靶向Keap1-Nrf2-ARE信号通路的化合物、制备方法及其应用

靶向keap1-nrf2-are信号通路的化合物、制备方法及其应用
技术领域
1.本技术涉及keap1-nrf2-are信号通路技术领域，尤其涉及靶向keap1-nrf2-are信号通路的化合物、制备方法及其应用。


背景技术：

2.氧化应激对于所有生命系统都是至关重要的，尤其是其广泛参与神经系统的病理生理变化过程，例如脑缺血再灌注损伤是氧化应激的急性表现，慢性氧化应激是神经性退行性疾病发生发展的重要原因。
3.keap1-nrf2-are是迄今研究的最为重要的自身抗氧化应激通路。生理条件下，nf-e2相关因子2(nf-e2-related factor 2，nrf2)在细胞质中与kelch样ech相关蛋白1(kelch-like ech-associated proteinl，keapl)结合，并通过keapl蛋白将其锚定于由肌动蛋白构成的细胞骨架上，从而无法进入细胞核发挥转录活性；当受到亲电试剂、活性氧簇(reactive oxygen species，ros)的刺激时，keapl受到刺激作用解离与nrf2偶联，从而释放nrf2以转移进入细胞核，nrf2与细胞核基因中的maf蛋白结合成异二聚体后识别抗氧化反应元件(antioxident response element，are)，以启动下游且相解毒酶、抗氧化蛋白白类、泛素酶以及蛋白酶体的基因表达，从而提高细胞抗氧化应激能力。
4.因此，通过调控keap1-nrf2-are信号通路能够调控其下游基因的表达，以达到预防和/或治疗氧化应激所致的神经性退行性疾病的目的。现有技术中，绝大部分的keap1-nrf2-are信号调节剂是keap1-nrf2-are相互作用间接抑制剂，它们通过同keapl上的巯基官能团反应，与半胱氨酸残基共价结合，导致keap1结构发生变化，从而使得keap1-nrf2复合体相互作用被破坏，nrf2被激活以释放。基于调节剂的结构以及同半胱氨酸反应的类型，keap1-nrf2相互作用间接抑制剂被分成迈克尔加成受体、可氧化双酚类、异硫氰酸酷类、二硫杂环戊烯硫酮及二烯丙基硫类、多烯化合物等类型。现有keap1-nrf2-are信号调节剂直接与keap1共价结合而对keap1的结构造成破坏，可能对keap1-nrf2-are信号通路造成不可逆的破坏作用，从而使得其功效性和安全性受到限制。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术的目的在于寻找新型的keap1-nrf2-are信号通路的调节剂，以一定程度上克服现有技术所具有的缺陷之一。
6.第一方面，本技术实施例公开了一种靶向keap1-nrf2-are信号通路的化合物，包括具有如式i和/或ii
所示的化合物，所述化合物的立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐；其中，r1、r2独立地选自氢原子或碳原子不大于3的烷基。
7.在本技术实施例中，r1、r2独立地选自氢原子。
8.第二方面，本技术实施例公开了一种keap1-nrf2-are信号通路的调节剂，包括第一方面所述的化合物、或其组合物以及药学上可接受的辅料。
9.在本技术实施例中，所述药学上接受的辅料包括稀释剂、载体和赋形剂中的至少一项。
[0010]“赋形剂”是指是指参与赋予药物组合物形式或稠度的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。每种赋形剂在混合时必须与药物组合物的其他成分相容，从而避免了相互作用，这种相互作用在施用于患者时会大大降低本发明化合物的功效，并且避免了会导致药物组合物不被药学上可接受的相互作用。另外，每种赋形剂必须具有足够高的纯度以使其药学上可接受。
[0011]
合适的药学上可接受的赋形剂将根据所选的特定剂型而变化。另外，可以针对它们可以在组合物中使用的特定功能来选择合适的药学上可接受的赋形剂。例如，可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们具有促进产生均匀剂型的能力。可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们具有产生稳定剂型的能力。可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们一旦施用于患者从一个器官或身体的一部分到另一器官或身体的另一部分，便易于携带或运输本发明的一种或多种化合物。可以选择某些药学上可接受的赋形剂，因为它们具有增强患者依从性的能力。
[0012]
合适的药学上可接受的赋形剂包括以下类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、制粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、风味掩蔽剂、着色剂、抗结块剂、湿润剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。如本领域技术人员将理解的是，取决于制剂中存在多少赋形剂以及制剂中存在什么其他成分，某些药学上可接受的赋形剂可以起到多于一种功能并且可以起到替代的功能。
[0013]
本技术实施例提供的keap1-nrf2-are信号通路的调节剂可以为适于以下方式使用的形式：口服使用(例如作为片剂、胶囊剂、囊片、药丸、锭剂、散剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂，药袋和扁囊剂)，局部使用(例如作为霜剂、软膏剂、乳液、溶液、糊剂、喷雾剂、泡沫和凝胶)，经皮施用(例如通过透皮贴剂)，通过吸入施用(例如作为干粉、气雾剂、悬浮液和溶液)，通过吹入施用(例如作为细粉)或肠胃外施用(例如作为用于静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或肌肉内给药的无菌水性或油性溶液剂，或者作为用于直肠给药的栓剂)。
[0014]
第三方面，本技术实施例公开了第一方面所述化合物的制备方法，包括：
[0015]
获得含有青霉菌hubu 0120的菌落和含有赭曲霉菌的菌落；
[0016]
将所述菌落接种至发酵培养基进行发酵，以获得发酵液；以及对所述发酵液进行提取分离，以得到所述化合物；
[0017]
其中，青霉菌(penicillium sp.)hubu 0120，于2021年4月保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctcc m2021412；赭曲霉菌(aspergillus ochraceus)，共享自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏号：mccc 3a00521。
[0018]
在本技术实施例中，含有青霉菌hubu 0120的菌落和含有赭曲霉菌的菌落分别是
接种至pda培养皿于25℃培养得到的。
[0019]
在本技术实施例中，所述发酵培养基包含0.4g/ml大米、0.8wt％氯化钠、0.5wt％氯化钾和0.8wt％硫酸镁。
[0020]
在本技术实施例中，所述提取分离的步骤具体包括：
[0021]
获得第一浸膏，所述第一浸膏是将所述发酵液经过乙酸乙酯提取，并经减压浓缩和硅胶层析纯化得到；
[0022]
获得第二浸膏，所述第二浸膏是将所述第一浸膏上样硅胶层析柱、分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行洗脱，并收集二氯甲烷馏分进行减压浓缩得到；
[0023]
获得第一组分，将所述第二浸膏上样至硅胶层析柱，以包含二氯甲烷和甲醇的洗脱液进行梯度洗脱，根据依次出峰顺序，选自其中第四个洗脱峰对应的馏分即为所述第一组分；
[0024]
获得第二组分，将所述第一组分上样至中压反相色谱柱，以包含甲醇和水的洗脱液进行梯度洗脱，根据出峰顺序，选自其中第四个洗脱峰对应的馏分即为所述第二组分；
[0025]
获得第三组分，将所述第二组分上样至高压反相色谱柱，以包含甲醇和水的洗脱液进行梯度洗脱，根据出峰顺序，依次得到化合物1和化合物2的馏分，对馏分分别进行浓缩和干燥，即可得到化合物1和化合物2。
[0026]
第四方面，本技术实施例还公开了第一方面所述的化合物在制备靶向keap1-nrf2-are的预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。
[0027]
与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
[0028]
1、本技术采用青霉菌和赭曲霉菌进行共培养，对其沉默的生物合成基因进行表观遗传调控，对发酵液中的合成次生代谢产物进行提取分离，得到了化合物1和化合物2。
[0029]
2、本技术进一步通过药理活性实验结果表明化合物1和2可明显恢复h2o2诱导损伤的sh-sy5y细胞活性，对氧化损伤的sh-sy5y细胞保护作用在0～50μm范围内呈剂量依赖，且对未损伤细胞无明显毒性。并且，新化合物2在50μm的浓度下的神经保护作用优于阳性药tbhq，提示化合物2可以预期发展成为治疗神经退行性疾病的有关药物。
[0030]
3、本技术还进一步对化合物2的抗神经退行性改变活性进行了机制研究，发现化合物2可通过靶向keap1-nrf2-are发挥调节作用。化合物2减弱了ros的积累，增加了gsh水平，抑制了keap1蛋白和mrna的表达，增强了核内nrf2蛋白的表达，然后上调了ho-1和nqo1蛋白及其mrna的表达，最终表现为减少氧化应激带来的损伤与神经退行性改变的发生。
[0031]
4、为此，本技术实施例进一步通过分子对接实验证实了，化合物2可与keap1结合形成氢键和部分疏水键作用，其结合方式为非共价结果的可逆方式，对keap1结合具有可逆性。并通过动力学模拟实验证实了化合物2-keap1结合复合体在模拟生理环境下的结构稳定性。由此提示，化合物2可作为有别于现有技术的nrf2，其通过与keap1非共价结合的方式，不仅能够实现调控keap1-nrf2-are信号通路的功能，还能够不破坏keap1结构，其安全性得到提升。
附图说明
[0032]
图1为本技术实施例提供的青霉菌-赭曲霉菌共培养平板图。
[0033]
图2为本技术实施例提供的化合物1和化合物2的分子结构。
[0034]
图3为本技术实施例提供的获得第三组分的流程示意图。
[0035]
图4为本技术实施例提供的化合物1和2对h2o2诱导损伤的sh-sy5y细胞处理实验结果图；a是化合物1和2以及阳性药tbhq对sh-sy5y细胞的细胞毒性结果；b是化合物1和2以及阳性药tbhq对h2o2诱导损伤的sh-sy5y细胞的保护作用结果；c是化合物1和2以及阳性药tbhq对h2o2诱导损伤的sh-sy5y细胞作用的微观图；d是化合物2对神经细胞内ros产生的影响结果图；e是化合物2对神经细胞内gsh水平的影响结果图。
[0036]
图5为本技术实施例提供的化合物2靶向keap1-nrf2的抗神经退行性改变实验结果；a是荧光显微镜下化合物2对神经细胞中nrf2的核转位影响的微观图；b是化合物2对神经细胞细胞核和细胞质中nrf2水平的影响结果图；c是化合物2对神经细胞中keap1、oh-1和nqo1蛋白水平的影响结果图；d-f是化合物2对神经细胞中keap1、oh-1和nqo1的mrna表达的影响结果图。
[0037]
图6为化合物2和与keap1之间分子对接的可视化结果图；左图为化合物2-keap1复合体的整体透视图；右图为化合物2对接keap1口袋位置的放大图像(上图：3d图形；下图：2d图形)。
[0038]
图7为自然生理条件下化合物2-keap1复合体的分子动力学模拟分析；a为复合体随时间变化的构象稳定性的rmsd值变化趋势图；b为复合体中蛋白质主链原子的rmsf值、主链rmsf值和侧链rmsf值变化趋势图。
具体实施方式
[0039]
为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
[0040]
下面将结合本技术实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0041]
如式i或式ii所示的化合物的制备
[0042]
1、菌株
[0043]
本技术实施例公开的如式i或式ii所示的化合物是通过真菌发酵培养，以提取分离其次级代谢产物而得到的。
[0044]
其中涉及的菌种由以下来源：青霉菌，拉丁文名称penicillium sp.hubu 0120，保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctcc m2021412；赭曲霉，拉丁文名称aspergillus ochraceus，共享自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏号：mccc 3a00521。
[0045]
2、平板培养
[0046]
按照如下所述配方比例配置培养基，操作步骤如下：
[0047]
(1)将称量好的pda、海盐、蛋白粉和二次水倒入蓝盖瓶内，用naoh调节ph至7.0，放入灭菌锅设置121℃、30min。
[0048]
(2)照紫外30min灭菌，待冷却至约50℃，加入抗生素和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(烟酰胺)，倒平板。
[0049]
(3)照紫外15min，待培养基完全凝固后接菌将青霉(penicillium sp.)hubu 0120
(cctcc m2021412)和赭曲霉((aspergillus ochraceus)，mccc 3a00521)按照5:1的重量比例用平板划线法接种到培养基中，培养1周后，即可得到平板菌落。
[0050]
培养基配方为：13.9g海盐、10g蛋白粉、23.0mgpda、15mg左氧氟沙星、40.71mg烟酰胺、500ml水。
[0051]
3、发酵
[0052]
将上述培养得到的平板菌落如图1所示，切块得到含有菌落的琼脂块，按照5wt％(占发酵培养基的重量百分比)的接种比例将琼脂块接种至灭菌的发酵培养基中，发酵培养基包含0.4g/ml大米、0.8wt％(重量百分比)氯化钠、0.5wt％氯化钾和0.8wt％硫酸镁，在25℃下发酵30天。
[0053]
4、提取与分离
[0054]
(1)获得第一浸膏
[0055]
发酵结束后用乙酸乙酯提取六次得到发酵液，然后通过减压回收溶剂得到第一浸膏400g。
[0056]
(2)获得第二浸膏
[0057]
将第一浸膏用正相硅胶拌样，分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行洗脱，二氯甲烷部位减压回收溶剂后得到第二浸膏100g。
[0058]
(3)获得第一组分
[0059]
将第二浸膏用正相硅胶拌均后，以二氯甲烷-甲醇(300:1
→
10:1)进行梯度洗脱，通过tlc检测合并相同组分后，得到7个流分依次命名为fr.1-fr.7；其中，组分fr.4(10g)为第一组分。
[0060]
(4)获得第二组分
[0061]
将第一组分经过中压反相色谱，以甲醇-水(10:90
→
100:0)梯度洗脱后分为fr4.1-fr4.6共计6个亚组分，其中fr.4.4(2g)为第二组分。
[0062]
(5)获得第三组分
[0063]
运用sephadex lh-20凝胶柱将fr.4.4(2g)最终纯化为5个组分，并命名为fr.4.4.1-fr.4.4.5。其中fr4.4.2(400mg)组分经高效液相色谱法，运用反相色谱柱(c
18
柱，流动相:乙腈:水＝45:55，2ml/min)制备得到化合物1以及化合物2(如图2所示)。以上从fr.4获得化合物1和2的流程示意图如图3所示，图中化合物17、化合物18分别对应于本技术实施例中的化合物1和化合物2。
[0064]
如式i或式ii所示的化合物的结构鉴定
[0065]
1、核磁共振
[0066]
经过nmr(核磁共振)、计算
13
c-nmr、计算ecd(电子圆二色谱)和x-ray(x-单晶衍射)方法得到了化合物1与化合物2的绝对构型。
[0067]
asperpenazine(化合物1)：亮黄色针状结晶；[α]-283.4(c 0.53,ch3oh)；uv(ch3oh)λ
max
(logε)＝227(4.77),272(4.03)nm；ir(kbr)ν
max 3279,3059,2963,1679,1450,1327cm
–1；ecdλ
max
(δε)216(-12.16),269(-3.62)nm；hresims[m+na]
+
m/z 374.1903(计算值c
21h25
n3o2na,374.1839)；1h和
13
c nmr数据，见表1。
[0068]
asperpendoline(化合物2)：黄绿色粉末；[α]+96.8(c 0.24,ch3oh)；uv(ch3oh)λ
max
(logε)＝238(4.61)，399(3.73)nm；ir(kbr)ν
max 3215,2926,1722,1685,1583,1466,1441,
sy5y细胞均无明显细胞毒作用。
[0079]
3、化合物1和化合物2对氧化损伤的sh-sy5y细胞活力影响
[0080]
将sh-sy5y细胞按照1
×
106cells/孔的浓度接种细胞培养板的100μl的dmem培养基中，同时加入350μm 100μl的h2o2溶液，培养6h，以作为模型组；取100μlsh-sy5y细胞接种在96孔板上的100μl的dmem培养基中，培养24小时后，作为正常组；另设，空白组，孔板中仅添加100μl新鲜培养基；采用上述相同的方法构建h2o2溶液损伤的模型细胞液，向其中加入10μm tbhq、5μm、10μm、25μm或50μm的化合物1或2，分别继续培养6h；分别同时添加10μl cck-8溶液后，将细胞进一步在培养箱中在黑暗中培养2h，在450nm处记录吸光度(od)值。通过以下公式计算细胞活力：细胞活力％＝[od(实验组)
–
od(空白组)/od(正常组)
–
od(空白组)]
×
100％。模型组的细胞活力％＝[od(模型组)
–
od(空白组)/od(正常组)
–
od(空白组)]
×
100％。
[0081]
结果如图4b所示，通过对cck-8法数据分析发现，化合物1和2在5-50μm范围内呈剂量依赖性地保护sh-sy5y细胞免受氧化损伤；且化合物2对损伤的细胞存活率恢复水平高于阳性药物tbhq。
[0082]
4、化合物2对氧化损伤的sh-sy5y细胞中ros含量影响
[0083]
通过ros测定试剂盒(ab113851，abcam)以dcfh-da作为探针测定各组细胞的细胞内ros水平。在各组处理24小时后，洗涤细胞，然后用稀释的dcfh-da溶液染色。在黑暗中保持20分钟。使用荧光显微镜观察和拍摄细胞。记录每组的积分od值以表达荧光强度。结果如图4c、3d所示，荧光拍照和正常情况下拍照显示，随着化合物2的浓度增大，神经细胞的死亡数量显著减少，由此说明化合物2在10-50μm范围内呈剂量依赖性的减少了神经细胞中ros的产生。
[0084]
5、化合物2对氧化损伤的sh-sy5y细胞中gsh含量的影响
[0085]
通过gsh elisa测定试剂盒(货号qy-mb11514，乔羽生物)测定各组细胞中产生的gsh。结果如图4e所示，化合物2在10-50μm范围内呈剂量依赖性的恢复了神经细胞中gsh的水平。
[0086]
化合物2靶向keap1-nrf2-are信号的机制研究
[0087]
根据上述实施例的研究结果，对氧化损伤的sh-sy5y细胞具有更佳保护作用的化合物2开展进一步实验。采用免疫荧光测定的方法检测细胞中nrf2的核转位情况；采用蛋白质免疫印迹和荧光定量逆转录pcr检测keap1，ho-1和nqo1的蛋白质和mrna表达水平。
[0088]
1、化合物2对细胞中nrf2的核转位影响：
[0089]
将sh-sy5y细胞按照1
×
106cells的浓度接种细胞培养板的100μl的dmem培养基中，分为阳性组和阴性组。阳性组的细胞液添加50μm10μl的化合物2，阴性组不添加，继续培养24小时后，用多聚甲醛(4％)固定20分钟；然后用0.1％triton x-100连续透化细胞，用pbs洗涤，并用bsa(牛血清白蛋白，5％)封闭，用抗nrf2的一抗(ab31163，abcam)和二抗(货号kfs256，百奥莱博)处理后，细胞最后用dapi染色。结果如图5a所示，用荧光显微观察，结果表明化合物2(50μm)处理后明显增加了nrf2在细胞核中绿色荧光的易位。
[0090]
2、化合物2对细胞核和细胞质中nrf2水平的影响
[0091]
将sh-sy5y细胞按照1
×
106cells/孔的浓度接种细胞培养板的100μl的dmem培养基中，分为模型组和实验组。模型组细胞添加350μm 100μl的h2o2溶液，培养6h，以作为模型
组；实验组细胞添加350μm 100μl的h2o2溶液、以及10μl 10μm、25μm或50μm化合物2，共培养6h，以作为实验组；另外设置进行氧化损伤和化合物2处理的细胞液作为正常组。
[0092]
将上述各组实验得到的细胞液，分别取100μl。取50μl，以12000rpm转速离心5min后，取沉淀用ripa细胞裂解液裂解后，以12000rpm离心5min，采用nrf2 wb检测试剂盒(wb9151-pab30175，bioswamp)检测细胞核内nrf2含量，以histone h3作为内参；另外取50μl，12000rpm离心5min后取上清液，采用wb检测试剂盒检测细胞核外nrf2含量，以β-actin作为内参。结果如图5b所示，化合物2在10～50μm范围提高了nrf2在h2o2诱导的sh-sy5y中细胞核与细胞质的表达，且呈剂量依赖性。
[0093]
取50μl上述方法处理实验各组得到的细胞液，2000rpm离心5min后取上清液，采用wb检测试剂盒以及按照wb检测常规方法和步骤检测细胞核外keap1(货号ih-4900r，雅吉生物)、ho-1(wb抗体，货号cy-23397r，上海彩佑)和nqo1(wb抗体，货号cy-23407r，上海彩佑)含量。结果如图5c所示，化合物2在0～50μm范围内以剂量依赖性的方式降低了h2o2诱导的sh-sy5y细胞中keap1的含量；同时以剂量依赖性的方式提高了ho-1和nqo1的含量。
[0094]
取50μl上述方法处理实验各组得到的细胞液，2000rpm离心5min后取细胞沉淀，用tripure总rna提取试剂(科鹿(武汉)生物科技有限公司)提取细胞中总rna，通过entilink
tm
逆转录酶试剂盒(科鹿(武汉)生物科技有限公司)逆转录后对cdna进行检测。根据enturbotm sybr green pcr supermix试剂盒(科鹿(武汉)生物科技有限公司)的荧光定量逆转录pcr实验在steponetm实时pcr检测系统上进行。结果如图5d、4e、4f所示，化合物2在10-50μm范围呈剂量依赖性的抑制了keap1的mrna的表达水平(图5d)，然后上调了ho-1和nqo1的mrna的表达水平(图5e-5f)。
[0095]
化合物2与keap1结合作用研究
[0096]
1、方法
[0097]
(1)分子对接
[0098]
使用autodock4.2.6与mgltools1.5.6(adt)对化合物2和keap1(pdb id：1x2r)之间的结合倾向进行了分子对接研究。对接程序的细节参照“identification of anti-parkinson's disease lead compounds from aspergillus ochraceus targeting adenosin receptors a
2a
[j]chemistryopen 2021,10,630
–
638”公开的方法进行。网格盒大小的坐标通过autogrid程序确定，并指定为126
×
126
×
126(x、y和z)坐标点，中心尺寸为-23.558
×‑
4.445
×
12.356，以及网格间距设置为使用adt程序的默认参数执行化合物2和keap1之间的对接。
[0099]
(2)分子动力学模拟
[0100]
参照上述文献公开的方法对keap1结合化合物2的分子动力学进行模拟，采用discovery studio 2020中的标准动力学模块进行了测试。测试条件为：对2-keap1复合体加上一个charmm力场，然后使用默认参数对复合体的溶剂化模块进行模拟人体内自然生理环境；最后在32个处理器、平衡时间为200ps和2000ps的生产时间下进行了标准的动态级联程序，其他参数被设置为程序的默认值。
[0101]
2、结果
[0102]
如上述结果可知，化合物2可能靶向keap1-nrf2来调节nrf2信号通路，实现对sh-sy5y神经细胞免受氧化应激。因此，本技术进一步通过分子对接和分子动力学模拟来预测
化合物2和keap之间的结合特性。
[0103]
采用autodock4.2.6与mgltools1.5.6(adt)进行虚拟对接，结果显示2与keap1对接具有较高的负亲合能(-8.46kcal/mol)和较低的抑制常数(ki)(632.06nm)。
[0104]
通过pymol分子图形系统2.4和discovery studio 2020(ds20)可视化了2-keap1复合体的结合情形。结果如图6所示，化合物2与蛋白keap1非共价的方式，能够形成典型的氢键的氨基酸残基为val608、val369、val418、val465和val467，以及各自形成氢键的键长分别对应为分别对应为和能够形成疏水作用的氨基酸残基为cys513、ala466和val420。
[0105]
为了检验对接的化合物2-keap1复合体在人体正常生理环境下的稳定性，本技术进一步采用ds20的分子动力学模拟(mds)程序计算了2-keap1复合体的构象稳定性随时间变化的均方根偏差(rmsd)和蛋白质主链氨基酸残基的均方根波动(rmsf)。结果如图7a所示，左图：化合物2和蛋白keap1结合时，在模拟正常生理条件下，200-2200ps内，蛋白-化合物复合体的构象没有太大变化，平均rmsd值在如图7b所示，在自然生理条件下，化合物2-keap1复合体的氨基酸残基也没有太大波动，蛋白-化合物复合体的rmsd、rmsf、主链rmsf和侧链rmsf的平均值分别为和由此说明，在模拟正常生理条件下，对接的蛋白keap1-化合物2复合体较为稳定，构象波动及氨基酸残基涨落均较小。
[0106]
综上所述：
[0107]
1、本技术采用青霉菌和赭曲霉菌进行共培养，对其沉默的生物合成基因进行表观遗传调控，对发酵液中的合成次生代谢产物进行提取分离，得到了化合物1和2。
[0108]
2、本技术进一步通过药理活性实验结果表明化合物1和2可明显恢复h2o2诱导损伤的sh-sy5y细胞活性，对氧化损伤的sh-sy5y细胞保护作用在0～50μm范围内呈剂量依赖，且对未损伤细胞无明显毒性。并且，新化合物2在50μm的浓度下的神经保护作用优于阳性药tbhq，提示化合物2可以预期发展成为治疗神经退行性疾病的有关药物。
[0109]
3、本技术还进一步对化合物2的抗神经退行性改变活性进行了机制研究，发现化合物2可通过靶向keap1-nrf2-are发挥调节作用。化合物2减弱了ros的积累，增加了gsh水平，抑制了keap1蛋白和mrna的表达，增强了核内nrf2蛋白的表达，然后上调了ho-1和nqo1蛋白及其mrna的表达，最终表现为减少氧化应激带来的损伤与神经退行性改变的发生。
[0110]
4、为进一步证实化合物2对keap1-nrf2-are信号的调节机制，，本技术实施例进一步通过分子对接实验发现化合物2可与keap1结合形成氢键和部分疏水键作用，其结合方式为非共价结果的可逆方式，对keap1结合具有可逆性。并通过动力学模拟实验证实了化合物2-keap1结合复合体在模型生理环境下的结构稳定性。由此提示，化合物2可作为有别于现有技术的nrf2，其通过与keap1非共价结合的方式，不仅能够实现调控keap1-nrf2-are信号通路的功能，还能够避免破坏keap1的结构，这使得本技术实施例公开的化合物在作为keap1-nrf2-are信号通路的调节剂或者keapl的刺激剂时具有更高的生物安全性。
[0111]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种靶向keap1-nrf2-are信号通路的化合物，包括具有如式i和/或ii所示的化合物，或者所述化合物的立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐；其中，r1、r2独立地选自氢原子或碳原子不大于3的烷基。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，r1、r2独立地选自氢原子。3.一种keap1-nrf2-are信号通路的调节剂，包括权利要求1或2所述的化合物、或其组合物以及药学上可接受的辅料。4.根据权利要求3所述的keap1-nrf2-are信号通路的调节剂，其特征在于，所述药学上接受的辅料包括稀释剂、载体和赋形剂中的至少一项。5.权利要求1或2所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：获得含有青霉菌hubu 0120的菌落和含有赭曲霉菌的菌落；将所述菌落接种至发酵培养基进行发酵，以获得发酵液；以及对所述发酵液进行提取分离，以得到所述化合物；其中，青霉菌(penicillium sp.)hubu 0120，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctcc m2021412；赭曲霉菌(aspergillus ochraceus)，共享自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏号：mccc 3a00521。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，含有青霉菌hubu0120的菌落和含有赭曲霉菌的菌落是接种至pda培养皿于25℃培养得到的。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包含0.4g/ml大米、0.8wt％氯化钠、0.5wt％氯化钾和0.8wt％硫酸镁。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述提取分离的步骤具体包括：获得第一浸膏，所述第一浸膏是将所述发酵液经过乙酸乙酯提取，并经减压浓缩和硅胶层析纯化得到；获得第二浸膏，所述第二浸膏是将所述第一浸膏上样硅胶层析柱、分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行洗脱，并收集二氯甲烷馏分进行减压浓缩得到；获得第一组分，将所述第二浸膏上样至硅胶层析柱，以包含二氯甲烷和甲醇的洗脱液进行梯度洗脱，根据依次出峰顺序，选自其中第四个洗脱峰对应的馏分即为所述第一组分；获得第二组分，将所述第一组分上样至中压反相色谱柱，以包含甲醇和水的洗脱液进行梯度洗脱，根据出峰顺序，选自其中第四个洗脱峰对应的馏分即为所述第二组分；获得第三组分，将所述第二组分上样至高压反相色谱柱，以包含甲醇和水的洗脱液进行梯度洗脱，根据出峰顺序，依次得到化合物1和化合物2的馏分，对馏分分别进行浓缩和干燥，即可得到化合物1和化合物2。
9.权利要求1或2所述的化合物、或者权利要求5～8任一项所述的制备方法制得的化合物在制备靶向keap1-nrf2-are信号通路的预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用。

技术总结
本申请公开了靶向Keap1-Nrf2-ARE信号通路的化合物、制备方法及其应用。通过对青霉菌和赭曲霉菌进行共培养，对其发酵液中的次生代谢产物进行提取分离而得到该化合物。该化合物不仅对神经细胞无毒性作用，还能对氧化损伤的神经细胞呈现保护作用。其具体是通过靶向Keap1-Nrf2-ARE信号通路发挥对神经细胞的保护作用的，并且该化合物是通过对Keap1结合形成氢键和部分疏水键的非共价结合方式实现对该信号通路的调节作用的，不仅能够实现Nrf2的激活释放，还能避免Keap1的结构受到破坏，使得该化合物靶向Keap1-Nrf2-ARE信号通路的安全性得以提升。性得以提升。性得以提升。


技术研发人员：胡琳珍 童周 肖雪洋 孔璐琦 胡天卉 盘诗湘 汪钰钏
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：2022.02.23
技术公布日：2022/7/5