一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器

一种检测dna甲基转移酶活性的sers传感器
技术领域
1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测dna甲基转移酶（dam mtase）活性的sers传感器。


背景技术：

2.dna甲基化在基因转录和基因表达等许多生物学过程中发挥着重要作用。它是一种化学修饰过程，通过dna甲基化转移酶（mtase）将s-腺苷甲硫氨酸（sam）中的甲基特异性地转移到特定dna识别序列中的腺嘌呤或胞嘧啶上。由异常 mtase 活性引起的异常甲基化会影响基因表达并进一步导致各种癌症。因此，开发一种用于检测mtase活性和筛选其抑制剂的高灵敏度生物传感器至关重要。已经报道了许多检测mtase活性的方法，包括电化学、荧光、比色法、光电化学和表面增强拉曼光谱（sers）。 在这些方法中，sers 因其高灵敏度和快速读出而备受关注。
3.sers作为一种强大的分析技术已被广泛研究用于检测蛋白质、小分子、核酸，因为它具有高灵敏度和快速读出的优点。sers tag是通过将拉曼报告分子固定在等离激元贵金属纳米颗粒（如au纳米球、ag纳米立方体和au纳米金星）的表面上来制造的。当拉曼报告分子位于纳米粒子周围“热点”处的极大增强电场中时，sers强度显着增强。与球形等离子体纳米粒子相比，纳米立方体由于角和边缘的尖锐特征提供了更大的sers增强，可以产生“避雷针”效应。此外，金纳米立方体（auncs）具有良好的生物相容性和长期稳定性，特别适合制备用于生物传感应用的sers tag。然而，auncs尚未应用于mtase活性的sers检测。
4.链置换扩增（sda）是一种等温核酸扩增方法，可提供超过10
10
倍的靶标dna扩增，并于1992年首次提出。从那时起，sda因其快速高效的优点被广泛用于检测核酸、蛋白质和小分子。在典型的sda过程中，主要涉及两种酶，切口内切核酸酶nb.bbvci和klenow片段聚合酶（3'
→
5' exo-，kfp）。 nb.bbvci，可以识别双链dna中5'-gctgagg-3'的特定序列，并在胞嘧啶（c）和胸腺嘧啶（t）之间切割一个3'-末端。kfp是从大肠杆菌中dna聚合酶i的大蛋白水解片段的定点突变获得的，该片段保留了聚合酶的活性，但失去了3'、5'-外切核酸酶活性。在sda过程中，kfp可以在dntp 存在的情况下，在nb.bbvci引起的切割位点3'-末端进行dna聚合反应。聚合导致位于切割位点下游的靶标dna的分离和包含靶标dna序列的双链dna的再生。重复切口-聚合-置换反应，导致靶标dna的循环扩增和灵敏度的提高。
5.温控电极是通过施加电流直接或间接加热电极表面的一种技术。其优点在于能够在保持溶液温度不变的同时迅速提高电极温度。目前尚未报道结合链置换放大和温控电极检测dam mtase活性的sers 生物传感器。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于温控电极和sda反应以及等离子体auncs增强的新型“turn-on”模式（响应信号随着目标浓度的增加而增加）的sers生物传感器，用于检测dam mtase活性。具体的，所述的sers生物传感器包括包括金盘温控电极haue，金电极aue，
限制性内切酶dpni，聚合酶kfp，切口核酸内切酶nb.bbvci，基底探针h1，引发探针tridna，捕获探针h2，信号探针sdna和信号分子4-mba组装在金纳米立方块表面的sers tag。通过提高haue的表面温度，dam mtase和dpni的活性显著增加，从而导致sda模板dna的快速产生。在sda过程中，释放的ssdna呈指数级扩增，其浓度与dam mtase的活性呈正相关，从而达到检测dam mtase活性的目的。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种检测dna甲基转移酶活性的sers传感器，所述的sers传感器包括金盘温控电极haue，金电极aue，限制性内切酶dpni，聚合酶kfp，切口核酸内切酶nb.bbvci，基底探针h1，引发探针tridna，捕获探针h2，信号探针sdna和信号分子4-mba组装在金纳米立方块表面的sers tag，其中：基底探针h1：5'-cgaccggatcaataagacttcaacctcagcctcactcttattgatcggtcgttttt-(ch2)
6-sh-3'；捕获探针h2：5'-ggttgaagtctcaataagacttcaacctcatttt-(ch2)
6-sh-3'；引发探针tridna：5'-tcaataagagtgaggc-3'；信号探针sdna：5'-gacttcaacctttt-(ch2)
6-sh-3'。
8.上述的一种检测dna甲基转移酶活性的sers传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）金纳米立方块的制备将0.6 ml 10 mm的nabh4溶液加入到含有10 mm haucl4的10 ml 0.1 m的ctab溶液中，轻摇2 分钟，随后打开反应瓶瓶塞于28℃水浴3 小时以确保溶液中的nabh
4 完全分解，得到金种子溶液；将2 ml 0.5 mm的haucl4溶液添加到由2 ml 0.2 m的ctac、1.5 ml 0.1 m的aa和50 μl金种子溶液组成的混合物中，于27℃保持15分钟，随后14000 rpm离心30 分钟，除去上清液后，将沉淀分散在1 ml 0.02 m的ctac 溶液中，得到粒径10 nm的金纳米粒子溶液；将125 μl粒径10 nm的金纳米粒子溶液与25 ml 0.1 m的ctac和1.825 ml 0.01 m的aa溶液在200 rpm磁力搅拌下于30℃混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950 rpm，加入25 ml 0.01 m的haucl4溶液并于30℃反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，随后8000 rpm离心20分钟，除去上清液后，将沉淀重新分散在1 ml 0.01 m的ctac溶液中，得到金纳米立方块溶液，储存在4 ℃备用；（2）sers tag的制备将5 μl 10 μm的sdna与5 μl 10 mm的tcep在室温下避光混合1小时，在此期间，25 μl金纳米立方块溶液离心后用水离心洗涤两次，离心条件为4500 rpm 10 min，去除上清液后，将所得沉淀与处理过的sdna混合，然后加入190 μl 0.01 wt. %的sds溶液，并于37℃ 300 rpm条件下孵育过夜，再加入2 μl 2 mm的4-mba乙醇溶液并在37℃条件下继续孵育2 h，得到 auncs/sdna/4-mba溶液；将auncs/sdna/4-mba溶液在4500rpm条件下离心三次，每次10 分钟，以去除未修饰的sdna和4-mba，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在0.01 wt. %的sds溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀分散在含有0.01 wt.% sds的10 mm ph 7.4的pb溶液中，随后每半小时加入一次 2 m的nacl，至最终nacl为0.1 m，得到sers tag溶液，于4 ℃保存备用；（3）酶辅助链置换扩增反应
温控金盘电极haue用0.05 μm氧化铝粉末进行抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗，再在0.5 m h2so4溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，最后用去离子水冲洗电极并在氮气下干燥；基底探针h1固定在haue之前，先在95℃加热5分钟，然后将其冷却至37℃；接下来，将5 μl 10 μm的捕获探针h1与含有0.2 m nacl的5 μl 10 mm的tcep在室温下避光混合1小时，将10 μl混合物滴在haue表面并在37℃条件下组装 2 小时，得到haue/h1；haue/h1用pbs缓冲液（10 mm pb，0.1 m nacl，ph 7.4）冲洗后，再在2 mm的mch中封闭1 h，得到haue/h1/mch；在捕获探针h1固定过程中，制备反应溶液1，所述反应溶液1包含1
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dam mtase reaction buffer和1
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buffer，总体积为 290 μl，然后向反应反应溶液1中加入不同浓度的dam mtase、20000 u
▪
ml-1 1.3 μl的dpni和, 5 μl 320 μm的sam，得到总体积为300μl的反应溶液2；将 haue/h1/mch浸入反应溶液2中，并用直流电加热电极，升高电极温度至37℃，孵育2小时，孵育完成后，取出200 μl反应溶液2，80℃灭活20分钟；将10 μl 10 μm的tridna添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在37℃ 600 rpm条件下孵育2 h，随后加入25 μl的10
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nebuffer
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2、25 μl的10
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buffer、10 μl 10 mm的dntp、1 μl 10000 u
▪
ml-1
的kfp和1 μl 5000 u
▪
ml-1
的nb.bbvci，在37℃ 600 rpm条件下反应2 h以扩增ssdna，再在80℃条件下失活20 min，得到sda反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用；（4）dam mtase 活性检测将5 μl 10 μm的捕获探针h2与5 μl 10 mm的tcep在室温下避光混合1小时，加入pbs缓冲液（10 mm pb，0.1 m nacl，ph 7.4）至混合液总体积为200 μl，然后将金电极aue浸入其中，4℃孵育过夜，得到aue/h2；用pbs缓冲液（10 mm pb，0.1 m nacl，ph 7.4）冲洗aue/h2表面后，将aue/h2极依次在0.2 ml 2 mm的mch和0.2 ml 1 %的bsa中各室温孵育1 h，得到aue/h2/mch/bsa；aue/h2/mch/bsa用pbs缓冲液（10 mm pb，0.1 m nacl，ph 7.4）冲洗并在氮气下干燥，将10 μl sda反应后的溶液滴在aue/h2/mch/bsa的表面，在37 ℃条件下孵育1 h，得到aue/h2/mch/bsa/ssdna；将aue/h2/mch/bsa/ssdna浸入200 μl 37℃的sers tag溶液中孵育2 h，得到aue/h2/mch/bsa/ssdna/4-mba/sdna/auncs；将孵育后的电极用超纯水冲洗，氮气吹干，进行拉曼检测。
9.上述的一种检测dna甲基转移酶（dam mtase）活性的sers传感器的制备方法中，所述的sda反应所扩增的ssdna的序列为5'-tgaggttgaagtcttattga-3'。
10.本发明传感器原理：本发明用于dam mtase活性检测的sers传感器的检测原理如图1所示。首先，通过用 sdna和4-mba对auncs功能化来制备作为sers tag的auncs/sdna/4-mba。基地探针h1被设计成包括识别序列的两个部分，一个部分可以被dam mtase识别，另一个部分（红色序列）与tridna互补。h1序列（5'-gatc-3'）中的腺嘌呤残基在dam mtase存在下可被甲基化，然后被内切酶dpni在甲基化位置特异性识别和切割。通过应用温控电极优化温度以提高dam mtase和dpni的活性，提高了传感器的灵敏度。接下来，temdna（从甲基化h1上切割下来）可以与tridna杂交形成 temdna/tridna双链体，这将在kfp和dntp存在下引发dna聚合反应，形成完整的双链dna（dsdna）。随后，dsdna将被nb.bbvci切割以触发由kfp催化的新dna聚合反应。同时，上述dsdna中聚合形成的ssdna序列会被新聚合的ssdna序列所取代。重复切口-聚合-置换过程，导致循环扩增，从而产生大量的ssdna。然后将含有ssdna的溶液滴在aue/
h2/mch/bsa上，得到aue/h2/mch/bsa/ssdna。具体而言，ssdna通过碱基互补配对打开捕获探针h2，并呈现h2中的非互补序列，该非互补序列可以与固定在auncs/sdna/4-mba sers tag上的sdna杂交，得到最终的sers基底电极aue/h2/mch/bsa/4-mba/sdna/auncs。因此，可以从该电极表面测量sers 信号。总之，本发明成功研制出了用于检测dam mtase活性的sers传感器。
11.本发明的显著优点在于：本发明sers生物传感器中，结合aunc增强sers、链置换放大（sda）策略以及温控金盘电极（haue）的优点，提出了一种sers 生物传感器，用于高灵敏度检测dam甲基转移酶（mtase）的活性。由于角和边缘的尖锐特征，aunc提供了更大的sers增强。此外，aunc具有良好的生物相容性和长期稳定性，特别适合制备用于生物传感应用的 sers 标签。随着电极温度的升高， dam甲基转移酶和限制性内切酶dpni的活性增强，sers信号增强，检测限大大降低。通过简单地改变dna序列和相应的限制性内切酶，生物传感器将可用于不同种类甲基转移酶活性的检测。
附图说明
12.图1 为本发明sers生物传感器原理图。
13.图2为传感器检测性能优化图，其中a为对dna甲基化及酶切温度进行的优化，b为sda反应时间进行的优化，c为ssdna杂交时间优化d为对sers tag组装时间的优化。图3为所述传感器的灵敏度检测结果图，其中a为4-mba的拉曼谱图，b为4-mba在1585 cm
−1处峰强与dam mtase浓度（0.0001-35 u ml
−1）对数线性关系曲线。c为4-mba在1585 cm
−1处峰强与dam mtase浓度（0.0001-0.5 u ml
−1）对数线性关系曲线。
14.图4为传感器的抑制剂影响探究结果图，a：抑制剂5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，200 μm）对dpni, kfp and nb.bbvci的影响；b：不同浓度抑制剂5-氟尿嘧啶对dam mtase活性的影响曲线。
具体实施方式
15.实验所用缓冲液及核苷酸序列缓冲液：tris-hcl buffer (10 mm, ph 7.4)，pbs buffer (10 mm pb, 0.1 m nacl, ph 7.4), 10
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dam mtase reaction buffer (50 mm tris-hcl, 5 mm β-me, 10 mm edta, ph 7.5), 10
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buffer (50 mm potassium acetate, 20 mm tris-acetate, 10 mm magnesium acetate, 100
ꢀµ
g ml
−
1 recombinant albumin, ph 7.9), 10
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nebuffer
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2 (50 mm nacl, 10 mm tris-hcl, 10 mm mgcl2, 1 mm dtt, ph 7.9), 10
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buffer (50 mm potassium acetate, 20 mm tris-acetate, 10 mm magnesium acetate, 100
ꢀµ
g ml
−
1 recombinant albumin, ph 7.9), and 5
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tbe buffer (445 mm tris, 445 mm boric acid, 10 mm edta, ph 8.0-8.6).表1.实验中所用到的核苷酸序列
实施例1传感器的制备（1）金纳米立方块的制备首先制备金种子溶液。将nabh4溶液（0.6 ml，10 mm）加入到含有haucl4（10 mm）的10 ml ctab（0.1 m）溶液中，盖紧反应瓶瓶塞，轻轻摇动 2 分钟，然后打开反应瓶瓶塞并将反应瓶置于28℃水浴3小时，以确保溶液中的nabh4完全分解，得到金种子溶液。
16.其次，制备粒径为10 nm的金纳米粒子。将haucl4溶液（2 ml, 0.5 mm）添加到由ctac（2 ml, 0.2 m）、aa（1.5 ml, 0.1 m）和金种子溶液（50 μl）组成的混合物中，将反应液置于27 ℃保持15分钟，随后14000 rpm离心30分钟，除去上清液后，将所得沉淀分散在ctac溶液（1 ml，0.02 m）中，得到金纳米粒子溶液。
17.最后，制备金纳米立方块。将前一步制备的金纳米粒子溶液（125 μl）与ctac（25 ml，0.1 m）和aa（1.825 ml，0.01 m）溶液在磁力搅拌（200 rpm）下在30℃下混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950 rpm，再加入haucl4溶液（25 ml，0.01 m）并在30℃下反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，然后将混合溶液在8000 rpm条件下离心20分钟，除去上清液后，将所得沉淀重新分散在ctac溶液（1 ml, 0.01 m）中，得到金纳米立方块溶液，并储存在4℃备用。
18.（2）sers tag的制备将sdna（5 μl，10 μm）与tcep（5 μl，10 mm）在室温下避光混合1小时，得到sdna与tcep的混合物。在sdna与tcep混合的期间，将25 μl（1）中制得的金纳米立方块溶液在4500 rpm条件下离心10分钟，所得沉淀用超纯水4500 rpm离心洗涤两次，每次10 min，去除上清液后，将所得沉淀加入前一步的sdna与tcep的混合物中，然后加入190 μl sds溶液 (0.01 wt. %)，并于恒温振荡器（37℃，300 rpm）中孵育过夜，获得auncs/sdna溶液；向前一步的auncs/sdna溶液中加入4-mba 乙醇溶液（2 μl, 2 mm）并在37℃下继续孵育2 h，组装得到auncs/sdna/4-mba溶液；将auncs/sdna/4-mba溶液在4500 rpm条件下离心三次，每次10 min，以去除未修饰的sdna和4-mba，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在200 μl 0.01 wt. % 的sds溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀重新分散在200 μl含有0.01 wt. % sds的pb溶液（10 mm，ph 7.4）中，随后每半小时加入一次10 μl 2 m的nacl，使得nacl的终浓度达到0.1 m，得到sers tag溶液。将制备好的sers tag溶液于4 ℃保存备用。
19.（3）酶辅助链置换扩增反应（sda）
温控金盘电极（haue）用0.05μm氧化铝粉末进行打磨抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中各超声清洗一次，每次5分钟。再在0.5mh2so4溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，直到得到稳定可重复的循环伏安峰，最后用去离子水冲洗电极并用氮气吹干电极表面。
20.基底探针h1固定在haue之前，先在95℃条件下加热5分钟，然后自然冷却至37℃。接下来，将h1（5μl，10μm）与含有0.2mnacl的tcep（5μl，10mm）在室温下避光混合1小时，将10μl混合物滴在haue表面，37℃孵育2小时，通过au-s键形成haue/h1。用pbs缓冲液（10mmpb，0.1mnacl，ph7.4）冲洗haue/h1，随后浸入mch（2mm）中室温封闭1h，形成haue/h1/mch。在h1固定在haue的过程中，制备反应溶液1，该反应溶液1包含1
×
dammtasereactionbuffer和1
×
rcutsmart
™
buffer，总体积为290μl；然后向反应溶液1中加入不同浓度的dammtase、dpni（20000u
▪
ml-1
，1.3μl）和sam（320μm，5μl），总体积达到300μl，得到反应溶液2。将haue/h1/mch浸入反应溶液2中，并通过用6v直流电加热电极，升高电极温度至37℃，并在37℃条件下酶切2小时。酶切完成后，取出200μl反应溶液2，在80℃条件下灭活20分钟，随后进行sda反应。sda反应具体为：将tridna（10μl,10μm）添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在摇床（37
°
c，600rpm）中孵育2h，随后向其中加入10
×
nebuffer
™
2（25μl）、10
×
rcutsmart
™
buffer（25μl）、dntp（10mm,10μl）、kfp(10000u
▪
ml-1
，1μl）和nb.bbvci（5000u
▪
ml-1
，1μl），将混合溶液在摇床（37
°
c,600rpm）中进行sda反应，反应时间为2h，以扩增ssdna，再将混合溶液在80℃条件下失活20min，得到sda反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用。其中，所扩增的ssdna的序列为：5'-tgaggttgaagtcttattga-3'。
21.（4）dammtase活性检测根据上述处理haue的方法对用作sers衬底的金电极（aue，直径2mm）进行预处理。将捕获探针h2（5μl，10μm）与tcep（5μl，10mm）混合1小时，然后加入pbs缓冲液（10mmpb，0.1mnacl，ph7.4），至混合液总体积为200μl，然后将aue浸入混合溶液中，并于4℃孵育过夜，得到aue/h2。用pbs缓冲液（10mmpb，0.1mnacl，ph7.4）冲洗aue/h2表面后，将aue/h2依次在mch（0.2ml，2mm）和bsa（0.2ml，1%）中各室温孵育1h，得到aue/h2/mch/bsa。aue/h2/mch/bsa用pbs缓冲液（10mmpb，0.1mnacl，ph7.4）冲洗并在氮气下干燥，随后将上述sda反应后的溶液（10μl）滴在aue/h2/mch/bsa的表面，并在37℃条件下孵育1h，通过ssdna和h2的杂交获得aue/h2/mch/bsa/ssdna。最后，将aue/h2/mch/bsa/ssdna浸入200μl37℃的serstag溶液中2h，通过serstag中sdna和h2/ssdna的杂交获得aue/h2/mch/bsa/ssdna/4-mba/sdna/auncs。将aue/h2/mch/bsa/ssdna/4-mba/sdna/auncs用超纯水冲洗，氮气吹干表面，进行拉曼检测。每次随机采集7个点的sers信号，取平均值。
22.实施例2实验条件的优化为了使设计的传感器达到最佳检测性能，本实施例优化了4个实验参数：dna甲基化酶切反应的温度（25、30、34、37、40、43℃），sda反应时间优化（0.5、1、1.5、2、3h），ssdna杂交时间优化（0.5、1、2、3、4h），以及serstag组装的时间（0.5、1、1.5、2、3h）。
23.如图2所示，2a为对dna甲基化酶切反应的温度的优化，随着电极温度从25℃升高到44℃，拉曼强度继续增加，然而，当温度高于37℃时，拉曼强度降低。dammtase的结构可能会因高温而受损，相应的活性会降低。因此，选择37℃作为dna甲基化和酶切割过程的
最佳电极表面温度。2b为对sda反应时间优化，拉曼强度随着sda反应时间的延长而增加，当sda反应时间为2h时拉曼强度达到最大。因此，选择2h作为后续实验sda反应的最佳时间。2c为对ssdna杂交时间优化，拉曼强度随着杂交时间的延长而增加，当杂交时间为1h时拉曼强度达到最大。因此，选择1小时作为后续实验ssdna杂交时间的最佳条件。2d为对serstag组装的时间的优化，拉曼强度随着serstag组装时间的延长而增强并在2小时达到平台值，但在2小时后略有下降，可能是由于dna从aue上脱落。因此，选择2h作为后续实验serstag组装时间的最佳条件。
24.实施例3传感器对检测dammtase活性灵敏度检测在优化实验条件下，通过使用不同浓度的dammtase来探索本发明所提出的sers生物传感器的灵敏度。
25.如图3所示，随着dammtase浓度的增加，在1585cm-1
处的sers强度逐渐增强。dammtase浓度（从0.0001到0.5uml-1
）的对数与拉曼强度之间存在良好的线性关系。相应的回归方程为i
sers
=2042.27+497.72logc
dammtase
(u
▪
ml-1
，r2=0.996)。检测限（lod）计算为8.65
×
10-5u▪
ml-1
(s/n=3)。表明该传感器能够实现对dammtase活性的高灵敏度检测。
26.实施例4在实际样胎牛血清中检测dammtase活性为了评估本发明所提出的sers生物传感器在真实生物样品中检测dammtase活性的适用性，使用了含有三种不同浓度dammtase（0.5、10-3
、10-4u▪
ml-1
）的胎牛血清样品用于测量。
27.如表2所示，回收率范围为90.82%至104.7%，rsd范围为5.32%至11.1%，表明胎血清样品对所提出的sers生物传感器的干扰可以忽略不计。因此，本发明所提出的生物传感器具有在真实生物样品中灵敏地检测dammtase活性的潜力。
28.表2.稀释的胎牛血清样品中的dammtase活性检测实施例5dammtase活性抑制试验用于疾病治疗和去甲基化药物开发的dna甲基转移酶抑制剂的筛选引起了极大的关注。本发明选择一种抗生素药物（5-氟尿嘧啶）作为模型抑制剂来评估对dammtase的抑制作用。由于该方法涉及dpni、kfp和nb.bbvci，因此有必要排除抑制剂对这些酶的影响。dna完全甲基化后，将5-氟尿嘧啶（200μm）加入反应液中，考察抑制剂对系统中除dammtase外的其他酶的影响。
29.如图4a所示，在5-氟尿嘧啶存在与否的情况下，1585cm-1
处的拉曼峰强度没有明显变化，说明5-氟尿嘧啶对dpni、kfp和nb.bbvci的影响几乎可以被忽略。然后在dna甲基化反应液中加入不同浓度的5-氟尿嘧啶，考察其对dammtase的抑制作用。如图4b所示，随
着5-氟尿嘧啶的浓度从5 μm增加到100 μm，dam mtase的活性显著降低，这意味着对dam mtase的抑制作用逐渐增强。同时，半抑制浓度（ic50），定义为将酶活性降低50%所需的抑制剂浓度，在图4b中计算为7.99 μm。基于上述实验结果，所提出的传感器具有筛选mtase抑制剂的潜力。
30.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种检测dna甲基转移酶活性的sers传感器，其特征在于：所述的sers传感器包括金盘温控电极haue，金电极aue，限制性内切酶dpni，聚合酶kfp，切口核酸内切酶nb.bbvci，基底探针h1，引发探针tridna，捕获探针h2，信号探针sdna和信号分子4-mba组装在金纳米立方块表面的sers tag，其中：基底探针h1：5'-cgaccggatcaataagacttcaacctcagcctcactcttattgatcggtcgttttt-(ch2)
6-sh-3'；捕获探针h2：5'-ggttgaagtctcaataagacttcaacctcatttt-(ch2)
6-sh-3'；引发探针tridna：5'-tcaataagagtgaggc-3'；信号探针sdna：5'-gacttcaacctttt-(ch2)
6-sh-3'。2.如权利要求1所述的一种检测dna甲基转移酶活性的sers传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）金纳米立方块的制备将0.6 ml 10 mm的nabh4溶液加入到含有10 mm haucl4的10 ml 0.1 m的ctab溶液中，轻摇2 分钟，随后打开反应瓶瓶塞于28℃水浴3 小时以确保溶液中的nabh
4 完全分解，得到金种子溶液；将2 ml 0.5 mm的haucl4溶液添加到由2 ml 0.2 m的ctac、1.5 ml 0.1 m的aa和50 μl金种子溶液组成的混合物中，于27℃保持15分钟，随后14000 rpm离心30分钟，除去上清液后，将沉淀分散在1 ml 0.02 m的ctac溶液中，得到粒径10 nm的金纳米粒子溶液；将125 μl粒径10 nm的金纳米粒子溶液与25 ml 0.1 m的ctac和1.825 ml 0.01 m的aa溶液在200 rpm磁力搅拌下于30℃混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950 rpm，加入25 ml 0.01 m的haucl4溶液并于30℃反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，随后8000 rpm离心20分钟，除去上清液后，将沉淀重新分散在1 ml 0.01 m的ctac溶液中，得到金纳米立方块溶液，储存在4℃备用；（2）sers tag的制备将5 μl 10 μm的sdna与5 μl 10 mm的tcep在室温下避光混合1小时，在此期间，将25 μl金纳米立方块溶液离心后用水离心洗涤两次，离心条件为4500 rpm 10 min，去除上清液后，将所得沉淀与处理过的sdna混合，然后加入190 μl 0.01 wt. %的sds溶液，并于37℃ 300 rpm条件下孵育过夜，再加入2 μl 2 mm的4-mba乙醇溶液并在37℃条件下继续孵育2 h，得到 auncs/sdna/4-mba溶液；将auncs/sdna/4-mba溶液在4500rpm条件下离心三次，每次10 分钟，以去除未修饰的 sdna 和 4-mba，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在0.01 wt. %的sds溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀分散在含有0.01 wt.% sds的10 mm ph7.4的pb溶液中，随后每半小时加入一次2 m的nacl，直至nacl的终浓度为0.1 m，得到sers tag溶液，于4 ℃保存备用；（3）酶辅助链置换扩增反应温控金盘电极haue用0.05 μm氧化铝粉末进行抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗，再在0.5 m h2so4溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，最后用去离子水冲洗电极并在氮气下干燥；基底探针h1固定在haue之前，先在95℃加热5分钟，然后将其冷却至37℃；接下来，将5 μl 10 μm的捕获探针h1与含有0.2 m nacl的5 μl 10 mm的tcep室温避光混合1小时，将10 μl混合物滴在haue表面并在37℃条件下组装2小时，得到haue/h1；用含有0.1 m nacl的10 mm ph7.4的pbs缓冲液冲洗haue/h1后，再在2 mm的mch中封闭1 h，得到
haue/h1/mch；在捕获探针h1固定过程中，制备反应溶液1，所述反应溶液1包含1
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dam mtase reaction buffer和1
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rcutsmart
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buffer，总体积为290 μl，然后向反应溶液1中加入不同浓度的dam mtase、20000 u
▪
ml-1 1.3 μl的dpni和, 5 μl 320 μm的sam，得到总体积为300 μl的反应溶液2；将haue/h1/mch浸入反应溶液2中，并用直流电加热电极，升高电极温度至37℃，孵育2小时，孵育完成后，取出200 μl反应溶液2，80℃灭活20分钟；将10 μl 10 μm的tridna添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在37℃ 600 rpm条件下孵育2 h，随后加入25 μl的10
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nebuffer
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2、25 μl的10
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rcutsmart
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buffer、10 μl 10 mm的dntp、1 μl 10000 u
▪
ml-1
的kfp和1 μl 5000 u
▪
ml-1
的nb.bbvci，在37℃ 600 rpm条件下反应2 h以扩增ssdna，再在80℃条件下失活20 min，得到sda反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用；（4）dam mtase 活性检测将5 μl 10 μm的捕获探针h2与5 μl 10 mm的tcep室温避光混合1小时，加入含有0.1 m nacl的10 mm ph7.4的pbs缓冲液至混合液总体积为200 μl，然后将金电极aue浸入其中，4℃孵育过夜，得到aue/h2；用含有0.1 m nacl的10 mm ph7.4的pbs缓冲液冲洗aue/h2表面后，将aue/h2依次在0.2 ml 2 mm的mch(0.2 ml 1 %的bsa中室温孵育1 h，得到aue/h2/mch/bsa；aue/h2/mch/bsa用含有0.1 m nacl的10 mm ph7.4的pbs缓冲液冲洗并在氮气下干燥，将10 μl sda反应后的溶液滴在aue/h2/mch/bsa的表面，在37℃条件下孵育1 h，得到aue/h2/mch/bsa/ssdna；将aue/h2/mch/bsa/ssdna浸入200 μl 37℃的sers tag溶液中孵育2 h，得到aue/h2/mch/bsa/ssdna/4-mba/sdna/auncs；将孵育后的电极用超纯水冲洗，氮气吹干，进行拉曼检测。3.根据权利要求2所述的一种检测dna甲基转移酶 (dam mtase) 活性的sers传感器的制备方法，其特征在于：所述的sda反应所扩增的ssdna的序列为：5'-tgaggttgaagtcttattga-3'。

技术总结
本发明公开一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器。该传感器包括金盘温控电极，金电极，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4-MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag。通过提高温控金电极的表面温度，Dam MTase和DpnI的活性显着增加，从而导致SDA模板DNA的快速产生。在SDA过程中，释放的ssDNA呈指数级扩增，其浓度与Dam MTase的活性呈正相关。本发明检测限为8.65


技术研发人员：吴韶华 胡浩成
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2022.03.23
技术公布日：2022/7/5