一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法
技术领域
1.本发明涉及细胞分选技术领域，具体是一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法。
背景技术：2.间充质干细胞(mscs)作为骨髓基质细胞的前体细胞，表达多种造血相关因子，促进hspcs增殖、分化、成熟，因此骨髓msc具有维持骨髓正常造血功能，在造血调控中发挥重要的作用。由干骨髓标本取材不易目细胞数量少，并受年龄等因素影响，限制了研究及临床应用，研究显示胎盘间充质干细胞(pmscs)表面标志的表达于骨髓间充质干细胞相似，且在一定的诱导条件下，人胎盘源性间充质干细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞，诱导体系与人骨髓基质干细胞无明显差别，表明人胎盘源性间充质干细胞同样具有广泛的分化潜能，经研究表明，胎盘间充质干细胞胎儿侧(fpmscs)在分化、增殖及分子学方面的表现都优于母体侧，且胎盘有取材不受限制、间充质干细胞数量多、能预先培养储存等优势；
3.研究者们发现cd146可以作为mscs的表面标志物，而且cd146+mscs亚群具有更优越的生物学功能和治疗潜力，cd146在多种不同来源的mscs中均有表达，其对mscs的克隆形成、增殖、分化、免疫调节等功能的影响也不尽相同，研究发现pmscs表达cd146，cd146被认为是具有较强分化能力的mscs的关键标志物，cd146+fpmscs的成骨分化能力更强，cd146+fpmscs维持骨髓正常造血功能的作用有待于进一步研究；
4.但是目前缺乏获得cd146+fpmscs的方法，因此，本领域技术人员提供了一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，包括如下具体步骤：
7.s1、fpmscs分离：
8.将手术中获取的新鲜胎盘组织浸泡于含有无菌hbss的50ml离心管中，快速运输至实验室，运输过程中注意防止污染；
9.到达实验室后，在提前准备好的生物安全内将胎盘组织放置于无菌不锈钢托盘中，取胎儿侧组织若干，称重并记录标本的质量；
10.将胎盘组织放置于100mm
×
20mm培养皿中，加入hbss，用无菌剪刀和镊子将胎盘组织剪碎至约1mm3大小，能顺利通过10ml移液管即可；
11.将剪碎的标本用10ml移液管移至50ml离心管中，1500r/min离心5min，去除上清
液；
12.用10ml移液管将每2.0-3.0g的胎盘标本移至30ml消化液中，然后放至台式恒温振荡器中，于37℃、60r/min的环境中消化反应1-2h；
13.消化完全后，加入组织三倍体积的hbss，1500r/min离心5min，去除上清液；
14.将组织重悬于配制好的无血清培养基中，用移液管吸取离心好的组织通过70μm滤过膜滤过，滤过过程中用无血清培养基反复冲洗，并不停的旋转移液管，使滤过充分；
15.将过滤好的组织标本1500r/min离心5min，去除上清液，将细胞重悬于1ml红细胞裂解液中，反复吹打混匀，室温放置10min后1500r/min离心5min，去上清，重悬于1ml的hbss中，过40μm滤过膜滤过后得到细胞悬液；
16.s2、样本抗体标记：
17.用细胞计数板进行计数后，向获得的细胞悬液中加入封闭用鼠血清，然后冰上孵育20-30min；
18.分别调整细胞浓度为1
×
106/l的单细胞悬液100μl，将cd34-apc、cd45-apc-h7、cd144-pe、cd146-fitc各1μl加入各个单阳管中，将apc-，apc-cy7-，pe-和fitc-结合的同种型igg抗体各1μl加入各个单阴管中，空细胞管不加任何抗体。
19.调整细胞浓度为1
×
10
10
/l的单细胞悬液200μl，将cd34-apc，cd45-apc-cy7，cd144-pe和cd146-fitc各1μl加入样本管中；
20.分别调整细胞浓度为1
×
108/l的单细胞悬液100μl，将apc-，apc-cy7-，pe-和fitc-结合的同种型igg抗体各1μl，加入同型对照管。
21.标记好抗体，在4℃冰上孵育20-30min，然后1500r/min离心5min洗涤；
22.将样本管细胞重悬在500μlhbss中，同型对照管、单阳管细胞重悬于300μlhbss中，然后转移至圆底聚苯乙烯流式管中；
23.上机前加入7-aad viaprobe，并在冰上孵育10min；
24.准备预先加入cd146+fpmscs培养基500μl的细胞收集管；
25.将标本放在冰上，送至上机；
26.s3、细胞分选：通过上机操作分选出cd146+fpmscs悬液；
27.s4、纯度测定：吸取分选后的cd146+fpmscs悬液100μl，用hbss稀释成300μl，上机对分选后的细胞进行纯度回测。
28.作为本发明更进一步的方案：步骤1中消化液由hbss和ⅰ型胶原酶、ⅳ型胶原酶、分散酶组成，其中ⅰ型胶原酶、ⅳ型胶原酶、分散酶的终质量浓度分别为100、100、1.2mg/l。
29.作为本发明更进一步的方案：步骤1中消化反应期间每隔20min取出标本置于超净台中，用移液管吹打10次，并观察消化情况直至块状组织消融，成浆液状即可。
30.作为本发明更进一步的方案：步骤2中鼠血清与细胞悬液的体积比为1∶20。
31.作为本发明更进一步的方案：s3中上机操作的具体流程如下：
32.a1：开机并做无菌管路制备，运行cst质控，确保仪器状态正常，；
33.a2：主液流设置：安装85μm的喷嘴，打开主液流断点窗的stream按钮，调节液滴振幅(ampl)，使液流断点位置位于窗口中上部(1/3处)，第1液滴的值落在220左右，液滴间隔值(gap)保持恒定；
34.a3：侧液流设置：打开侧液流窗电压，激活分选测试窗，点击test sort按钮，调节
主液流窗中的ampl，使四束偏转液流和废液流5个光斑间距拉开，打开分选窗，点开分选门，调节各路电压条，使偏转的分选液流落入分选对应的收集管中；
35.a4：手动确定液滴偏转延迟：建立一个新的experiment，再建立specimen和tube两个子文件夹，在电脑的通用工作页面建立获取模板，用横轴ffc和纵轴ssc建立一个散点图，并设单个微球的矩形门p1，点击tube使其变为绿色的采集箭头，打开分选窗口，在device窗口中将选项设为2tube，点击load按钮上样accudrop beads，调整流速为2000-4000events/s，打开分选电压，调整drop delay值，使左框中粗调和细调的光斑值均≥99％；
36.a5：样本分析：建立experiment名为fpmscs，并在通用工作页面(global sheet)建立获取模版，上样本，调试各参数的电压、补偿后获取数据，圈定需要分选的细胞cd146+fpmscs；
37.a6：分选：分选装置设置为4路分选模式，采用其中一路进行分选，并命名为cd146+fpmscs；
38.作为本发明更进一步的方案：a6中分选采用低速(流速为1-2)分选，使细胞以较低的流速运行，且分选后分别用清洗液和无菌水对管路进行彻底冲洗。
39.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过分离人胎盘胎儿侧间充质干细胞后，采用多参数流式分选技术，分选群体可单一分选也可多群体分选，即可进行细胞分析，又可进行精确的细胞分选，具有耗时短、灵活性强的优点；
40.经对分选后的目的细胞进行纯度回测，其纯度可以达到90.3％，对未来干细胞实验研究和临床应用奠定基础。
附图说明
41.图1为一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法中分选数据图；
42.图2为一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法中分选后cd146+fpmscs的纯度回测结果图。
具体实施方式
43.请参阅图1～2，本发明实施例中，一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，包括如下具体步骤：
44.s1、fpmscs分离：
45.将手术中获取的新鲜胎盘组织浸泡于含有无菌hbss的50ml离心管中，快速运输至实验室，运输过程中注意防止污染；
46.到达实验室后，在提前准备好的生物安全内将胎盘组织放置于无菌不锈钢托盘中，取胎儿侧组织若干，称重并记录标本的质量；
47.将胎盘组织放置于100mm
×
20mm培养皿中，加入hbss，用无菌剪刀和镊子将胎盘组织剪碎至约1mm3大小，能顺利通过10ml移液管即可；
48.将剪碎的标本用10ml移液管移至50ml离心管中，1500r/min离心5min，去除上清液；
49.用10ml移液管将每2.0-3.0g的胎盘标本移至30ml消化液中，然后放至台式恒温振
荡器中，于37℃、60r/min的环境中消化反应1-2h；
50.消化完全后，加入组织三倍体积的hbss，1500r/min离心5min，去除上清液；
51.将组织重悬于配制好的无血清培养基中，用移液管吸取离心好的组织通过70μm滤过膜滤过，滤过过程中用无血清培养基反复冲洗，并不停的旋转移液管，使滤过充分；
52.将过滤好的组织标本1500r/min离心5min，去除上清液，将细胞重悬于1ml红细胞裂解液中，反复吹打混匀，室温放置10min后1500r/min离心5min，去上清，重悬于1ml的hbss中，过40μm滤过膜滤过后得到细胞悬液；
53.s2、样本抗体标记：
54.向获得的细胞悬液中加入封闭用鼠血清，然后冰上孵育20-30min，用细胞计数板进行计数；
55.调整细胞浓度为1
×
10
10
/l的单细胞悬液200μl，将cd34-apc，cd45-apc-cy7，cd144-pe和cd146-fitc各1μl加入样本管中；
56.分别调整细胞浓度为1
×
108/l的单细胞悬液100μl，将apc-，apc-cy7-，pe-和fitc-结合的同种型igg抗体各1μl，加入同型对照管(同型对照1管、单阳5管、单阴5管和空细胞1管)；
57.分别将cd34-apc、cd45-apc-h7、cd144-pe、cd146-fitc各1μl加入各个单阳管中，同时设置单阴管，空细胞管不加任何抗体，另外设置对应的补偿微球管；
58.标记好抗体，在4℃冰上孵育20-30min，然后1500r/min离心5min洗涤；
59.将样本管细胞重悬在500μlhbss中，同型对照管、单阳管细胞重悬于300μlhbss中，然后转移至圆底聚苯乙烯流式管中；
60.上机前加入7-aad viaprobe，(每106-107个细胞加20μl)并在冰上孵育10min；
61.准备预先加入cd146+fpmscs培养基500μl的细胞收集管；
62.将标本放在冰上，送至上机；
63.s3、细胞分选：通过上机操作分选出cd146+fpmscs悬液；
64.s4、纯度测定：吸取分选后的cd146+fpmscs悬液100μl，用hbss稀释成300μl，上机对分选后的细胞进行纯度回测，参阅说明书附图1和2，其中附图1中p1为目的细胞群，p2为去除黏连体的细胞群，p3为活细胞群，p4为cd45-细胞，p5为cd144-cd34-细胞，p6为分选前的cd146+cd45-cd144-cd34-细胞，其占比为28.1％；
65.附图2中分选后cd146+fpmscs的纯度可达到90.3％
66.进一步的，步骤1中消化液由hbss和ⅰ型胶原酶、ⅳ型胶原酶、分散酶组成，其中ⅰ型胶原酶、ⅳ型胶原酶、分散酶的终质量浓度分别为100、100、1.2mg/l。
67.进一步的，步骤1中消化反应期间每隔20min取出标本置于超净台中，用移液管吹打10次，并观察消化情况直至块状组织消融，成浆液状即可。
68.进一步的，步骤2中鼠血清与细胞悬液的体积比为1∶20。
69.进一步的，s3中上机操作的具体流程如下：
70.a1：通过cst质控，仪器状态正常，并做无菌管路制备；
71.a2：主液流设置：安装85μm的喷嘴，打开主液流断点窗的stream按钮，调节液滴振幅(ampl)，使液流断点位置位于窗口中上部(1/3处)，第1液滴的值落在220左右，液滴间隔值(gap)尽量恒定；
72.a3：侧液流设置：打开侧液流窗电压，激活分选测试窗，点击test sort按钮，调节主液流窗中的ampl，使四束偏转液流和废液流5个光斑间距拉开，打开分选窗，点开分选门，调节各路电压条，使偏转的分选液流落入分选对应的收集管中；
73.a4：手动确定液滴偏转延迟：建立一个新的文件夹，再建立specimen和tube两个子文件夹，在电脑的通用工作页面建立获取模板，用横轴ffc和纵轴ssc建立一个散点图，并设单个微球的矩形门p1，点击tube使其变为绿色的采集箭头，打开分选窗口，在device窗口中将选项设为2tube，点击load按钮上样accudrop beads，调整流速为2000-4000events/s，打开分选电压，调整drop delay值，使左框中粗调和细调的光斑值均≥99％；
74.a5：样本分析：建立experiment名为fpmscs，并在通用工作页面(global sheet)建立获取模版，上样本，调试各参数的电压、补偿后获取数据，圈定需要分选的细胞cd146+fpmscs；
75.a6：分选：分选装置设置为4路分选模式，采用其中一路进行分选，并命名为cd146+fpmscs；
76.进一步的，a6中分选采用低速(流速为1-2)分选，使细胞以较低的流速运行，且分选后分别用清洗液和无菌水对管路进行彻底冲洗。
77.综上所述：本发明通过分离人胎盘胎儿侧间充质干细胞后，采用多参数流式分选技术，分选群体可单一分选也可多群体分选，即可进行细胞分析，又可进行精确的细胞分选，具有耗时短、灵活性强的优点；
78.经对分选后的目的细胞进行纯度回测，其纯度可以达到90.3％，且经过培养可连续稳定传代，对未来干细胞实验研究和临床应用奠定基础。
79.以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：s1、fpmscs分离：将手术中获取的新鲜胎盘组织浸泡于含有无菌hbss的50ml离心管中，快速运输至实验室，运输过程中注意防止污染；到达实验室后，在提前准备好的生物安全内将胎盘组织放置于无菌不锈钢托盘中，取胎儿侧组织若干，称重并记录标本的质量；将胎盘组织放置于100mm
×
20mm培养皿中，加入hbss，用无菌剪刀和镊子将胎盘组织剪碎至约1mm3大小，能顺利通过10ml移液管即可；将剪碎的标本用10ml移液管移至50ml离心管中，1500r/min离心5min，去除上清液；用10ml移液管将每2.0-3.0g的胎盘标本移至30ml消化液中，然后放至台式恒温振荡器中，于37℃、60r/min的环境中消化反应1-2h；消化完全后，加入组织三倍体积的hbss，1500r/min离心5min，去除上清液；将组织重悬于配制好的无血清培养基中，用移液管吸取离心好的组织通过70μm滤过膜滤过，滤过过程中用无血清培养基反复冲洗，并不停的旋转移液管，使滤过充分；将过滤好的组织标本1500r/min离心5min，去除上清液，将细胞重悬于1ml红细胞裂解液中，反复吹打混匀，室温放置10min后1500r/min离心5min，去上清，重悬于1ml的hbss中，过40μm滤过膜滤过后得到细胞悬液；s2、样本抗体标记：用细胞计数板进行计数后，向获得的细胞悬液中加入封闭用鼠血清，然后冰上孵育20-30min；分别调整细胞浓度为1
×
106/l的单细胞悬液100μl，将cd34-apc、cd45-apc-h7、cd144-pe、cd146-fitc各1μl加入各个单阳管中，将apc-，apc-cy7-，pe-和fitc-结合的同种型igg抗体各1μl加入各个单阴管中，空细胞管不加任何抗体；调整细胞浓度为1
×
10
10
/l的单细胞悬液200μl，将cd34-apc，cd45-apc-cy7，cd144-pe 和cd146-fitc各1μl加入样本管中；分别调整细胞浓度为1
×
108/l的单细胞悬液100μl，将apc-，apc-cy7-，pe-和fitc-结合的同种型igg抗体各1μl，加入同型对照管；标记好抗体，在4℃冰上孵育20-30min，然后1500r/min离心5min洗涤；将样本管细胞重悬在500μlhbss中，同型对照管、单阳管细胞重悬于300μlhbss中，然后转移至圆底聚苯乙烯流式管中；上机前加入7-aad viaprobe，并在冰上孵育10min；准备预先加入cd146+fpmscs培养基500μl的细胞收集管；将标本放在冰上，送至上机；s3、细胞分选：通过上机操作分选出cd146+fpmscs悬液；s4、纯度测定：吸取分选后的cd146+fpmscs悬液100μl，用hbss稀释成300μl，上机对分选后的细胞进行纯度回测。2.根据权利要求1所述的一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，其特征在于，步骤1中消化液由hbss和ⅰ型胶原酶、ⅳ型胶原酶、分散酶
组成，其中ⅰ型胶原酶、ⅳ型胶原酶、分散酶的终质量浓度分别为100、100、1.2mg/l。3.根据权利要求1所述的一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，其特征在于，步骤1中消化反应期间每隔20min取出标本置于超净台中，用移液管吹打10次，并观察消化情况直至块状组织消融，成浆液状即可。4.根据权利要求1所述的一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，其特征在于，步骤2中鼠血清与细胞悬液的体积比为1∶20。5.根据权利要求1所述的一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，其特征在于，s3中上机操作的具体流程如下：a1：开机并做无菌管路制备，运行cst质控，确保仪器状态正常；a2：主液流设置：安装85μm的喷嘴，打开主液流断点窗的stream按钮，调节液滴振幅，使液流断点位置位于窗口中上部，第1液滴的值落在220左右，液滴间隔值保持恒定；a3：侧液流设置：打开侧液流窗电压，激活分选测试窗，点击test sort按钮，调节主液流窗中的ampl，使四束偏转液流和废液流5个光斑间距拉开，打开分选窗，点开分选门，调节各路电压条，使偏转的分选液流落入分选对应的收集管中；a4：手动确定液滴偏转延迟：建立一个新的experiment，再建立specimen和tube，在电脑的通用工作页面建立获取模板，用横轴ffc和纵轴ssc建立一个散点图，并设单个微球的矩形门p1，点击tube使其变为绿色的采集箭头，打开分选窗口，在device窗口中将选项设为2tube，点击load按钮上样accudrop beads，调整流速为2000-4000events/s，打开分选电压，调整drop delay值，使左框中粗调和细调的光斑值均≥99％；a5：样本分析：建立experiment名为fpmscs，并在通用工作页面建立获取模版，上样本，调试各参数的电压、补偿后获取数据，圈定需要分选的细胞cd146+fpmscs；a6：分选：分选装置设置为4路分选模式，采用其中一路进行分选，并命名为cd146+fpmscs。6.根据权利要求1所述的一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选cd146+细胞的方法，其特征在于，a6中分选采用低速分选，使细胞以较低的流速运行，且分选后分别用清洗液和无菌水对管路进行彻底冲洗。
技术总结本发明涉及细胞分选技术领域，具体是一种从无血清培养的人胎盘胎儿侧间充质干细胞中分选CD146+细胞的方法，其步骤包括S1：fPMSCs分离、S2：样本抗体标记、S3：细胞分选、S4：纯度测定。本发明通过分离人胎盘胎儿侧间充质干细胞后，采用多参数流式分选技术，既可进行细胞分析，又可对单一细胞或多群细胞进行精确分选，具有耗时短、灵活性强的优点，通过对分选后的目的细胞进行纯度回测，其纯度可以达到90.3％，对未来干细胞实验研究和临床应用奠定基础。基础。基础。
技术研发人员：杨婷婷 郑波 杨继辉 张磊 许飞 马洁 张思齐
受保护的技术使用者：宁夏医科大学总医院
技术研发日：2022.04.25
技术公布日：2022/7/5
