一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向hbv受体的多肽及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向hbv受体的多肽及其应用。
背景技术：2.包膜病毒感染细胞的过程，依赖于病毒包膜蛋白与细胞表面受体的结合。因此，干扰病毒包膜蛋白与受体的结合，可成为有效的抗病毒策略。要实现这种策略，可以封闭相应的病毒包膜蛋白，或者封闭细胞表面的相应受体，从而阻止二者的结合。能与受体相互作用，从而阻止其与病毒蛋白结合的分子，可以是化合物分子或者多肽分子。与化合物分子相比，多肽分子由氨基酸模块组成，通过改变序列和长度可以获得巨大的分子多样性。同时，多肽可以由dna编码和表达，相对容易实现低成本筛选。因此，多肽已成为一类重要的候选药物来源。
3.筛选与特定蛋白分子结合的多肽，通常可利用一些表面展示技术，比如噬菌体展示技术、酵母细胞表面展示技术，核糖体展示技术等。这些展示技术系统通常包含两种主要成分。一种是用于展示随机多肽的平台，如噬菌体，酵母细胞等；另一种是目标蛋白分子。大体筛选原理，是将目标蛋白分子固定于某种载体，然后去结合展示于噬菌体或酵母细胞表面的多肽分子。不能被结合的噬菌体或酵母细胞，将被淘筛去除。而能被结合的噬菌体或酵母细胞，则被收集下来，做进一步反复淘筛。最终获得的噬菌体或酵母细胞所表达的多肽，就可能是与目标蛋白有相当亲和力的分子。
4.然而，在筛选与病毒受体相互作用的多肽时，常用的表面展示技术可能存在困难。首先，这些多肽往往要经过某种修饰，才能发挥作用。这些修饰虽然在人体细胞中可以自动进行，但在低等生物细胞中却不能完成。例如，与hbv受体ntcp结合的多肽，需要在其n端具有豆蔻酰化修饰。其次，受体蛋白通常是膜蛋白。一方面，膜蛋白很难从原核细胞表达与纯化；另一方面，在脱离膜结构时，膜蛋白很可能不形成具有功能的正常结构，因而无法作为实际筛选靶标。
技术实现要素：5.本发明的发明人在进行抑制乙肝病毒的多肽的研究中，发现现有的表面展示技术难以应用在所研究的课题中，针对现有表面展示技术的上述问题，开发了一种基于人源细胞的表面展示技术系统，在该表面展示技术基础上筛选到了能够抑制乙肝病毒感染的多肽。因此，本发明要求保护如下技术方案：
6.一种基于人源细胞的表面展示技术，包括如下步骤：
7.s1、将受体蛋白与荧光蛋白融合，利用sleeping beauty转座子转染hek293细胞使其稳定表达于人源细胞膜，筛选后得到该受体蛋白融合荧光蛋白的稳定表达细胞系，然后裂解细胞膜，获得含有受体-荧光蛋白融合蛋白的膜碎片备用；
8.s2、将待筛选的多肽与fasl的跨膜序列以及荧光蛋白融合，构建荧光蛋白-fasl跨膜区-多肽融合蛋白质粒，然后利用sleeping beauty转座子转染hek293细胞，经筛选后，得到的稳定表达细胞系即为细胞表面展示多肽库；
9.s3、将步骤s1得到的受体-荧光蛋白融合蛋白膜碎片与步骤s2得到的稳定表达细胞系混合孵育，然后用流式细胞仪分选与受体亲和力高的展示细胞，经过进一步的筛选富集得到与受体具有高亲和力的目标多肽；
10.所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或者红色荧光蛋白，且受体蛋白和多肽分别融合的是不同的荧光蛋白。
11.所述表面展示技术用于筛选与hbv受体ntcp结合的多肽；
12.步骤s1中，所述受体蛋白为ntcp，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；所述裂解细胞采用的方法是反复冻融裂解破碎细胞膜，高速离心去上清后，用1ml注射器反复吹吸混匀细胞膜碎片使其基本呈现出均质状态；所述ntcp与绿色荧光蛋白由接头1连接，所述接头1的氨基酸序列为：wsgsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggsv(seq id no.47)；
13.步骤s2中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白，红色荧光蛋白cherry与fasl跨膜区之间由柔性接头2连接，所述柔性接头2的氨基酸序列为ggggs(seq id no.48)；fasl跨膜区与多肽之间由柔性接头3连接，所述柔性接头3的氨基酸序列为ssgsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggs(seq id no.49)；fasl跨膜区的氨基酸序列是kkrgnhstgl cllvmffmvl valvglglgm fqlfhlqke(seq id no.50)。
14.所述待筛选的多肽为将pres1 aa2-21的c端延伸7个随机氨基酸得到的随机多肽库。
15.本发明还保护由上述表面展示技术筛选得到的靶向hbv受体的多肽，所述多肽为217-3或217-4，217-3的氨基酸序列为(seq id no.51)：gtnlsvpnplgffpdhqldplwtsnkk，217-4的氨基酸序列为(seq id no.52)：gtnlsvpnplgffpdhqldplrrvaef。
16.所述多肽的n端有豆蔻酰化修饰。
17.蛋白质豆蔻酰化修饰(n-myristoylation)是由豆蔻酰化转移酶(n-myristoyltransferase,nmt)介导的，在蛋白质n端甘氨酸上共价连接上14-碳饱和脂肪酸。
18.本发明还保护上述的多肽在制备治疗乙型肝炎病毒的药物中的应用。
19.在上述应用技术方案中，所述多肽与hbv受体ntcp结合。
20.本发明还保护一种用于治疗乙型肝炎病毒的药物，所述药物包含上述的多肽。
21.所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂，药物剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂中的任意一种。
22.本发明的有益效果是：
23.为了解决现有技术中的展示技术系统不适合于与hbv受体ntcp(硫磺胆酸钠共转运蛋白)结合的多肽的筛选的技术问题，本发明建立了一种基于人源细胞的表面展示技术系统，以多肽pres12-21为优化起点，在其羧基末端延伸7个随机氨基酸，构建了细胞表面展示多肽库，然后利用hek293表达的ntcp-gfp融合蛋白，结合流式细胞分选以筛选对ntcp亲和力更高的多肽，通过7轮流式分选富集，二代测序结果显示，部分多肽富集程度超过1000倍。对富集程度较高的多肽逐一做流式分析，最终得到多肽217-3。与起始多肽myr21相比，
biosciences)；6
×
蛋白loading、蛋白marker(bio-rad)；sds-page凝胶配制试剂盒(atgene)，tris、sds、nacl、cacl2(生工，上海)，edta、dmso、rapamycin(solarbio，北京)。
40.2、主要材料来源
41.质粒模板来源：质粒rlucn-hbc，与中国专利申请cn 201610564291.6中的质粒rlucn-hbc相同，pch9/3091质粒由德国弗莱堡大学nassal实验室构建，pegfp-n1购自美国的clontech公司，lenticrisprv2、pspax2、pmd2.0g为麻省理工张峰实验室构建。
42.菌株：大肠杆菌dh5α购自索莱宝公司。
43.细胞：hek293购自atcc(美国模式培养物集存所)，hepg2-ntcp在重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室长期保存。
44.3、本发明实施例中使用引物序列如下：
45.[0046][0047]
注：引物序列中的n代表a,g,c或t；引物序列中的k代表g或t。
[0048]
4、本发明技术方案的总体技术方案设计
[0049]
我们以hbv pres1蛋白(乙型肝炎病毒前s1蛋白)的第2-21位氨基酸(pres1 aa2-21)序列为筛选和优化起点，因为pres1 aa2-21是参与pres1与hbv受体ntcp结合的重要序列。技术方案需要满足以下几项条件：(1)多肽序列的n端需要被豆蔻酰化，才具有与ntcp的结合能力；为此，我们利用人源细胞hek293表达这些多肽，以获得豆蔻酰化修饰；(2)待筛选的多肽具有序列多样性，为此，我们将pres1 aa2-21的c端延长7个随机氨基酸，以获得这种多样性(图1a)；(3)这些多肽需要被展示在细胞膜表面，为此，我们将多肽与fasl(fasl长278aa，为ii型跨膜糖蛋白，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成)的跨膜序列融合，以实现其在细胞膜表面的展示(图1a)；(4)这些多肽需要被带上荧光标记以便分选，为此，我们将多肽融合红色荧光蛋白cherry(图1a)；(5)这些多肽还需要从hek293细胞中稳定表达，以获得亲和表型与基因型的偶联；为此，我们利用sleeping beauty转座子，来构建随机多肽的稳定表达混合细胞系；(6)需要表达结构和功能正常的靶蛋白ntcp，同时ntcp也需要被荧光标记以便筛选；为此，我们利用hek293细胞表达融合蛋白ntcp-gfp，该融合蛋白将被表达于细胞膜上，我们将用反复冻融方式破碎细胞膜，然后，以位于细胞膜碎片上的ntcp-gfp作为筛选靶分子。
[0050]
整体筛选流程如下：首先，利用转座子构建稳定表达多样性多肽的融合蛋白，将多
肽展示在hek293细胞表面(图1b)；然后，将带有ntcp-gfp的细胞膜碎片与展示了多肽的hek293细胞孵育(图1c)；孵育的结果，是那些与ntcp亲和力较高的展示细胞，吸附更多的ntcp-gfp分子。将这些细胞悬混液用流式细胞仪分选(图1d)，选择那些表达cherry并且gfp信号较高的细胞，做进一步培养扩增(图1e)；再用经过扩增的细胞，与ntcp-gfp孵育后做下一轮筛选富集。如此反复分选富集数轮以后，提取细胞的基因组dna并用pcr扩增含有多样性多肽的区段，做二代测序，以鉴定其序列。选择那些丰度较高且富集程度较高的序列做进一步鉴定(图1f)，其中部分序列可能与ntcp有较高亲和力，因而具有进一步研究开发价值。
[0051]
实施例1质粒构建
[0052]
质粒gfp-frb，frb-gfp,cherry-fasl-fkbp，ntcp-gfp为前期构建，在此基础上构建其它质粒。
[0053]
质粒gfp-frb是以rlucn-hbc为骨架，将绿色荧光蛋白gfp基因插入在cmv启动子和sv40终止子之间的表达框内得到的质粒，其中gfp位于n端，frb位于c端。
[0054]
质粒frb-gfp是以rlucn-hbc为骨架，将绿色荧光蛋白gfp基因插入在cmv启动子和sv40终止子之间的表达框内得到的质粒，其中frb位于n端，gfp位于c端。
[0055]
质粒cherry-fasl-fkbp是以rlucn-hbc为骨架，将红色荧光蛋白-fasl-fkbp融合基因插入在cmv启动子和sv40终止子之间的表达框内之间得到的质粒。
[0056]
质粒ntcp-gfp以rlucn-hbc为骨架，将ntcp-gfb融合基因插入在cmv启动子和sv40终止子之间的表达框内得到的质粒。
[0057]
一、构建中间质粒lenti-ntcp-gfp-2a-blast，ntcp d157-165-gfp，ntcp-cherry，lenti-ntcp-cherry-2a-blast，ntcp 267s/f-cherry，ntcp d157-165-cherry，pres-d11-15-gfp
[0058]
其中，lenti-ntcp-gfp-2a-blast和lenti-ntcp-cherry-2a-blast用于构建稳定系，分别为ntcp-gfp和ntcp-cherry的稳定系，方便随取随用。
[0059]
pres-d11-15-gfp的构建，是以pres1 48为模板，用引物f d11-15+r d11-15扩出片段，该片段自连即可得到该质粒。
[0060]
以ntcp-gfp为模板，用引物fen-cmv+regfp扩增得到片段1。再以lenti-cas9-blast质粒(商购)为模板，用引物f lentiv2 p2a+r lenti preef-1α得到片段2。利用golden gate克隆法将片段1、2酶切连接得到质粒lenti-ntcp-gfp-blast。
[0061]
以ntcp-gfp为模板，用引物r de157-165+famp494 ggtt，f de157-165+ramp494 aacc扩增得到片段3、4，利用golden gate克隆法将片段3、4酶切连接得到质粒ntcp d157-165-gfp。
[0062]
以ntcp-gfp为模板，用引物f sv40 gg2+r gsntcp扩得片段5。以带有红色荧光蛋白基因cherry基因的质粒为模板，用fagca cherry+r gtta cherry扩出片段6。片段5、6酶切连接得到质粒ntcp-cherry。
[0063]
质粒ntcp-cherry构建完成后，以之为模板，f ttac267+ramp494 aacc，r gtaa267+famp494 ggtt扩增得到片段7、8，用引物r de157-165+famp494 ggtt，f de157-165+ramp494 aacc扩增得到片段9、10，利用golden gate克隆法将片段7、8酶切连接得到质粒ntcp 267s/f-cherry，片段9、10酶切连接得到质粒ntcp d157-165-cherry。
[0064]
pcr扩增反应体系为：作为模板的质粒10ng，正向引物f(10μm)/反向引物r(10μm)
各0.4μl，2
×
primestar max premix(takara)10μl，灭菌超纯水补齐体积至20μl。反应条件：95℃预变性3min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，36个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段。
[0065]
golden gate连接反应的反应体系为：bsmb iv2酶(neb)0.75μl、tango buffer 1μl、dtt 1μl、t7 dna ligase(neb)0.25μl、atp 1μl、待连接的各片段。各片段按照kb*20/gel回收的浓度(ng/μl)来计算加入的量，ddh2o补齐至10μl。反应条件：42℃5min，16℃5min，循环25次后，60℃5min。golden gate产物转化dh5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定成功后提小抽，即可得到目标质粒。
[0066]
二、构建质粒pt4-cherry-fasl-pres1 48-2a-blast(pt4-48)，pt4-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast(pt4-21)
[0067]
以cherry-fasl-fkbp为模板，用引物r gsfasl+f sv40 gg2扩增得到片段11，以pch9/3091为模板，f pres1+r gtta pres48扩增得到片段12，片段11、12酶切连接得到质粒cherry-fasl-pres1 48。
[0068]
pt4-48和pt4-21的构建分为以下两步：
[0069]
第一步，在cherry-fasl-pres1 48的基础上构建lenti-cherry-fasl-pres1 48-2a-blast，lenti-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast。
[0070]
以lenti-cas9-blast为模板，用引物f lentiv2 p2a+famp494 ggtt，r lentipreef-1α+ramp494 aacc分别扩出片段13、14，以cherry-fasl-pres1 48为模板，用引物fen-cmv+r atcc pres48，fen-cmv+r atcc pres21，分别扩出片段15、16。片段13、14、15酶切连接得到质粒lenti-cherry-fasl-pres1 48-2a-blast，片段13、14、16酶切连接得到质粒lenti-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast。
[0071]
第二步，在lenti-cherry-fasl-pres1 48-2a-blast，lenti-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast的基础上构建pt4-cherry-fasl-pres1 48-2a-blast(简称pt4-48)，pt4-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast(简称pt4-21)。
[0072]
以lenti-cherry-fasl-pres1 48-2a-blast为模板，用引物f atgg cherry-2+r blast-2扩出片段17；以lenti-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast为模板，用引物f atgg cherry-2+r blast-2扩出片段18；以pt4/hb(商购)为模板，用引物f pt4 rir-2+r cmv ccat扩出片段19。片段17、19连接得到质粒pt4-48，片段18、19连接得到质粒pt4-21。
[0073]
pcr反应体系和goldengate连接反应的体系同上。
[0074]
至此，pt4-48及pt4-21构建完成，pt4-48用于后续ntcp-pres1系统验证流式分选富集的可行性实验中比较pt4-21与pt4-48对于ntcp-gfp结合力的强弱，表明该系统理论上能够筛选出结合力更强的突变体。
[0075]
三、构建pt4-21+7随机多肽库
[0076]
之前的研究显示，n-肉豆蔻酰化修饰的pres1 aa2-21是pres1与其受体结合的高度保守区域。因此，我们在pres1 aa2-21的基础上，向c端延伸7个随机氨基酸构建随机多肽库。
[0077]
采用传统nnk法，构建21+7随机多肽库，即在pt4-cherry-fasl-pres1 21-2a-blast(pt4-21)的基础上构建了pt4-cherry-fasl-pres1 21+7随机多肽库(用pt4-21+7简写表示)，过程如下：
[0078]
以pt4-21为模板，用引物f1-nnk7tcca’21+r1-pres21tgga扩得一个大约5kb的片
段，取100ng做goldengate单一片段自连。goldengate连接重复15管，共获取150μl的连接产物体系。转化后不涂板，直接将转化产物加入lb培养基中，37℃,220rpm摇1h以复苏，加入氨苄青霉素至100μg/ml,继续摇12h，提中抽，即得到质粒pt4-21+7随机多肽库。pcr反应体系同上。
[0079]
golden gate连接反应的反应体系为：bsmb iv2酶0.75μl、tango buffer 1μl、dtt 1μl、t7 dna ligase 0.25μl、atp 1μl、自连片段100ng，ddh2o补齐至10μl。反应条件：42℃5min，16℃5min，循环30次后，60℃5min。golden gate产物转化dh5α感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定成功后提小抽，即可得到目标质粒，即为多肽库。多肽库构建完成后，用pt4/sb100x转座子系统转染hek293细胞，转染步骤按试剂操作说明书进行。经blasticidin筛选两周后，得到的稳定表达细胞系即为细胞表面展示多肽库。
[0080]
图6是随机延伸多肽库的一代测序结果。
[0081]
四、frb-gfp的基础上构建质粒pres1 48-gfp，pres1 21-gfp，以及筛选得到的10个突变体217-1～10-gfp
[0082]
以质粒frb-gfp为模板，用引物r bsmbi vect+f gsgfp扩出片段20；以cherry-fasl-pres1 48为模板，用f catg pres1+rpres 48扩出片段21。片段20、21连接得到质粒pres1 48-gfp。
[0083]
以pres1 48-gfp为模板，用引物r pres 20+famp494 ggtt，f pres 20+ramp494 aacc，分别扩出片段22、23，连接片段22、23得到质粒pres1 21-gfp。
[0084]
根据实施例2中筛选得到的10条候选序列(217-1——217-10)构建质粒突变体217-1～10-gfp用于后续实验：
[0085]
以pres1 21-gfp为模板，用引物racga217-1-gfp+famp494 ggtt，racga217-2-gfp+famp494 ggtt，racga217-3-gfp+famp494 ggtt，racga217-4-gfp+famp494 ggtt，racga217-5-gfp+famp494 ggtt，racga217-6-gfp+famp494 ggtt，racga217-7-gfp+famp494 ggtt，racga217-8-gfp+famp494 ggtt，racga217-9-gfp+famp494 ggtt，racga217-10-gfp+famp494 ggtt，ftcgt-gfp+ramp494 aacc分别扩出1个片段，依次命名为片段24
‑‑
34，其中，片段24-33分别与片段34连接可得到以下10个质粒突变体，依次为：1-krridqy，2-yilmdim，3-lwtsnkk，4-lrrvaef，5-rnkdchl，6-mgdvrsg，7-yvplmka，8-lylpiqm，9-hrdlral，10-ptlcfpg。
[0086]
pcr反应体系及goldengate连接反应同前面步骤一。
[0087]
实施例2流式分选富集可行性验证
[0088]
一、利用fkbp12-frb系统验证流式分选富集的可行性
[0089]
建立本发明技术方案中的筛选系统的关键之一，在于能够用流式细胞仪进行分选与富集，将那些能够结合ntcp的多肽展示细胞分离出来。为了验证这种流式分选方式的可行性，我们首先用雷帕霉素调控fkbp12-frb相互作用系统来进行模拟测试。
[0090]
将质粒gfp-frb转染hek293细胞，转染48小时后，用胰酶消化收集细胞并用pbs重悬，然后将细胞用液氮及37℃水浴反复冻融裂解细胞。离心去除裂解后的细胞碎片，获得含有融合蛋白gfp-frb的上清备用。将质粒cherry-fasl-fkbp转染hek293细胞，转染48小时后，消化收集细胞，并用pbs重悬。取细胞悬液2份，分别与前述含有gfp-frb的裂解液37℃孵育1小时。其中1份在孵育前加入雷帕霉素(rapamycin)，另一份不做处理作为对照。随后，用
流式细胞仪分析两份样品。分析结果如图2所示，在未加入雷帕霉素时，那些能表达cherry的细胞呈现红色荧光(红色线条)，但所有细胞均不呈现明显的绿色荧光。加入雷帕霉素的样品中，可见部分表达cherry的细胞同时也呈现明显较高水平的绿色荧光，表示这些细胞表面的fkbp在雷帕霉素辅助下，的确结合了gfp-frb。由于这群细胞与未结合gfp-frb的细胞有明显差异，因此可以由流式细胞分选出来。
[0091]
二、利用ntcp-pres1系统验证流式分选富集的可行性
[0092]
我们进一步验证了本发明的细胞表面展示技术能否用于pres1/ntcp相互作用检测。验证实验分为两个方面：
[0093]
(1)验证表达于膜上的ntcp-cherry蛋白能否与表达于胞浆的gfp-pres1蛋白(裂解细胞后)相互作用：采用反复冻融裂解高速离心取上清获得表达于胞浆的gfp-pres1蛋白。采用质粒ntcp-cherry转染hek293细胞，转染48小时后，消化收集细胞，并用pbs重悬。取细胞悬液与前述含有gfp-pres1的裂解液37℃孵育1小时。随后，用流式细胞仪分析样品。实验时同时采用ntcp、pres1进行缺失突变或点突变的融合蛋白质粒(前面构建的ntcp d157-165-cherry、ntcp 267s/f-cherry)作为对照转染hek293细胞获得缺失突变或点突变的ntcp-cherry、gfp-pres1。
[0094]
实验结果如图3所示，野生型ntcp-cherry与野生型gfp-pres1之间可检测到明显的相互作用，而将ntcp或者pres1进行缺失突变或点突变时，这种相互作用消失，与预期的结果一致。图3中，ntcp 267s/f-cherry是指ntcp第267位氨基酸点突变后与红色荧光蛋白的融合蛋白，ntcp d157-165-cherry是指ntcp第157-165位氨基酸缺失突变后与红色荧光蛋白的融合蛋白，pres1-d11-15-gfp是指pres1的第11-15位氨基酸缺失突变后与绿色荧光蛋白的融合蛋白。
[0095]
(2)参照(1)的方法，我们还验证了表达于膜上的cherry-fasl-pres1蛋白能否与表达于膜上的ntcp-gfp蛋白(反复冻融裂解成细胞膜碎片)相互作用。实验结果如图4所示，流式分析可检测到野生型ntcp-gfp与cherry-fasl-pres1之间的相互作用。当ntcp突变后(ntcp d157-165-gfp)，两分子间亲和力基本丧失。同时，pres1 48对ntcp-gfp的结合量明显高于pres1 21。这些结果均与预期一致。图4中，ntcp d157-165-gfp表示ntcp第157-165位氨基酸缺失突变后与绿色荧光蛋白的融合蛋白。
[0096]
三、利用ntcp-pres1系统进行浓度梯度结合试验
[0097]
为了证明该系统能反映蛋白结合量的多寡，我们又进行了浓度梯度结合试验。如图5所示，随着ntcp-gfp量的增加，细胞表面会结合更多ntcp-gfp膜蛋白。在此基础上，用竞争抑制试验来测试这种结合是否具有特异性，即在ntcp-gfp与细胞表面展示了pres1的细胞共孵育之前，用myr21(即豆蔻酰化修饰的pres1 21)多肽预处理ntcp-gfp，以封闭一部分ntcp。与此同时，用一个无关多肽处理ntcp-gfp及一个不作任何处理的ntcp-gfp样本作为对照。结果表明，无关多肽处理和不作处理结果相当，而myr21处理组的结合率下降。说明这种结合具有特异性，同时表明该系统可以分辨结合了不同量ntcp-gfp的情况，可以用于后续筛选。
[0098]
四、多肽库的筛选与验证
[0099]
将实施例1中得到的展示了随机多肽pt4-21+7的稳定表达细胞与ntcp-gfp膜蛋白(含有该融合蛋白的细胞膜碎片)以4:1的细胞数量比例共孵育2小时后，采用ntcp-pres1系
统，用流式细胞术分选出膜蛋白结合量最高5％的细胞，分选出来的细胞经过扩大培养以后，再次分选，如此反复分选富集7轮。对第5轮和第7轮富集扩增的细胞，提取基因组dna，并用pcr扩增(扩增引物对为f-21/r-21)包含多肽序列的片段，pcr反应程序是：95℃预变性3min；98℃10s，55℃5s，72℃10s，28个循环。胶回收纯化片段后做二代测序，并将该测序结果与初始多肽库的二代测序结果进行比较。测序结果显示，初始多肽库的多样性大于30万种，而经过5轮和7轮富集后，多样性明显减少到7万种左右(图7)。我们选择同时满足以下两种条件的第7轮富集序列：(1)二代测序中序列占比位列前10；(2)与初始多肽库相比，富集倍数(某序列在富集库的占比/在初始库中的占比)位列前10。
[0100]
依上述标准，总共得到10条候选序列，分别命名为217-1——217-10，如图8所示。这些序列的占比最高接近10％，富集倍数均大于1万倍。我们对这10条序列进行了进一步验证。验证方式与初筛方式有所不同，我们将ntcp-cherry直接展示于细胞表面，而将融合了gfp的pres1多肽从胞浆表达，因为这种方式更接近病毒感染时的状况。为确定此种方式的有效性，我们用融合蛋白gfp-frb(阴性对照)及pres1 21-gfp、pres1 48-gfp进行验证，结果如图9所示，与阴性对照相比，流式分析显示pres1 48和pres1 21均与ntcp-cherry存在明显结合，且pres1 48的结合强于pres1 21。这一结果表明，这种方式能很好地反映不同多肽与ntcp的亲和力差异。
[0101]
217-1——217-10、pres1 21、pres1 48、的氨基酸序列分别如下：
[0102]
pres1 21(即多肽pres1的第2-21位氨基酸)的氨基酸序列为(seq id no.53)：gtnlsvpnplgffpdhqldp。
[0103]
pres1 48(即多肽pres1的第2-48位氨基酸)的氨基酸序列为(seq id no.54)：gtnlsvpnplgffpdhqldpafrantanpdwdfnpnkdtwpdankvg。
[0104]
217-1——217-10的氨基酸序列为在pres2-21的基础上分别添加以下七个氨基酸：
[0105]
1-krridqy，2-yilmdim，3-lwtsnkk，4-lrrvaef，5-rnkdchl，6-mgdvrsg，7-yvplmka，8-lylpiqm、9-hrdlral，10-ptlcfpg。
[0106]
217-1——217-10的氨基酸序列依次如序列表中seq id no.55、56、51、52、57～62所示。
[0107]
我们将前述10条序列分别构建到pres1 21-gfp质粒框架中(在pres1-21的c端分别加上这些多肽序列，即实施例1中构建得到的质粒突变体217-1～10-gfp)，然后将10种质粒分别转染hek293细胞。48小时后收集细胞，反复冻融裂解后离心取上清。western blot检测显示，各上清样本中目标蛋白表达量相似(图9)。将这些上清分别与表达ntcp-cherry的稳定细胞共孵育2小时，然后进行流式细胞仪检测分析。结果显示，发现序列217-3、217-4在原pres1 21的基础上对ntcp膜蛋白的亲和力有显著提高，接近pres 148的结合水平(图9)。
[0108]
实施例3、在hepg2-ntcp细胞模型中验证myr-217-3的抗hbv感染作用
[0109]
体外合成实施例2筛选出的多肽217-3(n端豆蔻酰化修饰)，以及作为对照的多肽myr21。用不同浓度梯度的多肽预处理hepg2-ntcp 2小时，再感染乙肝病毒。每2天换液，到第七天时同时检测细胞培养上清中的hbeag和hbsag。结果显示(图10)，myr-217-3(n端豆蔻酰化修饰的多肽217-3)抑制hbv感染的ic50较myr-21改进了约8倍。
技术特征：1.一种基于人源细胞的表面展示技术，其特征在于，包括如下步骤：s1、将受体蛋白与荧光蛋白融合，利用sleepingbeauty转座子转染hek293细胞使其稳定表达于人源细胞膜，筛选后得到该受体蛋白融合荧光蛋白的稳定表达细胞系，然后裂解细胞膜，获得含有受体-荧光蛋白融合蛋白的膜碎片备用；s2、将待筛选的多肽与fasl的跨膜序列以及荧光蛋白融合，构建荧光蛋白-fasl跨膜区-多肽融合蛋白质粒，然后利用sleepingbeauty转座子转染hek293细胞，经筛选后，得到的稳定表达细胞系即为细胞表面展示多肽库；s3、将步骤s1得到的受体-荧光蛋白融合蛋白膜碎片与步骤s2得到的稳定表达细胞系混合孵育，然后用流式细胞仪分选与受体亲和力高的展示细胞，经过进一步的筛选富集得到与受体具有高亲和力的目标多肽；所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或者红色荧光蛋白，且受体蛋白和多肽分别融合的是不同的荧光蛋白。2.如权利要求1所述的表面展示技术，其特征在于：所述表面展示技术用于筛选与hbv受体ntcp结合的多肽；步骤s1中，所述受体蛋白为ntcp，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；所述裂解细胞采用的方法是反复冻融裂解破碎细胞膜；所述ntcp与绿色荧光蛋白由接头1连接，所述接头1的氨基酸序列为：wsgsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggsv；步骤s2中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白，红色荧光蛋白cherry与fasl跨膜区之间由柔性接头2连接，所述柔性接头2的氨基酸序列为ggggs；fasl跨膜区与多肽之间由柔性接头3连接，所述柔性接头3的氨基酸序列为ssgsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggsg gggsggggs；fasl跨膜区的氨基酸序列是kkrgnhstgl cllvmffmvl valvglglgm fqlfhlqke。3.如权利要求2所述的表面展示技术，其特征在于：所述待筛选的多肽为将pres1 aa2-21的c端延伸7个随机氨基酸得到的随机多肽库。4.一种靶向hbv受体的多肽，其特征在于：所述多肽为217-3或217-4，217-3的氨基酸序列为：gtnlsvpnplgffpdhqldplwtsnkk，217-4的氨基酸序列为：gtnlsvpnplgffpdhqldplrrvaef。5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于：所述多肽的n端有豆蔻酰化修饰。6.权利要求4或5所述的多肽在制备治疗乙型肝炎病毒的药物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述多肽与hbv受体ntcp结合。8.一种用于治疗乙型肝炎病毒的药物，其特征在于：所述药物包含权利要求4或5所述的多肽。9.如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂，药物剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂中的任意一种。
技术总结本发明公开了一种基于人源细胞的表面展示技术，包括：S1、将受体蛋白与荧光蛋白融合，获得含有受体-荧光蛋白融合蛋白的膜碎片备用；S2、将待筛选的多肽与FasL的跨膜序列以及荧光蛋白融合，构建荧光蛋白-FasL跨膜区-多肽融合蛋白质粒，得到的稳定表达细胞系为细胞表面展示多肽库；S3、将受体-荧光蛋白融合蛋白膜碎片与步骤S2得到的稳定表达细胞系混合孵育，然后用流式细胞仪分选与受体亲和力高的展示细胞，筛选富集得到与受体具有高亲和力的目标多肽；本发明还公开了靶向HBV受体的多肽217-3或217-4，经实验证实，Myr-217-3抑制HBV感染的IC50较Myr-21改进了约8倍。21改进了约8倍。21改进了约8倍。
技术研发人员：胡接力 王珮耘 黄爱龙
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2022/7/5
