一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物、探针及应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物、探针及应用。
背景技术：2.纽布病毒(nebovirus，nev)是杯状病毒科、纽布病毒属的唯一成员，同科的病毒还有诺如病毒属(norovirus)、札幌病毒属(sapovirus)、水疱疹病毒属(vesivirus)、兔病毒属(lagovirus)。
3.nev为无囊膜单股正链rna病毒，基因组全长约为7.4kb，由两个开放的阅读框(orfs)组成，分为三种基因型：nb、na1和dijona216。纽布病毒的易感动物只有牛，可诱发犊牛厌食症和木糖吸收不良，尽管目前尚无nev的分离培养体系，但在排除了其他病毒的含nev腹泻粪便无菌处理后感染新生无菌小牛，可引起严重腹泻和肠道损伤，尤其在十二指肠和空肠最为严重。
4.目前已在美国、英国、巴西以及我国犊牛粪样检测出了bnev，其分子生物学检测方法有sybr green荧光定量rt-pcr检测方法、tb green荧光定量rt-pcr检测方法，巢氏rt-pcr检测方法、常规rt-pcr检测方法，尚未见taqman荧光定量rt-pcr检测牛纽布病毒的报道。
5.因此，如何提供一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物及检测方法、体系，提供更为准确的结果是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：6.有鉴于此，本发明提供了一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物、探针及应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物，包括：引物nb-f-4716，核苷酸序列如seq id no.1所示；引物nb-r-4949，核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.优选的：还包括探针nbv-tz，核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.本发明还提供了含有上述引物的试剂或试剂盒。
11.本发明还提供了一种非诊断治疗目的使用taqman荧光定量rt-pcr检测牛纽布病毒的方法，使用上述的引物。
12.优选的包括扩增体系：gotaq probe qpcrmaster mix 10μl，scripttmrt-mix for 1-step rt-qpcr 2
×
0.4μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探针0.8μl，cdna模板2μl，余量rnase-free ddh2o，总体积为20μl。
13.优选的：包括扩增程序：45℃反转录15min；95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。
14.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物、探针及应用，取得的技术效果在于本发明建立的bnev荧光定量rt-pcr方法检测到的最低检出量为1.0
×
101copies/μl，在1.0
×
106～1.0
×
102copies/μl的5个梯度范围内具有良好的重复性(变异系数《3.0％)。
15.此外，因为粪样中的核酸易降解，在采集粪样时加入了核酸保护剂，将其置于干冰箱中并快速运输至-80℃冰箱保存，最大程度的减少了rna降解，有效的提高病毒核酸的检出率。
16.设计引物时考虑到纽布病毒基因序列易变性，应用简并引物扩增提高了本发明的敏感性。经过引物和探针的优化，本发明建立了特异性强、灵敏度高、稳定性好的taqman荧光定量rt-pcr方法，敏感性高于文献报道的巢式rt-pcr方法及普通rt-pcr检测方法，灵敏度高于普通rt-pcr的100倍。同时检测了粪样病毒载量，其中腹泻粪样平均病毒载量为8.7
×
105copies/μl，正常粪样只检出一份阳性，病毒载量为2.6
×
103copies/μl，样品bnev阳性率为35.1％。本发明首次分析了犊牛粪样中的病毒载量，为bnev的早期诊断和分子流行病学调查提供了有效的技术支撑。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
18.图1附图为本发明提供的bnev荧光定量rt-pcr引物优化结果图，其中，a-500nmol/l；b-400nmol/l；c-300nmol/l；d-200nmol/l；e-100nmol/l。
19.图2附图为本发明提供的bnev荧光定量rt-pcr探针优化结果图，其中，a-500nmol/l；b-400nmol/l；c-300nmol/l；d-200nmol/l；e-100nmol/l。
20.图3附图为本发明提供的bnev荧光定量rt-pcr标准曲线图。
21.图4附图为本发明提供的bnev荧光定量rt—pcr特异性试验结果图，其中，a.-牛纽布病毒；b-其他病原和阴性对照。
22.图5附图为本发明提供的bnev荧光定量rt-pcr敏感性试验结果图，其中，a～h：.1.0
×
108～1.0
×
101copies/μl质粒dna；i.阴性对照及1.0
×
100·
copies/μl质粒dna。
23.图6附图为本发明提供的bnev普通rt-pcr敏感性试验结果图，其中，m.500bp ladder dna marker a～i：1.0
×
108～1.0
×
100copies/μl质粒dna；j.阴性对照。
24.图7附图为本发明提供的牛纽布病毒荧光定量rt-pcr重复性试验结果图，其中，a～e：1.0
×
106～1.0
×
102copies/μl质粒dna；f.阴性对照。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明实施例公开了一种牛纽布病毒taqman荧光定量rt-pcr检测引物、探针及应用。
27.实施例中，未提及的实验方法、原料、设备均为常规实验方法及市售获得的实验材料，在此不再赘述。
28.其中，病毒、细菌和临床样本：
29.牛病毒性腹泻病毒1、2型，牛冠状病毒、牛轮状病毒、大肠杆菌、沙门菌，均由内蒙古农业大学兽医学院传染病学教研室保存；37份犊牛粪样来源于内蒙古地区牧场，所有样本于-80℃条件下保存。
30.主要试剂：
31.rneasy mini kit购自qiagen公司；gotaq probe qpcr and rt-qpcr systems、one step qrt-pcr kit，均购自promega公司；pmd19-t载体、dh5
ɑ
感受态细胞、premix taqtm、easy dilution、6
×
loading buffer、500bp dna laddermarker均购自takara公司；dna凝胶的回收试剂盒，购自axygen公司；质粒小提试剂盒、rnase-free ddh2o购自tiangen公司。
32.引物和探针的设计与合成：
33.引物由上海生工有限公司合成，探针由宝生物工程(北京)有限公司合成。
34.实施例1
35.根据genbank的bnebv-rdrp基因序列(mh718886、mg599036、mw036464)，利用lasergener软件中megalign程序进行同源性分析，选取保守序列设计了一对bnev引物和其探针，序列见表1。
36.表1扩增牛纽布病毒引物及探针序列信息
[0037][0038][0039]
实施例2
[0040]
标准品的制备
[0041]
按照rneasy mini kit试剂盒按说明书提取样本rna，用表1上下游引物扩增目的基因、胶回收纯化pcr产物，连接至pmdl9-t载体(连接反应体系：pmd19-t vector 1.0μl；纯化产物4.0μl；solution i 5.0μl；反应条件：于4℃过夜培养)并转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂板，筛选出阳性克隆菌并进行增菌培养(具体步骤：
[0042]
转化：
[0043]
(1)将取出的dh5α感受态细胞在冰中融化至半雾状态时立刻将5μl的连接产物加
入到50μl的dh5α感受态细胞中，轻弹混合后立即在冰中放置30min。
[0044]
(3)取出混合液立即在42℃金属浴中放置45sec后立即于冰盒中放置2min。
[0045]
(4)于混合液中加入890μl的无amp的lb液体培养基，后将其放置在37℃，200rpm的摇床上恒温震荡1h。
[0046]
(5)4000rmp离心3min，弃上795μl上清，混匀剩下的150μl上清及菌体沉淀。
[0047]
(6)将其均匀的涂在含amp的lb固体培养基上，倒置培养在37℃培养箱中，过夜，观察是否有单个菌落出现。
[0048]
菌落的扩增培养
[0049]
在培养基上挑取6个单个菌落，加入到5ml有amp的lb液体培养基中，混匀后于37℃，200rpm恒温振荡培养箱中过夜培养)，提取质粒进行测序鉴定。以鉴定正确的阳性重组质粒命名为pmd19t-bnev，测定重组质粒dna浓度，计算拷贝数。
[0050]
实施例3
[0051]
荧光定量rt-pcr方法的条件优化
[0052]
模板为牛纽布病毒的阳性重组质粒dna，分别吸取上下游引物各0.2μl、0.4μl、0.6μl、0.8μl、1μl进行引物浓度优化。
[0053]
再取优化好的引物浓度，探针各吸取0.2μl、0.4μl、0.6μl、0.8μl、1μl，模板为牛纽布病毒的阳性重组质粒dna，再进行探针浓度优化。
[0054]
在20μl扩增体系中，选取ct值最小、荧光量最高最为参考标准，结果表明，牛纽布病毒的最佳上下游引物浓度均为500nmol/l，最佳探针浓度为400nmol/l。优化曲线见图1和图2。
[0055]
利用优化好的引物和探针进行荧光定量pcr扩增，扩增体系：gotaq probe qpcrmaster mix 10μl，scripttmrt-mix for 1-step rt-qpcr 2
×
0.4μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探针0.8μl，cdna模板2μl，rnase-free ddh2o 4.8μl总体积为20μl；扩增程序：45℃反转录15min；95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。
[0056]
实施例4
[0057]
标准曲线的建立
[0058]
选取浓度为1.0
×
108～1.0
×
101copies/μl质粒dna作为模板进行扩增，以无酶水为阴性对照，用优化的荧光定量rt-pcr扩增体系及程序进行扩增，绘制标准曲线。
[0059]
荧光定量rt-pcr的标准曲线
[0060]
选取浓度为1.0
×
108～1.0
×
101copies/μl质粒dna作为模板进行扩增，获得牛纽布病毒荧光定量rt-pcr的扩增曲线和标准曲线(见图3)，结果显示，牛纽布病毒的标准曲线参数斜率为-3.189；r2值为0.996；扩增效率(e)为105.9％，说明建立的方法相关性较高，可用于牛纽布病毒的定量检测。
[0061]
实验效果：
[0062]
特异性试验
[0063]
按照rna/dna提取试剂盒说明书提取牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、大肠杆菌以及沙门菌核酸，以1.0
×
106copies/μl的牛纽布病毒阳性重组质粒标准品作为阳性对照，无酶水为阴性对照。利用实施例中建立的牛纽布病毒荧光定量rt-pcr方法进
行检测，评价该方法的特异性。
[0064]
结果表明：
[0065]
采用实施例建立的牛纽布病毒荧光定量rt-pcr方法对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、大肠杆菌以及沙门菌核酸进行检测，结果显示，只检测出牛纽布病毒，其他病原和阴性对照均无扩增曲线，证明该方法具有较好特异性，可用于牛纽布病毒检测，见图4。
[0066]
敏感性试验
[0067]
选取浓度为1.0
×
108～1.0
×
100copies/μl质粒dna作为模板，进行普通rt-pcr和荧光定量rt-pcr扩增，得出两种检测方法能够检出的最低拷贝数。
[0068]
结果表明：牛纽布病毒的qpcr最低检出量达1.0
×
101copies/μl，而普通rt-pcr最低检出量为1.0
×
103copies/μl，表明本发明所建立方法具有较好的敏感性。见图5、6。
[0069]
重复性试验
[0070]
选取浓度为1.0
×
106～1.0
×
102copies/μl 5个梯度的质粒dna，利用实施例中建立的牛纽布病毒荧光定量rt-pcr方法进行扩增，进行组内和组间重复性试验，并分别计算组内和组间ct值的变异系数，检测该方法的重复性。
[0071]
结果表明：3次重复性试验，结果组内和组间试验ct值的变异系数均小于3.0％，表明该方法重复性和稳定性良好，见表2和图7。
[0072]
表2牛纽布病毒荧光定量rt-pcr组内及组间重复性试验结果
[0073][0074]
临床样品的检测
[0075]
按照rna快速提取试剂盒说明书提取37份临床样品核酸，应用实施例中建立的牛纽布病毒荧光定量rt-pcr方法和普通rt-pcr方法对在内蒙古地区牧场采集的37份犊牛粪样进行检测。
[0076]
应用普通rt-pcr方法和本发明所建立的牛纽布病毒荧光定量rt-pcr方法和对采集的37份犊牛粪样进行检测，同时设置阳性对照和阴性对照。普通rt-pcr方法只检出4份牛纽布病毒阳性病料，阳性率为10.8％，而应用实施例建立的荧光定量rt-pcr方法则检出13份牛纽布病毒阳性病料，阳性率为35.1％，说明本发明建立的荧光定量rt-pcr方法比普通
rt-pcr方法敏感性更强，表3为犊牛粪样牛纽布病毒病毒载量检测数据。
[0077]
表3犊牛粪样牛纽布病毒病毒载量检测
[0078][0079]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0080]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
