一株短小芽孢杆菌t5-1及其应用
技术领域:
:1.本技术属于马铃薯土传病害防控
技术领域:
:。技术背景2.马铃薯土传病害是指病原体生活在土壤中,条件适宜时从马铃薯根部或者茎部侵害马铃薯而引起的病害,由于其存在的条件限制,一般较难防控,常见的马铃薯土传病害有:疮痂病、枯萎病、黑痣病、青枯病等,对于马铃薯土传病害,重茬连作、施肥不当都是其主要的发病原因,近年来,随着我国马铃薯生产的快速发展,土传病害呈高发态势。3.对于马铃薯土传病害的防治,一般采用(1)土壤处理:麦草秸秆合尿素覆盖,封闭大棚,该方法一般用于温室大棚,(2)选用抗病品种:选用抗病或者耐病的品种,可大大地减轻土传病害的危害程度,(3)轮作:这是防治土传病害较为有效的措施,(4)改善栽培措施:通常选择小水勤浇,避免大水漫灌,合理密植,清洁田园等措施,(5)施肥管理:避免偏施氮肥,适当增施磷、钾肥,最好增施有机肥,提高作物抗病性。(6)药剂防治:该方法应用较多,但对土壤生态危害较大。4.本发明生产一株具有拮抗马铃薯疮痂病等病原菌的短小芽孢杆菌,能够有效抑制马铃薯疮痂病、黑痣病、枯萎病、早疫病等病原菌,促进植物生长,改善土壤生态环境。技术实现要素:5.本发明的第一目的是提供一株短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1,其保藏编号为cgmccno.23942。6.本发明所提供的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:cgmccno.23942,保藏日期为:2021年11月19日,保藏单位简称为cgmcc,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。7.本发明的第二目的是提供短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1在防治马铃薯土传病害防治菌剂中的应用。8.本发明提供的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1,培养简单、周期短、无生态毒性、可利用的碳源种类丰富,能够有效促进植物生长,同时能够有效抑制马铃薯疮痂病、黑痣病等病原菌的生长。附图说明:9.图1是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1菌落形态图。10.图2是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1抑菌结果图。11.图3是短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1马铃薯疮痂病防治效果盆栽结果图。具体实施方式:12.如无特殊说明,下列实施例中待测菌株均指短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1。13.如无特殊说明,下列实施例中的活化均指短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1在马铃薯固体培养基上扩大培养三次。14.实施例115.菌种的分离与鉴定16.1.培养基:17.马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基(1l):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15g,蒸馏水1000ml,ph自然。18.2.菌株来源:19.短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1由发明人于2020年12月分离自广西南宁市武鸣区甘蔗地。20.取1g土样放入50ml离心管中,加入10ml无菌水震荡均匀,于37℃、200rpm的摇床上振荡30min,静置至澄清得土壤悬浮液。21.在超净工作台中将制备好的土壤悬浮液进行梯度稀释,分别取1100μl10-3、10-4、10-5倍稀释液在lb固体培养基上进行涂布,重复3次,37℃培养24h。24h后在超净工作台中挑取形态不同的菌落分别划线纯化,37℃培养24h,重复纯化3次。将得到的纯的单菌落转移到试管斜面培养基中,放入4℃冰箱保存备用。22.3.筛选结果:23.分离得到菌株如图1所示,命名为菌株t5-1,革兰氏阳性,该菌株为杆状,以二分裂方式增殖。菌落为黄白色,圆形,边缘整齐,扁平,光滑,有光泽,黏稠。产芽孢。分解葡萄糖、麦芽糖和其他糖类。24.4.细菌菌株鉴定方法:25.采用tiangen细菌基因组dna提取试剂盒提取基因组dna。以待测菌株基因组dna为模板,利用细菌16srrna基因通用引物27f/1492r扩增目的片段,pcr产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,将pcr原液送博迈德生物工程股份有限公司测序。16srrna基因序列分析,经过序列对比鉴定,菌株t5-1以mk757660.1(ncbi)为标准鉴定t5-1菌株为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus),测序序列如序列表中seqidno.1所述的序列。26.实施例227.菌株生理生化分析28.采用梅里埃api20ne非发酵g-杆菌鉴定试剂盒试验菌株t5-1生理生化指标。短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能利用丙酮酸盐,能利用葡萄糖、麦芽糖、kohn明胶、蜜糖、阿拉伯糖等。29.详细结果如下表:30.表1生理生化性质分析31.tablelanalysisofphysiologicalandbiochemicalproperties[0032][0033][0034]实施例3[0035]菌株对马铃薯黑痣病病原菌抑制效果[0036]马铃薯黑痣病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号:3.2888)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天;取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基,37℃,摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后,弃上清,沉淀悬浮于同体积的无菌水中,制备菌悬液。[0037]将马铃薯黑痣病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块,对角线接种与马铃薯琼脂培养基上,将t5-1菌悬液吸取6μl两次,分别滴于空白对角线处。得到如图2a结果所示:短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯黑痣病病原菌生长。抑菌圈直径达15mm。[0038]菌株对马铃薯早疫病病原菌抑制效果[0039]马铃薯早疫病病原菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心(accc)编号:38869)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天;取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基,37℃,摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后,弃上清,沉淀悬浮于同体积的无菌水中,制备菌悬液。[0040]将马铃薯早疫病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块,对角线接种与马铃薯琼脂培养基上,将t5-1菌悬液吸取6μl两次,分别滴于空白对角线处。得到如图2b结果所示:短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯早疫病病原菌生长,抑菌圈直径达10mm。[0041]菌株对疮痂链霉菌抑制效果[0042]马铃薯疮痂病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号:4.1765)在马铃薯培养基上28℃培养3天;用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体,制成一定浓度的病原体悬液,要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。[0043]取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基,37℃,摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后,弃上清,沉淀悬浮于同体积的无菌水中,制备细胞悬液。[0044]将试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765涂布于不同平板上(pda),在平板上局部点接6ul菌株t5-1,28℃培养,5天以后观察。得到如图2c所示的实验结果:短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制马铃薯疮痂病病原菌4.1765生长。抑菌圈直径达10mm。[0045]菌株对马铃薯枯萎病病原菌抑制效果[0046]马铃薯枯萎病病原菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号:3.18025)在马铃薯琼脂培养基上28℃培养5天;取活化后的菌株t5-1于50ml马铃薯液体培养基,37℃,摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后,弃上清,沉淀悬浮于同体积的无菌水中,制备菌悬液。[0047]将马铃薯枯萎病病原菌用6mm直径灭菌打孔器取2块,对角线接种与马铃薯琼脂培养基上,将t5-1菌悬液吸取6μl两次,分别滴于空白对角线处。得到如图2d结果所示:短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)t5-1能有效抑制试验马铃薯枯萎病病原菌生长。抑菌圈直径达20mm。[0048]实施例4[0049]菌株耐盐测试试验[0050]基础培养基为lb液体培养基,向lb固体培养基中加入nacl调节盐质量浓度为1%、3%、5%、9%、11%,调节ph为7.0,121℃高压灭菌20min。[0051]将活化后的待测菌株t5-1分别接种于五种不同盐浓度的lb液体培养基上,以不接种菌的培养基为空白对照,放入37℃的恒温培养箱中培养24h观察菌株t5-1的生长情况。测定od值。[0052]结果如下,随着nacl质量浓度的升高,菌株t5-1的浓度逐渐降低,但是当nacl质量浓度达到11%时,还能生长,但生长明显收到抑制。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用,具有耐盐性,适合作为微生物盐碱地改良剂。[0053]表2不同盐浓度下t5-1生长情况[0054][0055]实施例5[0056]菌株对不同ph敏感性测定[0057]基础培养基lb液体培养基,分别调节ph值为3、5、6、7、8、9、11。将活化后的待测菌株t5-1接种于六种ph值的敏感性测定培养基上,放入37℃的恒温培养箱中培养24h,观察待测菌株t5-1的生长情况。若菌株t5-1能够正常生长,说明该菌株t5-1能够耐受该ph;反之,则说明该菌株t5-1不能耐受该ph。测定其浓度od值,[0058]结果如下,当ph小于5以及大于9,菌株t5-1生长明显受到抑制,ph为9还能继续生长,但生长收到一定程度的抑制。证明该菌株能在ph为1-11的环境中存活及繁殖,即可以在盐碱地改良中应用,具有耐碱性,适合作为微生物盐碱地改良菌剂。[0059]表3不同ph下t5-1生长情况[0060][0061]实施例6[0062]菌株对马铃薯疮痂病防治盆栽试验[0063]将马铃薯品种夏波蒂组培苗移栽至蛭石的花盆(直径17cm)中,生长10d后选取长势一致的幼苗,采用灌根法接种100ml疮痂链霉菌(4.1765)(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)编号:4.1765)孢子悬液(1×106cfu/ml)于花盆中;再生长10d后接入100ml短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)菌株t5-1的发酵液(1×106cfu/ml),对照组不加生防菌,并以未接种任何菌剂的处理为空白对照,每个处理重复3次。待马铃薯收获后,依据疮痂病病害分级标准,分别统计发病率、病情指数和防治效果。统计结果显示,只有病原菌处理的马铃薯发病率达到92.4%,病情指数达到57.7%而t5-1处理之后的马铃薯发病率为46.2%,病情指数为11.5%,菌株t5-1对马铃薯疮痂病的防效达到80.1%。[0064]马铃薯疮痂病发病统计:[0065]0级:薯皮健康,无病斑[0066]1级:1-2个零星病斑,或发病病斑面积为0-1/8(0-12.5%)[0067]2级:3-5个零星病斑,或发病病斑面积为1/8-1/4(12.5-25%)[0068]3级:6-10个零星病斑,或发病病斑面积为1/4-1/2(25-50%)[0069]4级:11-15个零星病斑,或发病病斑面积为1/2-3/4(50-75%)[0070]统计表[0071][0072][0073]发病率(%)=发病块茎数/调查总块茎数×100[0074]病情指数(%)=∑(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100[0075]防效(%)=(对照病指-处理病指)/对照病指×100。当前第1页12当前第1页12