腺病毒载体及其用途

腺病毒载体及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月3日提交的美国临时申请62/909,853的优先权，其公开内容整体援引加入本文。
技术领域
3.本发明涉及生物技术。特别地，涉及腺病毒载体领域和用途，如复制缺陷型腺病毒载体以递送抗原并在宿主中诱发免疫应答。
4.电子提交的序列表的引用
5.本技术包含序列表，其通过efs-web以ascii格式的序列表电子提交，文件名“004852.120wo1 sequence listing”，创建日期2020年8月13日，大小为262kb。通过efs-web提交的序列表是本说明书的一部分，并且其整体援引加入本文。


背景技术：

6.重组腺病毒载体广泛地应用于基因治疗性应用和疫苗。已证明基于adv-5载体的疫苗能在各种动物模型中诱发有效和保护性的免疫应答(参见，例如，wo2001/02607；wo2002/22080；shiver et al.,nature 415:331(2002)；letvin et al.,ann.rev.immunol.20:73(2002)；shiver and emini,ann.rev.med.55:355(2004))。然而，基于adv-5载体的重组疫苗的效用可能被人群中adv-5特异性中和抗体(nab)的高血清流行率所限制。已证明抗adv-5免疫的存在会大大抑制小鼠、恒河猴和人研究中基于adv-5的疫苗的免疫原性。
7.一种在先前用最常见的人腺病毒(例如adv-5)感染或治疗的个体中规避预先存在的免疫的存在的有前景的策略涉及由不与这种预先存在的免疫遭遇(encounter)的腺病毒血清型开发重组载体。其中一个策略是基于使用嵌合腺病毒，其包括用有低的(或没有)血清流行率的腺病毒的衣壳蛋白序列(例如六邻体和/或纤维蛋白序列)替换原生的衣壳蛋白序列(例如六邻体和/或纤维蛋白序列)。
8.因此，本领域需要可大量生产的替代的腺病毒载体，所述载体不与宿主中预先存在的免疫遭遇，但仍具有免疫原性，并且能够诱导针对插入载体中的异源核酸所编码的抗原的强烈免疫应答。


技术实现要素：

9.本文提供一种分离的核酸序列，其编码嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物。所述嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物可以包含：例如，纤维多肽，其具有与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；六邻体多肽，其具有与seq id no:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；以及五邻体多肽，其具有与seq id no:13的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，纤维多肽序列包含seq id no:11的氨基酸序列。在某些实施方案中，六邻体多肽序列包含seq id no:12的氨基酸
序列。在某些实施方案中，五邻体多肽包含seq id no:13的氨基酸序列。
10.本文还提供包含本文所述的分离的核酸的载体。在某些实施方案中，所述载体是腺病毒载体。
11.在某些实施方案中，所述腺病毒载体进一步包含e1缺失。在某些实施方案中，所述腺病毒载体进一步包含e3缺失。在某些实施方案中，所述腺病毒载体是嵌合腺病毒载体，所述嵌合腺病毒载体包含一种或多种来自人腺病毒-4、人腺病毒-5、人腺病毒-26或人腺病毒-35中至少一种的腺病毒核酸序列。所述腺病毒载体可以包含，例如，人腺病毒-5(hadv-5)e4 orf6。在某些实施方案中，所述腺病毒载体可以包含，例如，选自seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10的核酸序列。
12.在某些实施方案中，所述腺病毒载体进一步包含至少一种转基因。在某些实施方案中，所述至少一种转基因位于e1缺失处、e3缺失处和/或邻近右末端反向重复(right inverted terminal repeat)(ritr)处。
13.本发明还提供重组细胞，其包含本文所述的腺病毒载体。本发明还提供生产所述腺病毒载体的方法。所述方法包括(a)使本文所述的重组细胞在生产腺病毒载体的条件下生长；和(b)从所述重组细胞中分离所述腺病毒载体。
14.本发明还提供药物组合物，其包含本文所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂。
15.本发明还提供在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法。所述方法包括向所述受试者给药本文所述的药物组合物。
16.本发明还提供生产药物组合物的方法，所述方法包括将本文所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。
17.本发明还提供在有需要的受试者中表达转基因的方法。所述方法包括(a)鉴别需要表达的转基因的受试者；(b)使所述受试者与本文所述的包含转基因的腺病毒载体接触；和(c)在所述受试者中表达所述转基因。在某些实施方案中，有需要的受试者中转基因的表达治疗或预防疾病或者病症。在某些实施方案中，使受试者与载体接触可以包括，例如，从所述受试者分离细胞，和使所述细胞与所述载体接触。所述受试者可以是，例如，人受试者。
附图说明
18.当结合附图阅读时，会更好地理解前述概述以及本技术的优选实施方案的以下详细描述。但是，应当理解本技术不限于附图中示出的确切的实施方案。
19.图1示出ad20-42-42野生型病毒(seq id no:1)的全基因组图。
20.图2示出腺病毒载体基因组的构建的示意图。
21.图3示出接头质粒中多克隆位点(mcs)的示意图。
22.图4示出接头质粒padapt20-42-42.empty的示意图。
23.图5示出中间质粒pbr.ad20-42-42.sbfi final interm的示意图。
24.图6示出右端质粒pbrad20-42-42srfl-ritr.de3.5orf6的示意图。
25.图7a-7b示出ad20-42-42.fluc诱导的细胞免疫应答。图7a示出免疫接种方案的示意图。图7b示出展示ad20-42-42.fluc诱导的细胞免疫应答的图。
26.图8示出在ad20-42-42和ad26载体之间没有观察到大的交叉中和。
27.图9示出展示不同腺病毒构建体在人受试者中血清流行率结果的图。
28.图10示出展示ad20-42-42、had5和had35载体的转导潜力的图。萤光素酶表达以相对光单位(rlu)每毫克(mg)蛋白表示。
29.图11示出用ad5lacz和ad20-42-42lacz转导的细胞的代表性lacz染色。用三种载体剂量进行转导：10,000、5000和1,000个病毒颗粒(vp)每细胞，添加fx。
30.图12a-12b示出展示表达或缺乏car或者唾液酸的cho细胞和表达或缺乏桥粒芯糖蛋白2(dsg2)的tc1细胞的hadv5和ad20-42-42转导的图。
31.图12c-12d示出展示缺乏(阴性)或表达cd46不同异构体(bc1、bc2、c1、c2)的cho细胞的hadv5和ad20-42-42转导的图。
32.图13示出编码萤光素酶的hadv5和ad20-42-42在小鼠体内的分布。小鼠在没有(cl-；右上和右下图)或有(cl+；左上和左下图)氯膦酸钠处理的情况下进行预处理，并静脉注射每种载体。对照组动物用磷酸盐缓冲盐水(pbs)进行注射。萤光素酶表达从低到高。
33.图14a-d示出adv载体(分别为hadv-5和ad20-42-42)的定量。示出在没有(cl-；图14a和14c)或有(cl+；图14b和14d)氯膦酸钠的情况下，小鼠静脉转导后的dna拷贝数。通过qpcr对载体基因组进行定量。
具体实施方式
34.本公开至少部分基于分离嵌合腺病毒载体，其包含嵌合衣壳多肽或其功能性衍生物，其中所述嵌合衣壳多肽包含来自第一腺病毒(例如，人腺病毒-42)的纤维和六邻体多肽，以及来自第二腺病毒(例如，人腺病毒-20)的五邻体多肽。所述腺病毒载体能够诱发免疫应答，同时保持低血清流行率。所述腺病毒载体可以配制成疫苗，用于诱导针对感兴趣的特定抗原的保护性免疫。也可以构建所述腺病毒载体以在有需要的受试者中表达感兴趣的转基因。
35.在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献每个整体援引加入本文。本说明书中已包括的文件、条例、材料、装置、文章等的讨论仅为了提供本发明的上下文的目的。这样的讨论不是承认任何或全部这些材料形成关于公开或要求保护的任何发明的现有技术的部分。
36.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。否则，本文使用的某些术语具有如说明书中规定的含义。
37.必须注意，如本文和所附权利要求所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
38.除非另有说明，任何数值，如本文描述的浓度或浓度范围，应当理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的
±
10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml-1.1mg/ml。同样地，1％-10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)-11％(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围，那个范围内的所有单个数值，包括这类范围内的整数和值的分数，除非上下文另有明确指示。
39.除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等同物。本发明意图涵盖这类等同物。
40.如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”或者它们的任何其他变化，将理解为表示包括所述整数或整数的组但不排除任何其他整数或整数的组，并且意图是非排他的或开放的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、物品或装置不必仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出或者不是这种组合物、混合物、过程、方法、物品或装置固有的其他元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的或而不是排除性的或。例如，条件a或b由以下任一满足：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，以及a和b均为真(或存在)。
41.如本文所用，多个列举的元素之间的连接术语“和/或”理解为涵盖单独和组合选项。例如，当两个元素通过“和/或”连接时，第一选项是指在没有第二元素的情况下第一元素的适用性。第二选项是指在没有第一元素的情况下第二元素的适用性。第三选项是指第一和第二元素一起的适用性。这些选项中的任一种均理解为落在含义内，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的并存适用性也理解为落在该含义内，因此满足术语“和/或”的要求。
42.如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“由
…
组成(consists of)”或者如“由
…
组成(consist of)”或“由
…
组成(consisting of)”的变化表示包括任何列举的整数或整数组，但是另外的整数或整数组不可以添加至指定的方法、结构或组合物。
43.如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由
…
组成(consists essentially of)”或者如“基本上由
…
组成(consist essentially of)”或“基本上由
…
组成(consisting essentially of)”的变化表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见m.p.e.p.
§
2111.03。
44.如本文所用，“受试者”表示任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选人。
45.还应当理解，当提到优选发明的组件的尺寸或特征时，本文使用的术语“约”、“大约”、“一般”、“基本上”和类似术语表示所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，并且不排除功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员会理解的。至少，包括数值参数的这类引用会包括使用本领域中接受的数学和工业原理(例如，四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字。
46.术语“相同”或百分比“相同性”，在两个或多个核酸或多肽序列(例如六邻体和纤维多肽以及编码它们的多核苷酸)的背景下，是指在比较和比对以获得最大的对应关系时，两个或多个序列或子序列是相同的或有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的，如使用以下序列比较算法之一或通过目测测量的。
47.对于序列比较，通常有一个序列作为参考序列，测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。
48.用于比较的序列的最佳比对可以通过以下进行，例如smith&waterman,
adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法，needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源比对算法，pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(wisconsin遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta,genetics computer group,575science dr.,madison,wi)，或通过目测(一般参见,current protocols in molecular biology,f.m.ausubel et al.,eds.,current protocols,a joint venture between greene publishing associates,inc.and john wiley&sons,inc.,(1995supplement)(ausubel))。
49.适用于确定百分比序列相同性和序列相似性的算法的实例是blast和blast 2.0算法，其在altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul et al.(1997)nucleic acids res.25:3389-3402中分别描述。进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。这个算法包括首先通过识别查询序列中长度为w的短字(word)来识别高得分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的序列进行比对时，所述短字匹配或满足某正值的阈值分数t。t称为邻域字得分阈值(altschul et al，同上)。这些初始邻域字命中充当种子，用于启动搜索以查找含有它们的更长的hsp。然后，所述字命中沿着每个序列向两个方向延伸至足够远，只要累积比对得分能够增加。
50.对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励得分；总是》0)和n(不匹配残基的罚分；总是《0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用一个打分矩阵来计算累积得分。每个方向上的字命中的延伸在以下情况停止：累积比对得分从其最大实现值下降数量x；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分变成零或更低；或达到任一序列的末端。blast算法的参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)使用字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，blastp程序使用字长(w)为3，期望值(e)为10以及blosum62打分矩阵(参见henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))作为默认值。
51.除了计算百分比序列相同性外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，karlin&altschul,proc.nat’l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。blast算法提供的一种相似性测量是最小和概率(smallest sum probability)(p(n))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较中的最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
52.两个核酸序列或多肽实质相同的进一步指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽有免疫交叉反应性，如下文所述。因此，多肽通常与第二多肽实质相同，例如，其中两个肽只存在保守取代的差异。两个核酸序列实质相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下相互杂交。
53.如本文所用，术语“多核苷酸”，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”，是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的rna或dna或者修饰的rna或dna。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的dna、为单链和双链区域混合物的dna、单链和双链的rna、为单链和双链区域混合物的rna、包含dna和rna的杂交分子，其可以是单链或更通常的双链或单链和双链区域的混合物。此外，“多核苷酸”是指包含rna或dna或rna和dna的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的dna或rna，以及具有为了稳
定性或其他原因而修饰的骨架的dna或rna。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不普遍的碱基如肌苷。可以对dna和rna进行各种修饰；因此，“多核苷酸”涵盖通常在自然界发现的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的dna和rna的化学形式。“多核苷酸”还涵盖通常称为寡核苷酸的相对短的核酸链。
54.如本文所用，术语“载体”是一种复制子，其中可操作地插入另一个核酸片段，以实现该片段的复制或表达。
55.如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染的细胞。在另一实施方案中，“宿主细胞”是这种转染的细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可能与亲本细胞相同，也可能不相同，例如，由于后续世代中可能发生的突变或环境影响或者核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
56.如本文所用的术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖将基因转录为rna。该术语还涵盖将rna翻译成一种或多种多肽，并进一步涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的多肽可以在宿主细胞的细胞质内，进入细胞外环境中，如细胞培养物的生长培养基或锚定到细胞膜上。
57.如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白”可以指包含氨基酸的分子，并且可以由本领域技术人员认可为蛋白。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，也可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经自然或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记成分的缀合。包括在该定义中的还有，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。
58.本文所述的肽序列按照通常的惯例书写，即肽的n-末端区域在左边，c-末端区域在右边。尽管氨基酸的异构形式是已知的，但除非另有明确说明，否则所代表的是氨基酸的l型。
59.如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指接种疫苗的受试者能够控制接种疫苗所针对的病原物质的感染。所述病原物质可以是，例如抗原基因产物或抗原蛋白或其片段。通常，产生了“保护性免疫应答”的受试者只发展轻度至中度的临床症状或完全没有症状。通常，具有针对某种物质的“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会因感染所述物质而死亡。
60.术语“佐剂”定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在本文中，佐剂用于增强对本发明的腺病毒载体的免疫应答。
61.如本文所用，术语“抗原基因产物或其片段”或“抗原蛋白”可以包括细菌、病毒、寄生虫或真菌的蛋白或其片段。优选地，抗原蛋白或抗原基因产物能够在宿主中引发保护性免疫应答，例如，诱导针对疾病或感染(例如，细菌、病毒、寄生虫或真菌性疾病或者感染)的免疫应答，和/或在受试者中产生针对疾病或感染的免疫(即，接种疫苗)，其保护受试者免于疾病或感染。
62.如本文所用，术语“嵌合”意指包含两个或更多个通常不关联在一起的基因、核酸、蛋白、肽或多肽的基因、核酸、蛋白、肽或多肽。“嵌合”基因、核酸或蛋白可以是两个或更多
个不相关的序列(例如，两个或更多个不同的编码两个或更多个不同的蛋白的核酸)之间的融合物。“嵌合”基因、核酸或蛋白可以是两个或更多个相关序列(例如，编码相同蛋白的核酸，但是，所述核酸来自不同的源材料，即一种核酸来自一种人腺病毒，另一种核酸来自第二种不相关的人腺病毒)之间的融合物。
63.腺病毒载体
64.暴露于某些腺病毒导致针对某些腺病毒血清型的免疫应答，其可以影响腺病毒载体的效力。由于人腺病毒感染在人类中很常见，所以人群中针对人腺病毒的中和抗体的流行率(prevalence)很高。个体中存在的这类中和抗体可能会降低基于人腺病毒骨架的基因转移载体的效力。规避效力降低的方法之一是替换作为中和抗体靶标的腺病毒衣壳蛋白上的表位。可以用来自其他流行率低，因此在人群中罕见针对它们的中和抗体的腺病毒(如多种人腺病毒的嵌合腺病毒)的蛋白序列来替换衣壳蛋白上的靶标序列。
[0065]“衣壳蛋白”是指腺病毒(例如ad20和/或ad42)衣壳上的蛋白或其功能片段或者其衍生物，其参与确定腺病毒的血清型和/或趋向性(tropism)。衣壳蛋白通常包括纤维蛋白、五邻体蛋白和/或六邻体蛋白。在某些实施方案中，衣壳蛋白是腺病毒的整个或全长的衣壳蛋白。在其他的实施方案中，衣壳蛋白是腺病毒的全长衣壳蛋白的片段或衍生物。在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体所编码的五邻体、六邻体和纤维来自不同的腺病毒背景。
[0066]
如本文所用的“嵌合腺病毒衣壳”是指腺病毒来源的衣壳，其包含纤维、五邻体和/或六邻体多肽，其中所述纤维、五邻体和/或六邻体来自不同的腺病毒来源(例如，ad42纤维和六邻体多肽以及ad20五邻体多肽)。
[0067]“六邻体多肽”是指腺病毒六邻体外壳蛋白、功能片段及其衍生物。
[0068]“纤维多肽”是指腺病毒纤维蛋白、功能片段及其衍生物。
[0069]“五邻体多肽”是指腺病毒五邻体蛋白、功能片段及其衍生物。
[0070]
针对腺病毒的中和抗体的一个靶标是主要衣壳蛋白，即六邻体蛋白。用来自人群中罕见的腺病毒的六邻体蛋白或六邻体蛋白中的可变序列替换定义血清型并与中和抗体结合的六邻体蛋白或六邻体蛋白中的可变序列，可以允许构建不易被人中常见的抗体中和的腺病毒载体。
[0071]
六邻体高变区(hvr)是六邻体多肽中代表不同腺病毒血清型的最高变异性的区域。一般来说，认为这些hvr与六邻体蛋白三聚体的溶剂暴露表面相对应(在完整的病毒颗粒范围内)，并且相关地，预期它们是抗体介导的腺病毒中和中的重要决定因素(roberts et al.,nature 441:239-43(2006))。用在人中有低的(或没有)血清流行率(seroprevalence)的腺病毒的六邻体hvr替换给定腺病毒载体的六邻体hvr，代表规避靶标人群中预先存在的抗载体体液免疫的可能手段。因此，已经有多项研究探讨六邻体嵌合的概念，主要涉及基于hadv-5载体内的六邻体序列替换(roy et al.,j virol.72:6875-9(1998)；gall et al.,j virol.72:10260-4(1998)；youil et al.,hum.gene ther.13:311-20(2002)；wu et al.j virol.76:12775-82(2002)；roy et al.,virology.333:207-14(2005)；roberts et al.,nature441:239-43(2006)；bradley et al.,j virol.86:1267-72(2012)；yu et al.,biochem biophys res commun.421:170-6(2012)；bruder et al,plos one.7(4):e33920(2012))。
[0072]
针对腺病毒的中和抗体的第二靶标是纤维蛋白。用来自人源的罕见腺病毒的纤维
序列替换纤维蛋白，更优选地替换纤维蛋白内的可变序列，也可以允许构建不易被人中常见的抗体中和的腺病毒载体。上述纤维替换与六邻体替换的组合可以赋予对于人群中普遍存在的抗体的中和的额外抗性。
[0073]
针对腺病毒的中和抗体的第三靶标是五邻体蛋白。用来自人源的罕见腺病毒的五邻体序列替换五邻体蛋白，也可以允许构建不易被人中常见的抗体中和的腺病毒载体。上述六邻体替换、纤维替换和五邻体替换的组合可以赋予对于人群中普遍存在的抗体的中和的额外抗性。
[0074]
本公开提供编码嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物的分离的核酸序列。嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物可以包含，例如，纤维多肽、六邻体多肽和五邻体多肽。纤维和六邻体多肽可以衍生自，例如，第一腺病毒(例如人腺病毒-42)，五邻体多肽可以衍生自，例如，第二腺病毒(例如人腺病毒-20)。
[0075]
多肽的“功能性衍生物”适当地指多肽的修饰形式，例如其中多肽的一个或多个氨基酸可以被删除、插入、修饰和/或替换。认为未修饰的腺病毒衣壳蛋白的衍生物具有功能性，如果例如(a)与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生物衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或较低的血清流行率；和/或(b)与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生物衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或较高的宿主细胞感染性；和/或(c)与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生物衣壳蛋白的腺病毒保留基本上相同或较高的免疫原性；和/或(d)与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生物衣壳蛋白的腺病毒保留基本上相同或较高水平的转基因生产力。
[0076]“腺病毒载体”是指由腺病毒基因的至少部分组衍生或含有腺病毒基因组的至少部分的重组载体。
[0077]
在优选的实施方案中，嵌合腺病毒衣壳可以包含，例如，纤维多肽，其具有与seq id no:11的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列；六邻体多肽，其具有与seq id no:12的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列；以及五邻体多肽，其具有与seq id no:13的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，纤维多肽序列包含seq id no:11的氨基酸序列。在某些实施方案中，六邻体多肽序列包含seq id no:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，五邻体多肽包含seq id no:13的氨基酸序列。
[0078]
在优选的实施方案中，本发明提供包含本文公开的分离的核酸的载体，优选腺病毒载体。腺病毒载体包含编码嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物的分离的核酸，其中嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物包含：纤维多肽，其具有与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；六邻体多肽，其具有与seq id no:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；以及五邻体多肽，其具有与seq id no:13的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序。
[0079]
通常，本发明的腺病毒载体包含在例如质粒、黏粒或杆状病毒载体上的完整的重
组腺病毒基因组。本发明的核酸分子可以是通过克隆或者合成获得的rna形式或dna形式。dna可以是双链或单链。
[0080]
普通技术人员会认识到，可以将来自多个血清型的元素组合在单一的腺病毒载体中，例如人或猿猴腺病毒。因此，可以产生由来自不同血清型的期望特性组合的嵌合腺病毒载体。因此，在一些实施方案中，本发明的嵌合腺病毒载体可以将嵌合六邻体和/或纤维多肽序列的没有预先存在的免疫与现存的腺病毒载体(如rad4、rad5、rad26或rad35)的高水平抗原和/或转基因递送以及呈递能力组合。
[0081]
腺病毒载体用作疫苗和/或转基因表达媒介物的优点可以包括但不限于：易于操作、良好的大规模可制造性以及优秀的安全记录，基于已报道的众多腺病毒载体的多年的研究、开发、制造和临床试验的经验。用作疫苗的腺病毒载体通常提供对转基因编码的蛋白或转基因编码的抗原基因产物的良好的免疫应答，包括细胞免疫应答。根据本发明的腺病毒载体可以基于任何类型的腺病毒，并且在某些实施方案中是人腺病毒，其可以是任何组或血清型的。在优选的实施方案中，重组腺病毒基于来自a、b、c、d、e、f或g组的人腺病毒。在其他优选的实施方案中，重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。在其他实施方案中，它是猿猴腺病毒，如黑猩猩或大猩猩腺病毒，其可以是任何血清型。在某些实施方案中，重组腺病毒基于1、3、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50、67或sa7p型黑猩猩腺病毒。
[0082]
在一个更优选的实施方案中，第二组合物的黑猩猩腺病毒载体是chadv3。重组黑猩猩腺病毒血清型3(chad3或cad3)是一种c亚组腺病毒，其具有与人腺病毒血清型5(ad5)相似的特性。在评估丙型肝炎病毒(hcv)候选疫苗的人体研究中，已证明chad3的安全和免疫原性(barnes e,et al.2012science translational medicine 4:115ra1)。据报道，基于chad3的疫苗能够诱导与人ad5载体疫苗相当的免疫应答。参见，例如，peruzzi d,et al.2009vaccine 27:1293-300and quinn km,et al.2013j immunol 190:2720-35；wo2005/071093；wo2011/0130627等等。
[0083]
腺病毒载体、其构建方法和其增殖方法在本领域中是众所周知的，例如描述于：美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913，以及virology,b.n.fields et al.,eds.,3ded.,raven press,ltd.,new york(1996)中的thomas shenk,“adenoviridae and their replication,”、m.s.horwitz,“adenoviruses,”，分别为第67章和第68章，以及本文提到的其他参考文献。通常，腺病毒载体的构建涉及使用标准的分子生物学技术，如在以下中描述的那些：sambrook et al.,molecular cloning,a laboratory manual,2d ed.,cold spring harbor press,cold spring harbor,n.y.(1989)、watson et al.,recombinant dna,2d ed.,scientific american books(1992)和ausubel et al.,current protocols in molecular biology,wiley interscience publishers,ny(1995)，以及本文提到的其他参考文献。
[0084]
在某些实施方案中，腺病毒载体包含e1缺失和/或e3缺失。e1或e3缺失可以包括，例如，基因的完全缺失或部分缺失，其使得e1或e3基因产物在功能上有缺陷。因此，在某些实施方案中，腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组e1区中含有缺失。如本领域技术
人员知晓的，在将腺病毒基因组中的关键区域删除的情况下，这些区域编码的功能必须反式提供，优选由生产者细胞提供，即当将e1、e2和/或e4区的部分或全部从腺病毒中删除时，这些必须存在于生产者细胞中，例如整合在其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒的形式存在。腺病毒也可以在e3区中具有缺失，所述缺失对复制来说不是必需的，因此不需要补充这样的缺失。e1、e2、e3和e4区中的一个或多个也可以通过其他方式失活，如将感兴趣的转基因(通常与启动子相连)插入到要失活的区域中。
[0085]
可以使用的生产者细胞(有时在本领域和本文中也称为“包装细胞”或“补充细胞”)可以是任何生产者细胞，其中可以增殖期望的腺病毒。例如，重组腺病毒载体的增殖是在补充腺病毒缺陷的生产者细胞中进行的。这样的生产者细胞优选地在它们的基因组中具有至少一个腺病毒e1序列，从而能够补充在e1区中有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充e1的生产者细胞，如由e1永生化的人视网膜细胞，例如911或per.c6细胞(参见美国专利5,994,128)、e1转化的羊膜细胞(参见ep专利1230354)、e1转化的a549细胞(参见例如wo 98/39411，美国专利5,891,690)，gh329:hela(gao et al,2000,hum gene ther 11:213-19)，293等。在某些实施方案中，生产者细胞是例如hek293细胞或per.c6细胞或911细胞或it293sf细胞等。生产者细胞中腺病毒载体的生产综述于(kovesdi et al.,2010,viruses 2:1681-703)。
[0086]
在某些实施方案中，腺病毒载体是包含一种或多种人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。人腺病毒核酸可以选自，例如，人腺病毒-4(ad-4)、人腺病毒-5(ad-5)、人腺病毒-26(ad-26)或人腺病毒-35(ad-35)。在某些实施方案中，e1缺陷的腺病毒载体包含人ad5的腺病毒的e4-orf6编码序列。这允许这类腺病毒在众所周知的表达ad5的e1基因的补充细胞系中增殖，例如293细胞或per.c6细胞(参见，例如，fallaux et al.,1998,hum gene ther 9:1909-17，havenga et al.,2006,j gen virol 87:2135-43，wo 03/104467，整体援引加入本文)。
[0087]
在某些实施方案中，腺病毒载体包含转基因。“转基因”是指异源核酸，其为载体中非天然存在的核酸，根据本发明，转基因可以编码在受试者中诱发免疫应答的抗原基因产物或抗原蛋白。转基因也可以编码治疗性蛋白，以治疗或预防有需要的受试者的疾病。转基因可以通过，例如，标准的分子生物学技术引入载体中。转基因可以克隆至，例如，腺病毒载体的缺失的e1或e3区中，或者e4区和ritr之间的区域中。转基因一般与表达控制序列可操作地连接。在优选的实施方案中，将转基因插入到转基因插入位点。
[0088]
如果需要，包含根据本发明的实施方案的纤维、六邻体和五邻体多肽序列的嵌合腺病毒衣壳序列和/或其转基因可以进行密码子优化，以确保在处理的宿主(例如人)中正确表达。密码子优化是在本领域广泛应用的技术。
[0089]
转基因可以在腺病毒衍生的启动子(如主要晚期启动子)的控制下(即与之可操作地连接)，或可以在异源启动子的控制下。适合的异源启动子的实例包括cmv启动子和rsv启动子。优选地，启动子位于表达盒内感兴趣的异源基因的上游。
[0090]
在优选的实施方案中，腺病毒载体包含选自以下的核酸序列：seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10。
[0091]
药物和/或免疫原性组合物
[0092]
在另一总的方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的分离的多核苷酸、本发
明的分离的多肽、本发明的载体、本发明的腺病毒载体和/或本发明的宿主细胞以及药学上可接受的载剂。如本文所用的术语“药物组合物”是指包含本发明的分离的多核苷酸、本发明的分离的多肽、本发明的分离的载体(例如腺病毒载体)和/或本发明的宿主细胞以及药学上可接受的载剂一起的产品。本发明的多核苷酸、多肽、载体和/或宿主细胞以及包含它们的组合物也可用于制造本文提及的用于治疗性应用的药物。
[0093]
如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂囊泡、微球、脂质体封装物(liposomal encapsulation)或本领域众所周知知的用于药物制剂的其他材料。可以理解的是，载剂、赋形剂或稀释剂的特性会取决于特定应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰本发明的组合物的有效性或本发明的组合物的生物活性的无毒材料。根据特定的实施方案，鉴于本公开，任何适合用于多核苷酸、多肽、载体和/或宿主细胞药物组合物的药学上可接受的载剂都可用于本发明。
[0094]
药学活性成分与药学上可接受的载剂的配制在本领域是已知的，例如，remington:the science and practice of pharmacy(例如第21版(2005)以及任何较后版本)。额外成分的非限制性实施例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载剂可用于配制本发明的药物组合物。
[0095]
可以将药物组合物配制为，例如，用于在有需要的受试者中表达转基因(即，设计为用于在有需要的受试者中表达转基因的药物组合物)。可以将药物组合物配制为，例如，用于表达抗原多肽或其抗原片段(例如，用于在有需要的受试者中诱发免疫应答的药物组合物)。
[0096]
设计为在有需要的受试者中诱发免疫应答的药物组合物可以称为，例如，免疫原性组合物。免疫原性组合物是包含免疫学上有效量的纯化或部分纯化的用于本发明的腺病毒载体的组合物。所述组合物可根据本领域众所周知的方法配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。这类组合物可以包括佐剂以增强免疫应答。鉴于本公开，制剂中每种成分的最佳比例可以通过本领域技术人员所熟知的技术来确定。
[0097]
鉴于本公开，根据本发明实施方案的免疫原性组合物可以使用本领域技术人员已知的方法制备。液体药物组合物一般包括液体载剂，如水、石油、动物或植物油、矿物油或者合成油。可以包括生理盐水、葡萄糖或其他糖类溶液或者如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇类。
[0098]
本发明中有用的免疫原性组合物可以包含佐剂。适合按照本发明共同给药的佐剂应是在受试者中潜在安全、耐受性好和有效的佐剂，包括qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026、gsk-i、as01、as03、as04、as15、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpg odn、betafectin、明矾和mf59。
[0099]
可以给药的其他佐剂包括凝集素、生长因子、如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(pdgf)、粒细胞集落刺激因子(gcsf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)、肿瘤坏死因子(tnf)、表皮生长因子(egf)、il-i、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10和il-12等的细胞因子和淋巴因子，或者其编码核酸。
[0100]
本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这类材料应该是无毒的，并且不应该干扰活性成分的效力。载剂
或其他材料的确切性质可取决于给药途径，例如，肌肉内、皮下、经口、静脉内、皮肤、粘膜内(例如，肠道)、鼻内或腹膜内途径。
[0101]
用于诱导保护性免疫和/或表达转基因的方法
[0102]
本发明的另一个总的方面涉及在有需要的受试者中诱导免疫应答和/或表达转基因的方法。所述方法可以包括，例如，鉴别有需要的受试者；使有需要的受试者与本文所述的药物组合物和/或免疫原性组合物接触；以及在有需要的受试者中诱发免疫应答和/或表达转基因。在某些实施方案中，所述方法可以包括，例如，向受试者给药包含本文所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂的疫苗。
[0103]
本文还提供用于生产疫苗的方法。所述方法包括将本文所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。
[0104]
根据本发明实施方案的任何免疫原性组合物，包括但不限于本文所述的那些，可以在本发明的方法中作为疫苗使用。根据本发明实施方案的任何药物组合物，包括但不限于本文所述的那些，可以在本发明的方法中通过表达感兴趣的转基因来治疗或预防有需要的受试者的疾病。
[0105]
包含所述载体的免疫原性组合物/疫苗/药物组合物的给药通常是通过肌肉内或皮下。然而，也可以设想其他给药方式，如静脉内、皮肤、皮内或鼻内。免疫原性组合物的肌肉内给药可以通过使用针头注射腺病毒载体的悬浮液来实现。可选的是使用无针注射装置来给药组合物(使用，例如)或含有疫苗的冻干粉。
[0106]
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在患处注射，载体会以肠胃外可接受的水溶液形式，所述水溶液不含热原，并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域技术人员能够很好地制备合适的溶液，例如使用如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液的等渗媒介物。可以根据需要掺入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。也可以采用缓释制剂。
[0107]
通常，给药会具有预防目的，以在感染或症状发展之前产生针对感兴趣的抗原(例如，细菌、病毒、寄生虫和/或真菌病原体)的免疫应答。表达感兴趣的转基因的腺病毒载体的给药也可以在有需要的受试者中具有预防目的。例如，有需要的受试者可能具有减少或消失的与感兴趣的转基因相对应的基因的内源性表达。根据本发明可以治疗或预防的疾病和病症包括其中免疫应答可以起到保护或治疗作用，和/或转基因的纠正性表达导致有需要的受试者中的细胞正常运作的那些。在其他实施方案中，可以给药腺病毒载体用于暴露后预防。
[0108]
将含有嵌合人腺病毒载体的免疫原性组合物给药于受试者，在受试者中产生对感兴趣的抗原的免疫应答。足以诱导可检测的免疫应答的组合物的量定义为组合物的“免疫学有效剂量”或“有效量”。本发明的免疫原性组合物可以诱导体液以及细胞介导的免疫应答。在一个典型的实施方案中，免疫应答是保护性免疫应答。
[0109]
药物组合物可以以治疗有效量给药于有需要的受试者，以治疗或预防疾病。治疗有效量是指表达感兴趣的转基因的腺病毒载体的量，其导致对疾病、病症或病况的治疗；防止或减缓疾病、病症或病况的进展的量；或减少或完全缓解与疾病、病症或病况相关的症状的量。
[0110]
根据特定的实施方案，治疗有效量是指足以实现以下一个、两个、三个、四个或更
多以下效果的治疗量：(i)减少或减轻要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的严重程度；(ii)减少要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的持续时间；(iii)预防要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的进展；(iv)导致要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的消退；(v)预防要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的发展或发病；(vi)预防要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的复发；(vii)减少患有要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的受试者的住院；(viii)减少患有要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的受试者的住院时间；(ix)增加具有要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状的受试者的生存；(xi)抑制或减少受试者中要治疗的疾病、病症或病况或者与之相关症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
[0111]
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”都意图指减轻或逆转与疾病、病症或病况相关的至少一个可测量的物理参数，其在受试者身上不是必需能够辨别，但在受试者身上可以辨别。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”也可以指导致疾病、病症或病况的消退、预防其进展或至少减缓其进展。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指缓解、预防与疾病、病症或病况相关的一个或多个症状的发展或发病，或者减少其持续时间。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防疾病、病症或病况的复发。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和治疗(treatment)”是指增加患有疾病、病症或病况的受试者的生存。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指消除受试者的疾病、病症或病况。
[0112]
实际给药量以及给药的速度和时间过程会取决于所治疗的疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量的决定等，属于全科医生和其他医生的职责范围，或在兽医背景下，属于兽医的职责范围，并且通常考虑到要治疗的疾病、个别病人的病况、递送的部位、给药的方法和其他执业者已知的因素。上述技术和方案的实例可以在remington
′
s pharmaceutical sciences,16th edition,osol,a.ed.,1980中找到。
[0113]
在生产腺病毒载体和任选地将这类颗粒配制成组合物之后，可以将载体给药于个体，特别是人或另一种灵长类动物。可以向人，或另一种哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、绵羊、山羊、猪、马、牛、驴、猴子、狗或猫给药。向非人哺乳动物的递送不需要用于治疗目的，但可以用于实验背景下，例如研究对腺病毒载体的免疫应答机制。
[0114]
在一个示例性方案中，腺病毒载体以约100μl-约10ml(含有浓度约为10
4-10
12
个病毒颗粒/ml)的体积给药(例如，肌肉内)。优选地，腺病毒载体以0.1-2.0ml的体积给药。例如，腺病毒载体可以以100μl、500μl、1ml、2ml给药。更优选地，腺病毒载体以0.5ml的体积给药。任选地，腺病毒载体可以以约107vp/ml、108vp/ml、109vp/ml、10
10
vp/ml、5x10
10 vp/ml、10
11
vp/ml或10
12
vp/ml的浓度给药。通常，腺病毒载体在一次给药中以约10
9-约10
12
个病毒颗粒(vp)的量给药于人受试者，更通常地，以约10
10-约10
12
vp的量给药。初次给药后可以，例如，如上所述进行加强。
[0115]
初次给药后，可由包含编码感兴趣的抗原和/或感兴趣的转基因的相同腺病毒载体的疫苗/组合物或者包含编码相同感兴趣的抗原和/或感兴趣的转基因的不同腺病毒载体的疫苗/组合物进行加强或刺激(kick)。
[0116]
如果期望，组合物可以在试剂盒(kit)、药包(pack)或分发器(dispenser)中呈现，其可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。所述试剂盒可以包含，例如，金属或塑料箔，如泡罩包装。所述试剂盒、药包或分发器可以随附有给药说明。
[0117]
本发明的组合物可以单独或与其他治疗方法联合给药，同时或依次，取决于要治疗的病况。
[0118]
实施方案
[0119]
本发明还提供以下非限制性实施方案。
[0120]
实施方案1是一种分离的核酸序列，其编码嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物，其中所述嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物包含：纤维多肽，其具有与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；六邻体多肽，其具有与seq id no:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；以及五邻体多肽，其具有与seq id no:13的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列。
[0121]
实施方案2是实施方案1的分离的核酸序列，其中纤维多肽序列包含seq id no:11的氨基酸序列。
[0122]
实施方案3是实施方案1或2的分离的核酸序列，其中六邻体多肽序列包含seq id no:12的氨基酸序列。
[0123]
实施方案4是实施方案1-3中任一项的分离的核酸，其中所述五邻体多肽包含seq id no:13的氨基酸序列。
[0124]
实施方案5是一种载体，其包含实施方案1-4中任一项的分离的核酸。
[0125]
实施方案6是实施方案5的载体，其中所述载体是腺病毒载体。
[0126]
实施方案7是实施方案6的载体，其中所述腺病毒载体进一步包含转基因，任选地，其中所述转基因是治疗性转基因。
[0127]
实施方案8是实施方案6或7的载体，其中所述腺病毒载体进一步包含e1缺失。
[0128]
实施方案9是实施方案6-8中任一项的载体，其中所述腺病毒载体进一步包含e3缺失。
[0129]
实施方案10是实施方案6-9中任一项的载体，其中所述腺病毒载体是嵌合腺病毒载体，所述嵌合腺病毒载体包含一种或多种来自人腺病毒-4、人腺病毒-5、人腺病毒-26或人腺病毒-35中至少一种的腺病毒核酸序列。
[0130]
实施方案11是实施方案10的载体，其中所述腺病毒载体包含人腺病毒-5(hadv-5)e4 orf6。
[0131]
实施方案12是实施方案6-10中任一项的载体，其中所述腺病毒载体包含选自seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10的核酸序列。
[0132]
实施方案13是实施方案6-12中任一项的载体，其中所述转基因位于e1缺失处、e3缺失处和/或邻近右末端反向重复(ritr)处。
[0133]
实施方案14是一种重组细胞，其包含实施方案5-12中任一项的载体。
[0134]
实施方案15是一种生产载体的方法，其包括：
[0135]
(a)使实施方案14的重组细胞在生产腺病毒载体的条件下生长；和
[0136]
(b)从所述重组细胞分离载体。
[0137]
实施方案16是一种免疫原性组合物，其包含实施方案6-13中任一项的腺病毒载体
和药学上可接受的载剂。
[0138]
实施方案17是一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药实施方案16的免疫原性组合物。
[0139]
实施方案18是一种生产疫苗的方法，所述方法包括将实施方案6-13中任一项的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。
[0140]
实施方案19是一种腺病毒载体，其包含：
[0141]
(a)至少一种转基因；和
[0142]
(b)核酸，其编码嵌合腺病毒衣壳或其功能性衍生物，其中所述嵌合腺病毒衣壳包含：纤维多肽，其具有与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；六邻体多肽，其具有与seq id no:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；以及五邻体多肽，其具有与seq id no:13的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列。
[0143]
实施方案20是实施方案19的腺病毒载体，其中纤维多肽序列包含seq id no:11的氨基酸序列。
[0144]
实施方案21是实施方案19或20的腺病毒载体，其中六邻体多肽序列包含seq id no:12的氨基酸序列。
[0145]
实施方案22是实施方案19-21中任一项的腺病毒载体，其中所述五邻体多肽包含seq id no:13的氨基酸序列。
[0146]
实施方案23是实施方案19-22中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体进一步包含e1缺失。
[0147]
实施方案24是实施方案19-23中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体进一步包含e3缺失。
[0148]
实施方案25是实施方案19-24中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体是嵌合腺病毒载体，所述嵌合腺病毒载体包含一种或多种来自人腺病毒-4、人腺病毒-5、人腺病毒-26或人腺病毒-35中至少一种的腺病毒核酸序列。
[0149]
实施方案26是实施方案25的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体包含人腺病毒-5(hadv-5)e4 orf6。
[0150]
实施方案27是实施方案19-26中任一项的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体包含选自seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10的核酸序列。
[0151]
实施方案28是实施方案19-27中任一项的腺病毒载体，其中所述转基因位于e1缺失处、e3缺失处和/或邻近右末端反向重复(ritr)处。
[0152]
实施方案29是实施方案19-28中任一项的腺病毒载体，其中所述转基因是治疗性转基因。
[0153]
实施方案30是一种重组细胞，其包含实施方案19-29中任一项的腺病毒载体。
[0154]
实施方案31是一种生产腺病毒载体的方法，其包括：
[0155]
(a)使实施方案30的重组细胞在生产腺病毒载体的条件下生长；和
[0156]
(b)从所述重组细胞分离腺病毒载体。
[0157]
实施方案32是一种药物组合物，其包含实施方案19-29中任一项的腺病毒载体和药学上可接受的载剂。
[0158]
实施方案33是一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所
述受试者给药实施方案32的药物组合物。
[0159]
实施方案34是一种生产疫苗的方法，所述方法包括将实施方案19-29中任一项的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。
[0160]
实施方案35是一种在有需要的受试者中表达转基因的方法，所述方法包括：
[0161]
a.鉴别需要表达的转基因的受试者；
[0162]
b.使所述受试者与实施方案7的载体或实施方案19-29中任何一项的腺病毒载体接触；和
[0163]
c.在所述受试者中表达所述转基因。
[0164]
实施方案36是实施方案35的方法，其中所述有需要的受试者中的转基因的表达治疗或预防疾病或者病症。
[0165]
实施方案37是实施方案35的方法，其中使受试者与载体接触包括从所述受试者分离细胞，和使所述细胞与所述载体接触。
[0166]
实施方案38是实施方案35-37中任一项的方法，其中所述有需要的受试者是人受试者。
[0167]
实施方案39是实施方案7的载体用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的用途，所述方法包括使所述有需要的受试者与所述载体接触，其中接触有需要的受试者导致治疗性转基因的表达。
[0168]
实施方案40是实施方案39的用途，其中使受试者与载体接触包括从所述受试者分离细胞，和使所述细胞与所述载体接触。
[0169]
实施方案41是实施方案19-29中任一项的腺病毒载体用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的用途，所述方法包括使所述有需要的受试者与所述腺病毒载体接触，其中接触有需要的受试者导致治疗性转基因的表达。
[0170]
实施方案42是实施方案41的用途，其中使受试者与腺病毒载体接触包括从所述受试者分离细胞，和使所述细胞与所述腺病毒载体接触。
[0171]
实施例
[0172]
实施例1：基于新的腺病毒分离物ad20-42-42的e1-和e3缺失的载体的产生。
[0173]
鉴定并测序一种新的人腺病毒分离物ad20-42-42(seq id no:1)。发现这种人腺病毒分离物在系统发育上属于人腺病毒种类d(hadv-d)，并且它是hadv-20和hadv-42的自然嵌合体。五邻体基因来源于hadv-20，而六邻体和纤维基因则来源于hadv-42。图1显示的是ad20-42-42人腺病毒分离物的基因组图谱。
[0174]
用于产生基于ad20-42-42的ad载体的三质粒系统的描述
[0175]
通过使用三质粒系统产生基于ad20-42-42的重组腺病毒载体。所述质粒系统包括覆盖腺病毒基因组5’端的“接头质粒”，其中e1区缺失并用携带感兴趣的基因(lacz、luc+或egfp)的表达盒替换。第二个“中间”质粒覆盖腺病毒基因组的中间部分，没有任何修饰。腺病毒序列的3’端由“右端”质粒携带。在右端构建体中，e3区缺失，并且e4区中的原生的orf6/7用hadv-5的orf6/7替换。
[0176]
表1：用于构建基于ad20-42-42的重组腺病毒载体的质粒
[0177][0178]
质粒携带的病毒载体序列在～2000个核苷酸位置上相互重叠，以允许这些序列在hek293或per.细胞中同源重组(图2)。
[0179]
基于ad20-42-42的ad载体基因组设计：质粒系统通过标准分子克隆方法的几个步骤构建。将基于ad20-42-42的ad载体基因组每个设计成包含e1缺失、e3缺失、不同的转基因插入位点以及用人腺病毒-5(hadv-5)(genbank序列ac_000008的碱基对32966-34077)的e4开放阅读框(orf)6和orf6/7替换原生的e4开放阅读框(orf)6和orf6/7。
[0180]
接头质粒
[0181]
首先构建e1缺失的接头质粒“padapt20-42-42.empty”。将表达盒放置在缺失的e1区的先前的位置。这个盒由巨细胞病毒主要立即早期启动子(即“cmv启动子”)驱动，并含有sv40衍生的多腺苷酸化信号(“sv40 poly a”)。表达盒配备多克隆位点，以方便插入各种感兴趣的基因(lacz、luc+和egfp)。空接头质粒padapt20-42-42如下构建：
[0182]
产生覆盖野生型腺病毒序列核苷酸(nt)1-461的片段1，并用pcr引物引入5’侧的paci限制酶位点和3’侧的avrii位点。片段1的pcr产物用paci和avrii双重消化。
[0183]
片段2，其包含sv40 polya和野生型腺病毒序列的核苷酸3361-5908，是通过制备两个pcr扩增子，然后对这两个产物进行组装pcr而产生的。含有“sv40 polya”的第一个pcr产物是从先前构建的质粒(padapt26.empty；abbink et al.，j.virol.81(9):4654-63(2007))扩增的。在pcr产物的5’端引入一个xbai限制性位点，并用反向引物在pcr产物中引入一个ad20-42-42同源片段。这个重叠含有一个天然的xbai识别位点(存在于ad20-42-42基因组中，但通过改变识别位点的一个碱基而特意将其破坏)。这个pcr片段长174bp。第二个pcr覆盖从pix(包括pix)的开始到大约聚合酶基因的中间的ad20-42-42基因组。这个pcr的正向引物含有与含有sv40 polya(xbai识别位点被破坏)的pcr产物1的重叠。用反向引物在这个pcr片段上引入paci识别位点。这个pcr片段长2574bp。之后，用pcr产物1和2作为模板进行组装pcr，以合并这些片段。组装pcr的产物大小为2710bp。随后，用xbai和paci双重消化这个组装pcr产物。
[0184]
将先前构建的质粒(abbink et al.，j.virol.81(9):4654-63(2007))用xbai、avrii和paci消化以获得质粒骨架和cmv启动子(片段2108和880)。之后，用padapt26.empty(片段2108和880)和片段1和片段2的片段进行四点连接。这产生了padapt20-42-42.empty质粒。
[0185]
通过使用特有的kpni、hindiii或bamhi位点和xbai位点随后连接将报告基因插入到mcs中。
[0186]
中间质粒
[0187]
中间质粒含有从nt位置2088到18494的野生型腺病毒基因组，没有任何修饰。首先，创建两个pcr片段。一个覆盖中间片段的5’端，在正向引物中掺入一个paci位点，并且反
向引物设计在腺病毒基因组的天然sbfi位点的稍下游(产物大小：2273bp)。第二个pcr片段用设计在腺病毒基因组中另一个天然sbfi位点的稍上游的正向引物创建，并且在反向引物中掺入一个paci位点(产物大小：2407bp)。两个pcr片段都用paci和sbfi限制酶消化。
[0188]
用paci消化侧翼有paci位点的pbr322亚克隆骨架质粒(abbink et al.,j.virol.81(9):4654-63(2007))(2086bp)。使用双重消化的pcr产物和经paci消化的、去磷酸化的pbr骨架质粒进行3点连接。这产生了质粒pbr.ad20-42-42.paci-sbfi。用sbfi限制酶切开先前步骤中得到的pbr.ad20-42-42.paci-sbfi质粒。用sbfi限制酶消化野生型ad20-42-42基因组dna，并将覆盖野生型基因组从聚合酶基因到大约pvi基因中间的长11858nt的片段连接到pbr.ad20-42-42.paci-sbfi质粒中。这产生了“pbr.ad20-42-42.sbfi final interm”质粒。
[0189]
右端质粒
[0190]
pbrad20-42-42.srfi-ritr的构建：通过pcr扩增ad-20-42-42基因组右端的5’端(片段1，2098bp)，使得在pcr产物中包含一个天然的srfi-sbfi片段，并且在正向引物中补充一个paci识别位点。用通过正向引物引入的一个sbfi识别位点和在反向引物中掺入的一个paci识别位点产生另一个覆盖ad-20-42-42基因组右端的3’端的片段。在pcr产物的5’端附近存在一个天然的mlui位点。之后，两个pcr产物都用paci和sbfi酶消化。
[0191]
用paci消化侧翼有paci位点的pbr322亚克隆骨架质粒(abbink et al.,j.virol.81(9):4654-63(2007))(片段大小为2108bp)。将先前步骤中的两个经paci和sbfi消化的pcr片段克隆到pbr骨架中，产生pbrsrfi-sbfi/mlui-ritr质粒。然后用sbfi和mlui消化这个质粒。用sbfi和mlui消化ad20-42-42野生型基因组dna，分离基因组核苷酸位置17742和33714之间的片段，并克隆到上述质粒中。这产生pbrad20-42-42srfi-ritr，其携带野生型ad20-42-42基因组从15373位直到ritr的最后一个核苷酸(35187)。
[0192]
e3区域的缺失：为了缺失e3区的目的，使用pbrad20-42-42srfi-ritr质粒作为模板进行两个pcr。第一个设计在要缺失的区域的上游；正向引物覆盖一个天然的asci位点，而在反向引物中掺入一个spei位点。第二个pcr设计在e3区的下游。反向引物覆盖ad20-42-42基因组中的一个天然ecori位点，而在正向引物中掺入一个spei位点。之后，第一个产物用spei和asci双重消化，第二个产物用spei和ecori。pbrad20-42-42srf-ritr质粒用asci和ecori消化，并且将经消化的质粒和pcr产物进行3点连接。因此，野生型ad20-42-42的基因组核苷酸位置26673到30753之间的片段从基因组中脱落，并且序列通过引入的spei位点连接。这产生了pbrad20-42-42.srfi-ritr.de3质粒。
[0193]
用hadv-5的同源区替换原生orf6/7：为了替换orf6/7，通过pcr扩增三个片段。两个设计为覆盖要替换的orf6/7的上游和下游区域。第一个pcr的正向引物带有一个asci位点，第二个pcr的反向引物带有一个ecori位点。进行第三个pcr以从先前产生的质粒(pbr.ad26.srfi-ritr.de3.5orf6(abbink et al.,j.virol.81(9):4654-63(2007))中获得hadv-5orf6/7，并且它与其他两个pcr产物部分重叠。然后对这三个pcr产物进行融合pcr，随后用asci和ecori双重消化。pbrad20-42-42.srfi-ritr.de3质粒也用asci和ecori消化，经消化的融合pcr产物通过2点连接插入，以获得最终的右端质粒：pbrad20-42-42srf-ritr.de3.5orf6。
[0194]
基于ad20-42-42的腺病毒载体的产生和生产
[0195]
分别包含腺病毒载体基因组序列seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10的腺病毒载体ad20-42-42.lacz.5orf6、ad20-42-42.luc+.5orf6和ad20-42-42.egfp.5orf6通过转染相应质粒产生：(1)接头质粒“padapt20-42-42.lacz”(seq id no:3)或“padapt20-42-42.luc+”(seq id no:4)或“padapt20-42-42.egfp”(seq id no:5)；(2)中间质粒“pbr.ad20-42-42.sbf final interm”(seq id no:6；图5)；(3)右端质粒“pbrad20-42-42srfi-ritr.de3.5orf6”(seq id no:7；图6)。
[0196]
在e1补充的hek293细胞中进行三质粒系统的转染。在转染入hek293细胞之前，hek293细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)的dulbecco改良依格尔培养基(dmem)中作为贴壁培养物生长，用paci消化ad载体基因组质粒以从质粒中释放各自的腺病毒载体基因组片段。使用lipofectamine转染试剂(invitrogen；carlsbad，ca)按照标准方法进行转染。在收获病毒拯救转染后，通过在hek293细胞培养物上连续进行几轮感染进一步扩增病毒。如之前所述，使用两步氯化铯(cscl)密度梯度超速离心法从粗病毒收获物中纯化病毒(havenga et al.,“novel replication-incompetent adenoviral b-group vectors:high vector stability and yield in per.c6 cells,”j.gen.virol.87(8):2135-43(2006))。通过之前所述的基于分光光度法的方法测量病毒颗粒(vp)滴度(maizel et al.,“the polypeptides of adenovirus:i.evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types2,7a,and 12,”virology,36(1):115-25(1968))。
[0197]
实施例2：由新型腺病毒载体诱导的细胞和体液免疫应答
[0198]
这个实施例描述为评价本文产生的基于ad20-42-42的新型腺病毒载体的免疫原性而进行的实验。在这些实验中，评价了在肌肉内免疫接种后，新型载体在小鼠中诱导针对载体编码的(模型)抗原的体液和细胞免疫应答的能力。测试的载体表达萤火虫萤光素酶(fluc)作为模型抗原。将载体与基于人腺病毒26型(hadv-26，本文中也称为ad26)的基准载体进行并列比较。使用众所周知的免疫学测定，如酶联免疫斑点测定(elispot)和酶联免疫吸附测定(elisa)，测量针对各自抗原的免疫应答。
[0199]
由ad20-42-42.fluc诱导的细胞免疫应答
[0200]
在balb/c小鼠中评估新型腺病毒载体ad20-42-42的免疫原性，小鼠通过肌肉内注射ad26.fluc(基准对照)、表达萤火虫萤光素酶的ad20-42-42载体(ad20-42-42.fluc)或缺乏转基因的腺载体(ad26.e)进行免疫。测试了两种载体剂量的给药：109和10
10
个病毒颗粒(vp)每小鼠，但ad26.e组除外，其使用10
10
个vp。在免疫后两周处死动物，并进行血清和脾细胞取样(图7a)。
[0201]
通过fluc特异性ifn-γelispot测定来评估针对载体编码的抗原的细胞免疫应答。为此，用重叠15mer的fluc肽池过夜刺激在处死时从免疫小鼠身上取样的脾细胞。通过测量分泌ifn-γ的细胞的相对数目来确定抗原特异性免疫应答(图7b)。结果显示，在最高免疫接种剂量(10
10
)时，由ad20-42-42诱导的细胞免疫应答与对ad26.fluc观察到的应答相当。正如预期，没有检测到针对缺乏萤火虫萤光素酶的腺载体(ad26.e)的fluc特异性应答。总的来说，数据显示，ad20-42-42诱导强的细胞应答。
[0202]
实施例3：评估新型和现有腺病毒载体之间的血清学交叉中和
[0203]
为了其作为新型腺病毒疫苗载体的潜在效用，本文创建的新型ad20-42-42腺病毒载体优选在血清学上有别于目前作为疫苗载体正在开发的现有腺病毒载体，例如基于人腺
病毒血清型hadv-26的载体。因此，在新型ad20-42-42腺病毒载体和基于hadv-26的现有载体(ad26)之间进行了交叉中和试验。为此，在腺病毒中和试验中将针对这些载体引发的小鼠抗血清进行了针对两种载体的交叉试验。在用10
10
个载体颗粒每小鼠免疫接种两周后，从balb/c小鼠取样采集用于这个试验的小鼠抗血清。腺病毒中和测定如先前所述进行(spangers et al 2003.j.clin.microbiol.41:5046-5052)。简而言之，从1:16稀释开始，将血清2倍连续稀释，然后与表达萤火虫萤光素酶(fluc)的腺病毒载体预混合，随后与a549细胞孵育过夜(500个病毒颗粒每细胞的感染复数(moi))。感染后24小时测量的感染的细胞裂解液中的萤光素酶活性水平代表载体感染效率。针对给定载体的中和滴度定义为能使载体感染效率降低90％的最高血清稀释度。将中和滴度任意划分为以下类别：《16(无中和)、16.1-200(轻微交叉中和)、201-2000(交叉中和)以及》2001(强交叉中和)。结果显示测试的载体之间没有大的交叉中和(图8)。在载体ad20-42-42和ad26之间只看到一些轻微的、单向的交叉中和，ad26抗血清对ad20-42-42显示的中和滴度为23，而ad20-42-42抗血清对ad26没有显示任何中和。因此，新型腺病毒载体ad20-42-42显示出与人腺病毒载体ad26低至不存在的交叉中和。
[0204]
实施例4：新型腺病毒载体在人群中的血清流行率
[0205]
疫苗目标人群中预先存在的高水平的抗载体体液免疫可能阻碍新型腺病毒载体作为有效疫苗平台的潜在用途。因此，对ad20-42-42载体在103个人血清样本中的血清流行率进行了评估。通过进行基于cpe的测定(对于野生型(wt)病毒)和报告子测定(对于表达luc+的病毒)，测试了人血清样本对载体的中和。
[0206]
标准腺病毒中和测定如实施例3和先前所述进行(spangers et al 2003.j.clin.microbiol.41:5046-5052)。对于野生型腺病毒中和测定，将血清在55℃下热灭活15分钟并稀释(1/2、1/4、1/8、1/16或1/32)。接着，将50μl的腺病毒储液(稀释至200细胞培养50％抑制剂量(ccid
50
))加入至含有血清的孔中。在第5至6天，用mtt测定(promega)分析板的cpe的抑制。当cpe的保护》90％时，将血清的中和评分为阳性。相对于阳性和阴性对照，计算复制抑制的百分比。
[0207]
如上所述，简而言之，从1:16稀释开始，将血清2倍连续稀释，然后与表达萤火虫萤光素酶(fluc)的腺病毒载体预混合，随后与a549细胞孵育过夜(500个病毒颗粒每细胞的感染复数)。感染后24小时测量的感染的细胞裂解液中的萤光素酶活性水平代表载体感染效率。针对给定载体的中和滴度定义为能使载体感染效率降低90％的最高血清稀释度。将中和滴度任意划分为以下类别：《16(无中和)、16-50、50-200、200-500、500-1000以及》1000。
[0208]
结果表明，与在相同测定中测试的hadv-5载体相比，ad20-42-42腺病毒载体在所研究的人受试者中具有相当低的血清流行率(20-35％血清阳性)(图9)。此外，针对新型ad20-42-42载体的阳性中和滴度一般很低，大多不高于200。相比之下，发现针对hadv-5的阳性中和滴度在较高的范围内，达到1000以上。虽然载体hadv-35显示出与ad20-42-42相似的血清阳性％，但观察到的hadv-35的滴度比ad20-42-42的那些在更高的范围内。
[0209]
总而言之，上述数据表明，可以认为在评估的疫苗目标人群中，针对ad20-42-42载体的预先存在的体液抗载体免疫是低的，表明这个载体具有作为这个人群中有效的疫苗载体的潜力。
[0210]
实施例5：ad20-42-42载体在人血管细胞中的转导能力
[0211]
转导感兴趣的细胞和表达其编码的蛋白的能力是要用于基因治疗的载体的基本特征。使用萤光素酶测定测试了新型腺病毒载体ad20-42-42在血管细胞中的转导能力。
[0212]
简而言之，用表达萤光素酶和lacz的ad20-42-42载体以剂量依赖的方式转导hsvec(人隐静脉内皮细胞)细胞，并在有或没有血凝因子x(fx)的情况下，以确定对fx介导的趋向性或没有趋向性的修饰的敏感性。将had5和had35用作对照载体。将细胞以10,000个细胞/孔的密度铺在96孔板中。用1000、5000和10,000个病毒颗粒(vp)每细胞的ad5luc、ad35luc和ad20-42-42luc+感染，在加入或不加入fx的情况下，在37℃持续3小时表达萤光素酶。3小时孵育后，除去培养基，在完全培养基中培养细胞48小时后进行萤光素酶转基因表达的分析，并表示为相对光单位(rlu)每毫克(mg)蛋白。
[0213]
使用双样本、双尾t检验计算组间的统计学显著性，其中认为p《0.05是统计学显著的(p《0.05*，p《0.01**)。所有结果代表了几次实验的平均数据，每个条件有四个重复(图10)。
[0214]
获得的数据显示，在fx存在下，ad20-42-42的转导潜力明显高于had5和had35。当应用10,000vp/细胞的剂量时，注意到最高的萤光素酶表达，在fx存在下达到1.5x109的水平，而当没有fx时达到～1x108。因此，这些结果表明，ad20-42-42的转导被fx显著增强，并且在fx存在下，这个载体比两个对照载体具有更强的转导特性。
[0215]
通过使用三种不同的载体剂量(1000、5000和10,000vp/细胞)，在fx存在下对hsvec细胞进行lacz染色，证实ad20-42-42比had5对照载体更优越的转导谱。用简单的光学显微镜观察染色(图11)。
[0216]
正如预期，结果显示随着剂量的增加，染色逐渐增加。图11中从右到左显示了1000、5000和10,000vp/细胞的染色。ad20-42-42转导的细胞与had5转导的细胞相比，表现出更强的染色。
[0217]
总之，数据显示在fx存在下，ad20-42-42能够转导血管细胞并且比对照载体要高。这使得ad20-42-42成为很好的基因治疗载体候选者，可用于治疗内皮细胞起重要作用的疾病，如心血管疾病或癌症。
[0218]
实施例6：adv20-42-42的候选受体
[0219]
ad20-42-42区别于许多其他载体的一个重要特征是其与柯萨奇病毒-腺病毒受体(car)和cd46细胞受体结合的潜力，以及其在转导中对fx增强的敏感性，因此，扩大了可利用ad20-42-42载体进行基因治疗的人细胞和组织的范围。
[0220]
为了检测ad20-42-42与多种受体结合并将其作为细胞进入的工具的能力，使用了几种指示细胞类型。用ad20-42-42和作为对照载体的had5转导表达或缺乏car的中国仓鼠卵巢(cho)细胞；表达或缺乏唾液酸的cho细胞；以及表达或缺乏桥粒芯糖蛋白2(dsg2)的tc1细胞(图12a和12b)。用10,000vp/细胞转导细胞，并如上所述进行萤光素酶测定。
[0221]
与唾液酸和dsg2相比，从这些实验中获得的结果将car定义为在表面具有所有三种受体的细胞中，是ad20-42-42结合的潜在主要跨膜受体。
[0222]
进行了类似的实验以检测这个载体与cd46结合的能力，cd46是许多腺病毒类型常用于细胞进入的另一种受体。为了这个目的，用ad20-42-42和作为对照载体的had5转导含有或缺乏这个受体的不同异构体(bc1、bc2、c1和c2)的cho细胞。结果显示，ad20-42-42看起来在细胞感染过程中主要使用c2受体异构体。另一方面，对缺乏cd46的k1细胞的转导很差
(图12c和12d)。
[0223]
使用双样本、双尾t检验计算组间的统计学显著性，其中认为p《0.05是统计学显著的(p《0.05*，p《0.01**)。所有结果代表了几次实验的平均数据，每个条件有四个重复。误差条表示为平均值的标准误(sem)。
[0224]
这些发现表明，新型腺病毒载体ad20-42-42与存在于许多细胞类型中的car和cd46这两种受体结合。这拓宽了可由ad20-42-42载体转导的细胞类型的范围，可能有利于其在基因治疗中的用途。
[0225]
实施例7：ad20-42-42在小鼠中的生物分布
[0226]
为了检测ad20-42-42的生物分布、其对心血管系统(cvs)的影响及其作为基因递送载体的作用的目的，进行了体内实验。
[0227]
使用免疫正常的雄性小鼠，年龄为8-10周。形成六组动物(每个病毒测试组含有5只动物，对照pbs组3只动物)。为了去除循环的巨噬细胞并更有效地评估病毒在整个机体水平上的转运，在病毒给药前48小时将200μl氯磷酸盐脂质体(cl)静脉注射(i.v.)给药至相应的组。
[0228]
治疗组用单次病毒剂量(10x10
11
个病毒颗粒(vp)稀释在100μl pbs中)的ad20-42-42luc+或用作对照载体的had5luc进行i.v.感染。对照组则在同一时间点注射100ml pbs。
[0229]
病毒递送后48小时，在向动物注射0.5ml萤光素后，使用生物发光成像进行萤光素酶活性读出。动物维持在吸入式麻醉下。检测到的萤光素酶表达水平在图13中显示。
[0230]
成像完成后，处死动物并收集其器官(肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肠、胰腺和肺)。通过qpcr对载体基因组进行定量。
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在用had5感染的动物的对照组中，病毒主要分布在肝脏和脾脏中，在未用cl处理的组中，其水平分别为2x105和～3x105个生物发光单位，而在用cl预处理的组中，分布更高，在两个器官中接近5x105(图14a-14b)。
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另一方面，ad20-42-42似乎只有脾脏的趋向性，而在其他器官中没有检测到它。正如预期，与没有cl预处理的组(1x105)相比，加入cl时的总dna拷贝数显著更高(～2.5x106)(图14c-14d)。
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总之，这些数据表明，ad20-42-42具有良好的安全性谱，在研究中只发现了脾脏的趋向性，而在其他测试的器官中发现的dna拷贝数则很难检测到。ad20-42-42载体没有显示出对肝脏的任何趋向性，这使得它成为低肝脏可用性和毒性的载体，因此，更适合于基因治疗，其中基因转移到肝脏会阻碍在靶标组织中的效力。
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本领域技术人员会理解，可以对以上所述实施方案进行改变而不背离其广泛的发明概念。因此，应当理解本发明不限于所公开的特定实施方案，而是意图涵盖如本说明书定义的本发明的精神和范围内的修改。