一种ph响应无规共聚物及其制备方法、一种外泌体均相分离纯化方法
技术领域
1.本发明属于生物样品分离纯化技术领域，具体涉及一种ph响应无规共聚物及其制备方法、一种外泌体均相分离纯化方法。
背景技术：2.外泌体是一类直径约30～200nm的磷脂双分子层细胞外囊泡。外泌体含有核酸、蛋白质和磷脂等多种特异性生物标志物，基于外泌体的临床诊断和治疗已受到越来越多的关注。但因生物样品中外泌体的丰度非常低，使外泌体的应用仍面临挑战。
3.目前，外泌体分离纯化的金标准是超速离心法。该方法利用超速离心机实现外泌体的分离纯化，但仪器昂贵且需专业人员进行操作。
4.现有的外泌体分离纯化方法还有微流控法和免疫亲和法。其中，微流控法利用微流控芯片对外泌体进行分离，适用于微量样品分离分析，难以实现外泌体规模化分离制备；免疫亲和法则是利用可特异性与外泌体表面蛋白相结合的抗体对磁珠进行标记，进而实现外泌体的纯化。虽然免疫亲和法特异性高，但需大量抗体固载于磁球表面，抗体易在存储过程中发生降解，且抗体只可识别特定类型的外泌体，限制了免疫亲和法在大规模外泌体分离纯化中的应用。
5.综上，目前外泌体分离纯化方法中存在以下不足：(1)基于固相的外泌体纯化方法存在固液相界面，外泌体的纯化过程中需要在多个相界面之间进行，纯化效率低；(2)需要利用特异的抗体对外泌体进行纯化，抗体的特异性和稳定性严重制约了纯化方法在不同来源样品之间的广泛适用性。
技术实现要素：6.有鉴于此，本发明提供了一种ph响应无规共聚物及其制备方法、一种外泌体均相分离纯化方法。本发明提供的外泌体均相分离纯化方法利用ph响应无规共聚物的ph响应特性，实现外泌体的均相分离纯化，回收率高。
7.本发明提供了一种ph响应无规共聚物，由ph响应功能单体和外泌体特异性识别聚合单体共聚得到；所述外泌体特异性识别聚合单体由外泌体特异性识别功能化单体作为原料之一制备得到，所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、取代苯硼酸、取代多羟基化合物、取代聚乙二醇中的一种或多种。
8.优选的，所述ph响应功能单体具有酰胺基和/或酯基。
9.优选的，所述ph响应功能单体具有式1所示结构或式2所示结构：
[0010][0011]
所述式1中，r1和r2独立的为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2(ch2)2ch3、环戊基或环己基；
[0012]
所述式1中，n≥1；
[0013]
所述式1中，r3为-h或-ch3；
[0014]
所述式2中，r4为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2(ch2)2ch3、环戊基或环己基；
[0015]
所述式2中，r5为-h或-ch3。
[0016]
优选的，所述外泌体特异性识别聚合单体的制备方法包括以下步骤：
[0017]
将外泌体特异性识别功能化单体、烯烃基酰氯、缚酸剂和极性有机溶剂混合发生亲核取代反应，得到外泌体特异性识别聚合单体；所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、氨基取代苯硼酸、氨基取代多羟基化合物、氨基取代聚乙二醇中的一种或多种。
[0018]
优选的，所述烯烃基酰氯为丙烯酰氯。
[0019]
优选的，所述ph响应功能单体的物质的量占所述外泌体特异性识别聚合单体和ph响应功能单体总物质的量的百分比为20～60％。
[0020]
优选的，所述ph响应无规共聚物的ph响应区间为4～10。
[0021]
本发明提供了上述技术方案所述ph响应无规共聚物的制备方法，包括以下步骤：
[0022]
将所述外泌体特异性识别聚合单体、ph响应功能单体、偶氮引发剂和极性有机溶剂混合发生共聚合反应，得到所述ph响应无规共聚物。
[0023]
本发明提供了上述技术方案所述一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：
[0024]
在第一ph值条件下，将ph响应无规共聚物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述ph响应无规共聚物为上述技术方案所述ph响应无规共聚物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的ph响应无规共聚物；
[0025]
在第二ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；
[0026]
在第三ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物的混合液；
[0027]
在第四ph值条件下，将净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从混合液中析
出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；
[0028]
在第五ph值条件下，将所述净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有ph响应无规共聚物和外泌体的洗脱液；
[0029]
在第六ph值条件下，将ph响应无规共聚物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；
[0030]
所述第一ph值、第三ph值和第五ph值独立地为4～7；所述第二ph值、所述第四ph值和所述第六ph值独立地为7.5～10。
[0031]
优选的，所述第一固液分离分离、第二固液分离和第三固液分离为离心分离，所述第一离心分离、第二离心分离和第三离心分离的速度独立地为3000～8000g。
[0032]
本发明提供了一种ph响应无规共聚物，由ph响应功能单体和外泌体特异性识别聚合单体共聚得到；所述外泌体特异性识别聚合单体由外泌体特异性识别功能化单体制备得到，所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、取代苯硼酸、取代多羟基化合物、取代聚乙二醇中的一种或多种。本发明提供的ph响应无规共聚物，由ph响应功能单体和外泌体特异性识别聚合单体共聚得到，所述外泌体特异性识别聚合单体由包括精氨酸、赖氨酸、取代苯硼酸、取代多羟基化合物、取代聚乙二醇中的一种或多种的外泌体特异性识别功能化单体制备得到，能够有效地将生物样品溶液中的外泌体固定或吸附在ph响应无规共聚物上；同时聚合生成ph响应无规共聚物的ph响应功能单体具有溶解性随着ph值变化的特性，能够使ph响应无规共聚物具有在不同ph值条件下溶解度不同的特点，即溶解-沉淀ph响应特性，通过调节ph响应无规共聚物溶液的ph使其溶解或沉淀析出，从而实现外泌体的均相分离纯化。
[0033]
本发明提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：在第一ph值条件下，将ph响应无规共聚物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述ph响应无规共聚物为上述技术方案所述ph响应无规共聚物或上述技术方案的制备方法制备得到的ph响应无规共聚物；在第二ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；在第三ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物的混合液；在第四ph值条件下，将净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；在第五ph值条件下，将所述净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有ph响应无规共聚物和外泌体的洗脱液；在第六ph值条件下，将ph响应无规共聚物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；所述第一ph值、第三ph值和第五ph值独立地为4～7.5；所述第二ph值、所述第四ph值和所述第六ph值独立地为8～10。本发明提供的分离纯化方法首先利用ph响应无规共聚物与含有外泌体的生物样品溶液进行均相孵育捕获外泌体；随后，借助ph响应无规共聚物的溶解-沉淀ph响应行为，促使ph响应无规共聚物自组装，与捕获的外泌体一起从溶液中析出，再利用ph响应无规共聚物的ph响应行为通过均相洗涤净化和均相洗脱得到纯化的外泌体，分离效率高，且分离速度快。
[0034]
本发明提供的ph响应无规共聚物该ph响应无规共聚物在外泌体的分离富集中可以通过简单并且快速的调节ph值实现外泌体的纯化，进一步通过离心分离得到纯化外泌
体，具有简单、省时、高效的的特点。
附图说明
[0035]
图1为实施例1中所述方法应用于细胞培养基中外泌体纯化，所得外泌体的透射电镜表征图；
[0036]
图2为实施例1中所述方法应用于细胞培养基中外泌体纯化，所得外泌体的粒径分析图。
具体实施方式
[0037]
本发明提供了一种ph响应无规共聚物，由ph响应功能单体和外泌体特异性识别聚合单体共聚得到；所述外泌体特异性识别聚合单体由外泌体特异性识别功能化单体制备得到，所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、取代苯硼酸、取代多羟基化合物、取代聚乙二醇中的一种或多种。
[0038]
在本发明中，所述ph响应功能单体优选具有酰胺基和/或酯基。
[0039]
在本发明中，所述ph响应功能单体具有式1所示结构或式2所示结构：
[0040][0041]
所述式1中，r1和r2独立的优选为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2(ch2)2ch3、环戊基或环己基；
[0042]
所述式1中，n≥1；
[0043]
所述式1中，r3优选为-h或-ch3；
[0044]
所述式2中，r4优选为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2(ch2)2ch3、环戊基或环己基；
[0045]
所述式2中，r5优选为-h或-ch3。
[0046]
在本发明的具体实施例中，所述ph响应功能单体具体优选为甲基丙烯酸二甲氨基乙酯。
[0047]
在本发明中，所述ph响应功能单体的物质的量占所述外泌体特异性识别聚合单体和ph响应功能单体总物质的量的百分比优选为20～60％，更优选为25～50％。
[0048]
在本发明中，所述外泌体特异性识别聚合单体的制备方法优选包括以下步骤：
[0049]
将外泌体特异性识别功能化单体、烯烃基酰氯、缚酸剂和极性有机溶剂(以下称为第一极性有机溶剂)混合发生亲核取代反应，得到外泌体特异性识别聚合单体；所述外泌体
特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、氨基取代苯硼酸、氨基取代多羟基化合物、氨基取代聚乙二醇中的一种或多种。
[0050]
在本发明中，所述烯烃基酰氯具体优选为丙烯酰氯。
[0051]
在本发明的具体实施例中，所述缚酸剂具体优选为三乙胺。
[0052]
在本发明中，所述第一极性有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)和/或四氢呋喃。
[0053]
在本发明的具体实施例中，所述第一极性有机溶剂优选为无水溶剂。
[0054]
在本发明的具体实施例中，所述外泌体特异性识别功能化单体和烯烃基酰氯的物质的量比优选为1:1。
[0055]
在本发明的具体实施例中，所述缚酸剂和所述烯烃基酰氯的物质的量比优选为2:1。
[0056]
本发明对所述第一极性有机溶剂的用量没有特殊要求，能够确保上述反应原料完全溶解即可。
[0057]
本发明对所述亲核取代反应的具体实施过程没有特殊要求。
[0058]
在本发明中，所述亲核取代反应得到外泌体特异性识别聚合单体粗品。
[0059]
本发明优选对所述外泌体特异性识别聚合单体粗品进行纯化，得到所述外泌体特异性识别聚合单体。
[0060]
在本发明中，所述纯化的具体实施方式优选为柱层析分离。
[0061]
在本发明中，所述ph响应无规共聚物的ph响应区间优选为4～10。
[0062]
本发明提供了上述技术方案所述ph响应无规共聚物的制备方法，包括以下步骤：
[0063]
将所述外泌体特异性识别聚合单体、ph响应功能单体、偶氮引发剂和极性有机溶剂(以下称为第二极性有机溶剂)混合发生自由基共聚合反应，得到所述ph响应无规共聚物。
[0064]
在本发明的具体实施例中，所述ph响应功能单体的响应ph值优选为7.5。
[0065]
在本发明的具体实施例中，所述偶氮引发剂具体优选为偶氮二异丁腈(aibn)。
[0066]
在本发明的具体实施例中，所述外泌体特异性识别聚合单体和ph响应功能单体的物质的量比优选为1:1。
[0067]
在本发明中，所述ph响应功能单体和所述偶氮引发剂的物质的量比优选为1:0.1。
[0068]
在本发明的具体实施例中，所述第二极性有机溶剂具体优选为无水四氢呋喃。
[0069]
本发明对所述第一极性有机溶剂的用量没有特殊要求，能够将进行所述自由基共聚合反应的原料完全溶解即可。
[0070]
在本发明中，所述自由基共聚合反应后得到自由基共聚合反应液，本发明优选对所述自由基共聚合反应液进行后处理，得到所述ph响应无规共聚物。
[0071]
在本发明中，所述后处理优选包括依次进行：有机溶剂沉降、固液分离、有机溶剂洗涤、酸碱溶解沉降和干燥。在本发明中，所述有机溶剂沉降具体优选为甲醇沉降，本发明对所述甲醇的具体用量没有特殊要求。在本本发明中，所述有机溶剂洗涤优选为：依次进行乙醚洗涤和乙醇洗涤。本发明对所述酸碱溶解沉降和干燥没有特殊要求。
[0072]
本发明提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：
[0073]
在第一ph值条件下，将ph响应无规共聚物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行
均相孵育，得到孵育液；所述ph响应无规共聚物为上述技术方案所述ph响应无规共聚物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的ph响应无规共聚物；
[0074]
在第二ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；
[0075]
在第三ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物的混合液；
[0076]
在第四ph值条件下，将净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；
[0077]
在第五ph值条件下，将所述净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有ph响应无规共聚物和外泌体的洗脱液；
[0078]
在第六ph值条件下，将ph响应无规共聚物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；
[0079]
所述第一ph值、第三ph值和第五ph值独立地为4～7.5；所述第二ph值、所述第四ph值和所述第六ph值独立地为8～10。
[0080]
本发明在第一ph值条件下，将ph响应无规共聚物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述ph响应无规共聚物为上述技术方案所述ph响应无规共聚物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的ph响应无规共聚物。
[0081]
在本发明的体实施例中，所述第一ph值具体优选为7。
[0082]
在本发明中，所述ph响应无规共聚物优选以ph响应无规共聚物水溶液使用。
[0083]
在本发明中，所述ph响应无规共聚物水溶液的物质的量浓度优选为0.1mol/l。
[0084]
在本发明中，所述均相孵育的温度优选为4℃。
[0085]
在本发明中，所述均相孵育的保温时间优选为1～2h。
[0086]
在本发明中，所述均相孵育优选在振摇条件下进行。
[0087]
得到孵育液后，本发明在第二ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的ph响应无规共聚物。
[0088]
在本发明的具体实施例中，所述第二ph值具体优选为8。
[0089]
在本发明中，本发明优选采用氨水调节所述孵育液的ph值。
[0090]
在本发明的具体实施例中，所述氨水的质量百分含量具体优选为1％。
[0091]
在本发明中，所述第一固液分离的温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
[0092]
在本发明中，所述第一固液分离优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～8000g，更优选为3500～7000g。
[0093]
在本发明中，所述第一固液分离的时间优选为10～15min。
[0094]
得到捕获有外泌体的ph响应无规共聚物后，本发明在在第三ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物的混合液。
[0095]
在本发明的具体实施例中，所述第三ph值具体优选为7。
[0096]
在本发明的具体实施例中，所述清洗液具体优选为磷酸盐缓冲液，更优选的浓度为10mmol/l。
[0097]
得到混合液后，本发明在在第四ph值条件下，将净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物。
[0098]
在本发明中，所述第四ph值具体优选为8。
[0099]
在本发明中，本发明优选采用氨水调节所述混合液的ph值。
[0100]
在本发明的具体实施例中，所述氨水的质量百分含量具体优选为1％。
[0101]
在本发明中，所述第二固液分离优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～8000g，更优选为3500～7000g。
[0102]
在本发明中，所述第二固液分离的时间优选为10～15min。
[0103]
本发明通过均相洗涤去除初始洗脱液中的非特异性吸附蛋白。
[0104]
本发明优选进行上述均相洗涤3～5次。
[0105]
得到净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物后，本发明在第五ph值条件下，将所述净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有ph响应无规共聚物和外泌体的洗脱液。
[0106]
在本发明中，所述第五ph值具体优选为7。
[0107]
在本发明的具体实施例中，所述洗脱液具体优选为磷酸盐缓冲液(50～500mm)。
[0108]
在本发明的具体实施中，所述洗脱液的物质的量浓度优选为50～100mmol/l。
[0109]
在本发明中，所述洗脱液的温度优选为3～5℃。
[0110]
在本发明中，所述脱附外泌体的保温时间优选为1～2h。
[0111]
得到洗脱液后，本发明在第六ph值条件下，将ph响应无规共聚物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液。
[0112]
在本发明中，所述第六ph具体优选为7.5。
[0113]
在本发明中，所述第三固液分离优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～8000g，更优选为3500～7000g。
[0114]
在本发明中，所述第三固液分离的时间优选为10～15min。
[0115]
本发明通过均相洗脱去除ph响应无规共聚物得到外泌体纯化液。
[0116]
本发明提供外泌体的均相分离纯化方法利用ph响应无规共聚物特异性识别外泌体在均相中实现外泌体的分离纯化。本方法提供的外泌体分离纯化方法能够在均一溶液中完成外泌体的捕获、清洗、洗脱，能够简单、省时、高效的实现外泌体的高特异性、高回收率、高重复性的大规模分离纯化。
[0117]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0118]
实施例1
[0119]
丙烯酰氯(10mmol)与精氨酸(10mmol)在20mmol三乙胺的条件下制备合成共聚合单体b，柱层析得到聚合单体b，在无水四氢呋喃中，取(10mmol)甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(dmaema)为ph响应功能单元(控制响应ph为7.5)，与共聚合单体b(10mmol)，在aibn(0.1mmol)引发下发生自由基共聚合，所得聚合物经甲醇沉降，乙醚洗涤、乙醇洗涤，三次酸碱溶解沉降，得到纯化得聚合物，干燥所得聚合物用于后续外泌体的分离纯化及制备。
[0120]
取5ml人乳腺癌细胞mcf-7细胞培养基(调节ph至7.0)，加入1ml dmaema-精氨酸ph
响应聚合物聚合溶液(ph 7.0，0.1mol/l)，二者混合后于4℃下温和振摇1h，实现外泌体的均相捕获。然后加入1％氨水调节ph至8.0，3000g/min离心10min，得到捕获有外泌体的沉淀，去除上清。向沉淀中加入500μl的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph 7.0)，使沉淀溶解，均相下清洗，去除非特异性吸附蛋白，加入1％氨水调节ph至8.0，3000g/min离心10min，得到清洗后的沉淀，去除上清。重复该洗涤步骤3次。在捕获有外泌体的沉淀中加入50mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph 7.0)，使沉淀溶解，于4℃孵育1h，均相条件下洗脱外泌体。调节ph至7.5，dmaema-精氨酸ph响应聚合物沉淀析出。离心取含有纯化后外泌体的上清，4℃保存备用。
[0121]
纯化后外泌体的电镜图如图1所示。图1结果表明，实施例1提供的纯化分离方法纯化的外泌体结构完整，呈杯状结构，粒径在100nm左右。纯化后外泌体的粒径分析如图2所示。由图2可以看出，所纯化的外泌体粒径主要分布于30～150nm之间。
[0122]
实施例2
[0123]
丙烯酰氯(10mmol)与赖氨酸(10mmol)在20mmol三乙胺的条件下制备合成共聚合单体c，柱层析得到聚合单体c，赖氨酸作为外泌体的特异性识别基团。然后，进行共聚合，在无水四氢呋喃中，取(10mmol)甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(deam)为ph响应功能单元(控制响应ph为7.5)，与共聚合单体c(10mmol)，在aibn(0.1mmol)引发下发生自由基共聚合，所得聚合物经甲醇沉降，乙醚洗涤、乙醇洗涤，三次酸碱溶解沉降，得到纯化得聚合物，干燥所得聚合物用于后续外泌体的分离纯化及制备。
[0124]
实施例3
[0125]
丙烯酰氯(10mmol)与氨基取代苯硼酸(10mmol)在20mmol的三乙胺的条件下制备合成共聚合单体d，柱层析得到聚合单体d，苯硼酸作为外泌体的特异性识别基团。然后，进行共聚合，在无水四氢呋喃中，取(10mmol)2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(dpaema)为ph响应功能单元(控制响应ph为7.5)，与共聚合单体d(10mmol)，在aibn(0.1mmol)引发下发生自由基共聚合，所得聚合物经甲醇沉降，乙醚洗涤、乙醇洗涤，三次酸碱溶解沉降，得到纯化得聚合物，干燥所得聚合物用于后续外泌体的分离纯化及制备。
[0126]
实施例4
[0127]
丙烯酰氯(10mmol)与氨基取代多羟基化合物(10mmol)在20mmol的三乙胺的条件下制备合成共聚合单体e，柱层析得到聚合单体e，多羟基化合物作为外泌体的特异性识别基团。然后，进行共聚合，在无水四氢呋喃中，取(10mmol)2-甲基-2-丙烯酸-2-[(1,1-二甲基乙基)氨]乙酯(tbaema)为ph响应功能单元(控制响应ph为7.5)，与共聚合单体e(10mmol)，在aibn(0.1mmol)引发下发生自由基共聚合，所得聚合物经甲醇沉降，乙醚洗涤、乙醇洗涤，三次酸碱溶解沉降，得到纯化得聚合物，干燥所得聚合物用于后续外泌体的分离纯化及制备。
[0128]
实施例5
[0129]
丙烯酰氯(10mmol)与氨基取代peg(mn＝5000,10mmol)在20mmol的三乙胺的条件下制备合成共聚合单体，柱层析得到聚合单体f，peg作为外泌体的特异性识别基团。然后，进行共聚合，在无水四氢呋喃中，取(10mmol)甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(dmaema)为ph响应功能单元(控制响应ph为7.5)，与共聚合单体f(10mmol)，在aibn(0.1mmol)引发下发生自由基共聚合，所得聚合物经甲醇沉降，乙醚洗涤、乙醇洗涤，三次酸碱溶解沉降，得到纯化得聚合物，干燥所得聚合物用于后续外泌体的分离纯化及制备。
[0130]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
技术特征：1.一种ph响应无规共聚物，其特征在于，由ph响应功能单体和外泌体特异性识别聚合单体共聚得到；所述外泌体特异性识别聚合单体由外泌体特异性识别功能化单体作为原料之一制备得到，所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、取代苯硼酸、取代多羟基化合物、取代聚乙二醇中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的ph响应无规共聚物，其特征在于，所述ph响应功能单体具有酰胺基和/或酯基。3.根据权利要求1或2所述的ph响应无规共聚物，其特征在于，所述ph响应功能单体具有式1所示结构或式2所示结构：所述式1中，r1和r2独立的为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2(ch2)2ch3、环戊基或环己基；所述式1中，n≥1；所述式1中，r3为-h或-ch3；所述式2中，r4为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2(ch2)2ch3、环戊基或环己基；所述式2中，r5为-h或-ch3。4.根据权利要求1所述的ph响应无规共聚物，其特征在于，所述外泌体特异性识别聚合单体的制备方法包括以下步骤：将外泌体特异性识别功能化单体、烯烃基酰氯、缚酸剂和极性有机溶剂混合发生亲核取代反应，得到外泌体特异性识别聚合单体；所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、氨基取代苯硼酸、氨基取代多羟基化合物、氨基取代聚乙二醇中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的ph响应共聚物，其特征在于，所述烯烃基酰氯为丙烯酰氯。6.据权利要求1所述的ph响应无规共聚物，其特征在于，所述ph响应功能单体的物质的量占所述外泌体特异性识别聚合单体和ph响应功能单体总物质的量的百分比为20～60％。7.根据权利要求1～6任一项所述的ph响应无规共聚物，其特征在于，所述ph响应无规共聚物的ph响应区间为4～10。8.权利要求1～7任一项所述ph响应无规共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述外泌体特异性识别聚合单体、ph响应功能单体、偶氮引发剂和极性有机溶剂混
合发生共聚合反应，得到所述ph响应共聚物ph响应无规共聚物。9.一种外泌体的均相分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：在第一ph值条件下，将ph响应无规共聚物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述ph响应无规共聚物为权利要求1～7任一项所述ph响应无规共聚物或权利要求8所述的制备方法制备得到的ph响应无规共聚物；在第二ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；在第三ph值条件下，将捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物的混合液；在第四ph值条件下，将净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物；在第五ph值条件下，将所述净化的捕获有外泌体的ph响应无规共聚物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有ph响应无规共聚物和外泌体的洗脱液；在第六ph值条件下，将ph响应无规共聚物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；所述第一ph值、第三ph值和第五ph值独立地为4～7；所述第二ph值、所述第四ph值和所述第六ph值独立地为7.5～10。10.根据权利要求9所述的均相分离纯化方法，其特征在于，所述第一固液分离分离、第二固液分离和第三固液分离为离心分离，所述第一离心分离、第二离心分离和第三离心分离的速度独立地为3000～8000g。
技术总结本发明属于生物样品分离纯化技术领域，具体涉及一种pH响应无规共聚物及其制备方法、一种外泌体均相分离纯化方法。本发明提供一种pH响应无规共聚物，由pH响应功能单体和外泌体特异性识别聚合单体共聚得到；所述外泌体特异性识别聚合单体由外泌体特异性识别功能化单体作为原料之一制备得到，所述外泌体特异性识别功能化单体包括精氨酸、赖氨酸、取代苯硼酸、取代多羟基化合物、取代聚乙二醇中的一种或多种。本发明提供的pH响应无规共聚物在外泌体的分离富集中可以通过简单并且快速的调节pH值实现外泌体的纯化，进一步通过离心分离得到纯化外泌体。化外泌体。化外泌体。
技术研发人员：张丽媛 潘玉鹏 王秀丽 赵艳艳 董佩佩
受保护的技术使用者：大连医科大学
技术研发日：2022.04.12
技术公布日：2022/7/5
