11.1-介绍[0500]这项研究的目的是，确定，当在50℃下存储时，干燥在佳乐施中的ospa的全血凝血活性的稳定性。在比正常存储温度更高的温度下的强制降级经常被用来比通过在升高的存储温度下存储样品规定时间更快速地获取稳定性数据。然后可以将在较高温度下活性的损失的速率外推至正常存储温度，例如，通过使用arrhenius方程。[0501]以及还确定了当在ph7.4下的佳乐施中干燥ospa时的测试稳定性、将佳乐施ph调节至6.0的影响。研究较低ph的影响的原因是探讨ospa的因子xa成分能够催化ospa的蛋白水解并具有活性的伴随损失的可能性。在ph6.0下ospa的催化活性是比在ph7.4下更低。[0502]按照实施例2来制备管。制备了两组样品，一组借助于greiner白顶光滑(编码#456001)采血管，以及另一组则借助于bd红顶光滑采血管(编码#3276916)。对于每组样品，将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，1μg、2μg或5μg)放置在管+/-亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)+/-50μl的4％w/v佳乐施中；以及缓冲到ph7.4或ph6.0。然后利用(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储长达211天(按照实施例2)。按照实施例4制备的全血用于全血凝血测定，在本实施例中通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在存储之后以及在每个时间点，将血液样品(柠檬酸盐化的、汇集的)等分入管，对4ml的最终容积和含有样品的管进行标准全血凝血测定(按照实施例5)。在室温下进行所有步骤。在每个时间点，除缺乏ospa的适当对照之外，利用液体形式的新鲜稀释的ospa来进行对照。[0503]实施例11.2-结果和讨论[0504]图13和14示出借助于bd管的50℃稳定性试验的结果。图15-18示出借助于greiner管的结果。[0505]基于这些结果，修改在greiner管中的相应实验，以使用单量的ospa(1μg)。在图15(ph7.4)和18(ph6.0)中的结果表明，ospa在greiner管中是比在bd管中更加稳定得多(比较图13和15以及图14和16)。因此，持续实验30天而不是对于bd实验的7天截止。[0506]在30天之后，相比与保持在室温下的管的117.5秒以及新鲜对照的83.5秒，50℃管的凝血时间是153.5秒(图16)。图15和16数据的比较还表明，将ph调节至6具有较小的有利影响(参见图13和14)。[0507]在图13中的结果表明，将含有ospa的bd管维持在50℃下导致活性的渐进损失，以致到第7天时已丢失高百分比的初始活性。利用1、2或5μgospa获得了类似结果，不同之处在于，在5μg管中比在2μg管中丢失更高百分比的初始活性，其反过来比1μg管丢失更多活性。此结果是一致与早期建议，ospa的蛋白水解活性可能导致自降解，其在较高浓度下将较快发生。活性损失的这种浓度依赖性的另一个可能的原因在于，在所有管中，佳乐施/管的量是相同的，而ospa量则是变化的：从1-5μg。佳乐施与ospa的较高比率可以给予更好的保护。图14示出，在ospa的添加和干燥之前，当将佳乐施的ph从7.4调节至6.0时，获得类似结果。然而，在50℃下存储1和7天的凝血时间的比较提示，存在活性在ph6下比在ph7.4下稍慢的损失。这也符合“活性的蛋白水解损失”假说。[0508]结果清楚地表明，在bd中活性损失比在greiner管中更大。一个可能的原因是，使用的表面活性剂可能不适合在bd管中的塑料的类型。应当注意，在50℃下在greiner管中活性损失的速率并不比在室温下在相应实验中损失的速率大得多。这可能是由于在较低的温度下膜中过量的水分。应当注意，在真空下密封商业化生产的采血管，其可以限制在表面膜内水分的量。[0509]将在图15和16中的凝血时间绘制为线图，以试图分别依照图17和18来确定在50℃下活性损失的速率。对于在图17中的50℃数据的最佳拟合线的斜率是存储的1.86秒/天的凝血时间的增加。在实施例9中室温存储的相应斜率是0.79秒/天(基于初始速率)。[0510]实施例12-相对于辐射，凝血组合物的稳定性[0511]实施例12.1-介绍[0512]作为杀菌的一种方式，辐射常规用于标准采血管的商业化生产。本实验旨在探讨在15kgy的工业相关剂量下γ辐射对ospa的影响。分两部分进行实验：第1部分：ospa连同佳乐施，第2部分：ospa和蛇毒液衍生的ecarin，连同佳乐施和海藻糖。[0513]在第1部分中，按照实施例2来制备管。将新鲜稀释的凝血酶原激活剂(ospa，lμg或5μg)放置在greiner白顶采血管(编码#456001)+亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)以及50μl的4％w/v佳乐施；羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液ph7.4，或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液ph7.4+0.5％葡聚糖+0.5％bsa中。然后利用真空干燥器(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储，同时进行辐射(按照实施例3)。使用每种配方来制造八个管，其中四个管用于辐射(按照实施例3)以及四个管用于在室温下存储(按照实施例2)。[0514]在制备之后的第1天将待辐射的管送到辐射设施。在用15kgy照射之后，将管返回并在第8天加以测定。在gammacell220辐射设施(ansto,building23,newlllawarraroad,lucasheights,nsw2234,australia)处按照实施例3进行辐射：在1.92kgy/h下7.88小时，在23.4℃下7.88小时，从而递送15.1kgy的总剂量。[0515]对于第2部分，按照实施例2来制备管，包括用亲水性表面活性剂涂布。通过将浓缩溶液稀释进入含有6％或10％海藻糖的佳乐施来制备凝血酶原激活剂(ospa或ecarin)。将含有1μg、或5μg的ospa或2iu的ecarin的二十μl等分试样放置在greiner白顶光滑管(代码号456001)和bd红顶无添加剂管(代码号366408)中。然后利用genevac(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储，同时进行辐射(按照实施例3)。制造了三十二个含有ospa的管和八个含有ecarin的管，其中二十个管用于辐射(按照实施例3)以及二十个管在室温下存储(按照实施例2)。[0516]在制备之后的第1天将待辐射的管再次送到辐射设施。在第8天用15kgy照射之后，将管返回并在第20天加以测定。按照实施例3，在gammacell220辐射设施(ansto,building23,newlllawarraroad,lucasheights,nsw2234,australia)处进行辐射：在1.92kgy/h下7.88小时，在23.4℃下7.88小时，从而递送15.1kgy的总剂量。[0517]按照实施例4制备的全血用于全血凝血测定，在本实施例中通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在室温下进行所有步骤。除缺乏ospa的适当对照之外，利用液体形式的新鲜稀释的ospa来进行对照。在35分钟之后，离心含有凝血的所有管。成像来自个别管的血清并收集用于生化分析物测试。[0518]实施例12.2-第1部分结果和讨论[0519]在图19中的结果表明，15kgy的辐射导致在含有1μgospa的所有样品中损失大部分凝血活性。佳乐施给予凝血活性的显着保护，即，管保留非辐射管的约20％活性，而在单独的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中，丢失了几乎所有活性。在羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液和佳乐施中葡聚糖和bsa均给予凝血活性的保护。佳乐施在更大程度上这样做。在已被干燥并在室温下存储但未辐射的管中，也存在活性的一些损失(图19a)，这一致与早期实验，其表明当通过真空干燥器来干燥样品时，活性的损失。这并没有显著影响在gelfusine管中或在含有羟乙基哌嗪乙硫磺酸以及bsa和葡聚糖的管中的结果。然而，借助于单独的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，含有1μgospa的管在没有辐射的情况下丢失大部分活性，从而确认早期测试。[0520]在图4中示出的凝血时间的浓度依赖性允许估计起因于辐射已丢失多少凝血活性。例如，含有5μgospa的辐射管的凝血时间是134秒(图19a)。在含有0.3μgospa的管中的凝血时间是137秒(图4)。因此，在照射之后，5μgospa的活性是大致相同于0.3μg新鲜ospa的活性。类似地，相比与0.05μg新鲜ospa的744秒，在佳乐施中的1μg的辐射ospa给出733秒的凝血时间。[0521]实施例12.3-第2部分结果和讨论[0522]图19b示出借助于用佳乐施以及6％或10％海藻糖配制的ospa管进行的试验的结果。结果表明，15kgy的辐射导致在照射之后的在第12天时在所有样品中凝血活性的一些损失。然而，相比与图19a所示的结果，含有6％和10％海藻糖的佳乐施给予ospa的凝血活性的显着保护。此外，在照射之后，在含有10％海藻糖的佳乐施中干燥的1μgospa的凝血时间是约5分钟。[0523]在图19c中的结果表明，在含有10％海藻糖的佳乐施中干燥的2iu下，15kgy的辐射并不影响ecarin的凝血活性。[0524]实施例13-相对于辐射ii，凝血组合物的稳定性[0525]本实验旨在探讨，借助于用ecarin配制的管，在25kgy的工业相关剂量下，γ辐射对ospa的影响。分两部分进行实验：第1部分：ecarin，连同佳乐施，第2部分：在室温下辐射管的稳定性。[0526]在第1部分中，按照实施例2来制备管。将新鲜稀释的ecarin2u放置在greiner白顶采血管(编码#456001)+亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)和20μl的4％w/v佳乐施中。然后利用genevac(按照实施例2)来干燥管并存储在室温下，同时按照实施例3来进行辐射。[0527]在制备之后的第1天，将待辐射的管送到辐射设施。在25kgy的照射之后，将管返回并在第7天加以测定。在gammacell220辐射设施(ansto,building23,newlllawarraroad,lucasheights,nsw2234,australia)处按照实施例3来进行辐射。[0528]对于第2部分，将有和没有辐射处理的管存储在室温下(按照实施例2)。[0529]按照实施例4制备的全血用于全血凝血测定，在本实施例中通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在室温下进行所有步骤。除缺乏ospa的适当对照之外，利用液体形式的新鲜稀释的ospa进行对照。在35分钟之后，离心含有凝血的所有管。[0530]实施例13.1-结果和讨论[0531]在图20中的结果表明，相比与干燥和未辐射(119秒)，在含有2uecarin的样品中，在第7天时，25kgy的辐射导致凝血活性的轻微损失(123秒)。在室温下在212天之后，相比与未经辐照的那些管，在已被辐射管之间再次存在微小差异(264秒，相比与254秒)。本实施例说明，在辐射的存在下以及在随后在室温下长期储存之后，在适当制剂中的凝血酶原激活剂ecarin呈现稳定性。[0532]实施例14-相对于存储时间、温度和其它添加剂ii，凝血组合物的稳定性[0533]实施例14.1-介绍[0534]进行实验以确定，当在室温下以及在升高的温度下如在50℃下存储或运输时，是否可以通过使用糖和其它添加剂来增强ospa的稳定性。按照实施例2来制备管。将新鲜稀释的ospa1μg放置在greiner白顶光滑采血管(编码#456001)(+亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)+/-20μl的4％w/v佳乐施、以及含有10％的海藻糖、甘露糖、蔗糖和山梨醇、1mm苯甲脒和0.1mmedta中。在第1部分中，然后利用真空干燥器(按照实施例2)来干燥管并在50℃下存储长达71天(见图21)。在第2部分中，然后利用真空干燥器(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储长达392天(见图22)。在第3部分中，按照实施例2来制备另外的管，其中利用放置在bd红顶光滑采血管(编码#3276916)(+亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)+20μl的4％w/v佳乐施、以及含有6或10％的半乳糖果糖中的ospa1μg。在第3部分中，然后利用genevac真空干燥器(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储22天(见图23)。[0535]按照实施例4制备的全血用于全血凝血测定，以及通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在存储之后，将血液样品(柠檬酸盐化的、汇集的)等分入管，其中最终容积为4ml。然后对含有样品的管进行标准全血凝血测定(按照实施例5)。在室温下进行所有步骤。除缺乏凝血酶原激活剂的适当对照之外，在每个时间点，利用新鲜稀释的ospa来进行对照。[0536]实施例14.2-第1部分-结果和讨论[0537]图21示出时间过程，其中当在真空干燥器中干燥样品时在所有样品中在第7天发现ospa的活性的主要损失。在50℃下的后续存储没有给出活性的进一步损失。确实，一些样品显示出活性的部分恢复。可能的是，活性的初始损失可能是由于样品的不完全干燥，以致水分的存在是活性的初始损失的原因。在50℃下10周之后，含有海藻糖的样品具有367秒的凝血时间以及在相同时期之后含有其它糖的样品面积具有约580-600秒的凝血时间。这是非常令人鼓舞的假设：可以防止活性的初始损失，以及提示，当在升高的温度下存储超长时间时，剂如含有稳定添加剂的胶体可以有效稳定凝血酶原激活剂的活性。[0538]实施例14.3-第2部分-结果和讨论[0539]图22说明，虽然干燥过程导致在t0时活性降低，但在用海藻糖和蔗糖配制的样品中，在室温下后续存储392天则显示保留在425秒内的活性。具有其它添加剂的配方似乎对凝血活性有负面影响。这也是非常令人鼓舞的假设：可以防止活性的初始损失，以及提示，当在商业相关温度下存储超长时间时，剂如具有稳定添加剂的胶体可以有效稳定凝血酶原激活剂的活性。[0540]实施例14.4第3部分-结果和讨论[0541]图23说明，当用佳乐施配制时，半乳糖果糖似乎对在t0时的干燥过程有保护效应。虽然在室温下仅存储22天，但结果表明借助于10％半乳糖果糖的凝血时间的改善，其说明，可以超长时间地存在对ospa的稳定影响。[0542]实施例15：相对于存储时间、温度和其它添加剂iii，凝血组合物的稳定性[0543]实施例15.1-介绍[0544]进行实验以确定，当在室温下存储或运输时，是否可以通过使用糖和其它添加剂来增强ecarin的稳定性。按照实施例2来制备管。将新鲜稀释的ecarin1u放置在greiner白顶光滑采血管(编码#456001)(+亲水性表面活性剂(20μl的2.41g/l，在水中)+/-20μl的4％w/v佳乐施、以及含有10％的海藻糖、甘露糖、蔗糖和山梨醇、1mm苯甲脒和0.1mmedta中。然后利用真空干燥器(按照实施例2)来干燥管并在室温下存储长达392天(见图23)。[0545]按照实施例4制备的重钙化、柠檬酸盐化全血用于全血凝血测定，以及通过视觉凝血评估方法(按照实施例5)加以评估。在存储之后，将血液样品(柠檬酸盐化的、汇集的)等分入管，其中最终容积为4ml。然后对含有样品的管进行标准全血凝血测定(按照实施例5)。在室温下进行所有步骤。在每个时间点，除缺乏凝血酶原激活剂的适当对照之外，利用新鲜稀释的ospa进行对照。[0546]实施例15.2-结果和讨论[0547]图24说明，虽然干燥过程导致在t0时活性降低，但在室温下后续存储392天则表明，在用海藻糖和蔗糖配制的样品中保留在350秒内的活性。当ospa用作激活剂时，具有其它添加剂的配方似乎对凝血活性有负面影响，虽然在实施例13中没有那么在。这也是非常令人鼓舞的假设：可以防止活性的初始损失，以及提示，当在商业相关温度下存储超长时间时，剂如含有稳定添加剂的胶体可以有效稳定凝血酶原激活剂的活性。[0548]实施例16-佳乐施对分析物检测的影响[0549]实施例16.1-介绍[0550]本研究旨在确定佳乐施到采血管的添加是否对检测生化分析物的范围的能力具有任何临床上显着的影响。[0551]在以下管中按照实施例2来制备以下管样品：greiner白顶光滑管(代码号456001，greiner红顶血清管(代码号456092)、bd红顶光滑管(代码号3276916)和bd无添加剂管(代码号366408)：(1)greiner光滑管，具有在羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的ospa+亲水性表面活性剂a，(2)greiner光滑管，具有ospa+佳乐施+亲水性表面活性剂a，(3)bd光滑管，具有在羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的ospa+疏水性表面活性剂；(4)bd光滑管，具有ospa+佳乐施+疏水性表面活性剂，(5)greiner血清管，(6)greiner血清管+佳乐施，(7)greiner血清管+在羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的ospa，(8)greiner血清管+ospa+佳乐施，(9)bd血清管，(10)bd血清管+佳乐施，(11)bd血清管+在羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的ospa，以及(12)bd血清管+ospa+佳乐施。[0552]然后每个这些管样品用来检测如表9所示的分析物的范围。按照实施例5来测试分析物。[0553]实施例16.2-结果和讨论[0554]结果示于表9。在商业血清管(greiner管7和8以及bd管11和12)的顶端添加的ospa维持正常分析物检测。佳乐施的添加对任何测量的分析物没有临床影响。因此佳乐施到采血管的添加似乎对检测分析物的能力没有影响。[0555]表9-分析物的检测，其中利用在采血管中的佳乐施[0556][0557][0558]参考文献[0559]1.arkin,a.p.,youvan,d.c,“analgorithmforproteinengineering:simulationsofrecursiveensemblemutagenesis”1992proc.natl.acad.sci.usa89:7811-7815.[0560]2.atherton,e.,shephard,r.c,solidphasepeptidesynthesis-apracticalapproach1989,irlpress,oxfordengland.[0561]3.ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepubl.assoc.andwiley-intersciences,1992.[0562]4.bos,m.h.a.,boltz,m.,stpierre,l.,masci,p.p.,dejersey,j.,lavin,m.f.,camire,r.m.,“venomfactorvfromthecommonbrownsnakeescapeshemostaticregulationthroughprocoagulantadaptations”blood16july2009；114(3):686-692.[0563]5.dayhoff,m.o.,schwartz,r.m.,orcutt,b.c.,etal.,“amodelofevolutionarychangeinproteins.matricesfordeterminingdistancerelationships”1978inatlasofproteinsequenceandstructure(dayhoff,m.o.ed.),vol5,pp345-358,nationalbiomedicalresearchfoundation,washingtondc.[0564]6.delagrave,s.,goldman,e.r.,youvan,d.c.,“recursiveensemblemutagenesis”apr1993proteineng.6(3):327-31.[0565]7.dimeskig.acommentaryontheeffectoflipidemulsionsonpathologytests.brjanaesth2009；64:1033-6.[0566]8.dimeskig,birdr.hyperleukocytosis:pseudohyperkalaemiaandotherbiochemicalabnormalitiesinhyperleukocytosis.clinchemlabmed2009；47:880-1.[0567]9.dimeskig,mcwhinneyb,jonesb,mason,r,cartera.extentofbilirubininterferenceinbeckman-coultercreatininemethods.annclinbiochem2008；45:91-2.[0568]10.dimeskig,mascipp,trabim,lavinmf,dejerseyj.evaluationofthebecton-dickinsonrapidserumtube:doesitprovideasuitablealternativetolithiumheparinplasmatubes？clinchemlabmed2010；48:651-6.[0569]11.dimeskig,badrickt,flatmanr,ormistonb.therocheifccmethodsforlactatedehydrogenasetestedforduplicateerrorsusinggr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