1.本发明涉及幽门螺杆菌检测技术领域，具体涉及一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒。
背景技术：2.幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，其与许多消化道疾病如慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等的发生息息相关，是世界卫生组织公布的i类致癌因子。全球幽门螺杆菌感染率约为41％，而中国人群的幽门螺杆菌感染率高达59％。
3.目前针对幽门螺杆菌的检测方法大致可分为侵入性和非侵入性两种。非侵入性检测方法(non-invasive detection，nid)包括粪便抗原检测法(stool antigen test，sat)、抗体检测法(antibody-based test，abt)以及c13呼气检测法(c13-urea breath test，c13-ubt)等。其中，c13呼气检测法因高灵敏度和特异性等优点成为现阶段临床应用最广的一种幽门螺杆菌检测法。然而，c13呼气检测法的检测准确性容易受到一些因素，诸如饮食及药物等的影响。因此，急需建立一种新型的、不易受外源因素干扰的非侵入性幽门螺杆菌快速检测法，以弥补现有检测技术的不足。
4.近些年来，生物传感器技术领域迎来了前所未有的变革与发展，尤其是比色生物传感器技术领域。基于比色生物传感器建立的检测法具有成本低、操作简便、灵敏度及特异度高等优点。更为重要的是，比色生物传感器技术可通过颜色变化对检测结果进行直观判读，因而有望在临床快速诊断、新药评价及环境污染物监测等方面发挥重要作用。本发明旨在建立一种基于纳米金颗粒(aunps)的比色生物传感器检测法，通过肉眼或借助紫光吸收光谱仪判定结果，实现对粪便中幽门螺杆菌的快速检测。
技术实现要素：5.基于以上问题，本发明提供一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，本试剂盒与比色生物传感器检测技术结合具有较快的检测速度和较低的检测成本，检出限与已有方法的检出限相当甚至更优。
6.为解决以上技术问题，本发明提供了一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，所述试剂盒包括幽门螺杆菌特异性核酸适配体和经纳米金颗粒(aunps)修饰的寡核苷酸探针，所述幽门螺杆菌特异性核酸适配体的核苷酸序列见seq id no：1，所述寡核苷酸探针包括探针probe-1
20
和probe-2
20
，probe-1
20
的5’端和probe-2
20
的3’端均修饰有巯基(sh)，probe-1
20
和probe-2
20
的核苷酸序列分别见seq id no：2和seq id no：3。
7.进一步的，经纳米金颗粒(aunps)修饰的寡核苷酸探针的制备方法如下：首先采用柠檬酸钠还原法制备aunps溶液，制备方法如下：将15mg haucl4溶于51.5ml去离子水中，搅拌加热至100℃；随后加入3.5ml 1％柠檬酸钠溶液(w/v)并继续加热直至溶液由浅黄色变为暗红色，得到aunps溶液；
8.之后对寡核苷酸探针进行纳米金颗粒(aunps)修饰，修饰方法如下：将20μl寡核苷
酸探针与等体积的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)混合后室温孵育2小时，随后加入150μl制备好的aunps溶液，室温孵育4小时；将孵育后的溶液以12000rpm 4℃离心30分钟，用200μl缓冲液重悬沉淀即得，于4℃下保存备用。
9.进一步的，所述缓冲液的组成如下：100mm nacl，5mm kcl，50mm tris-hcl，1mm mgcl2，ph 7.5。
10.进一步的，所述试剂盒的检测方法如下：将5
×
5mm的粪便样本用500μl生理盐水稀释混匀后得到样本悬液，随后将5μl幽门螺杆菌特异性核酸适配体与200μl经纳米金颗粒(aunps)修饰的寡核苷酸探针混合，于室温下孵育10min，再加入10μl样本菌液并于室温孵育10min，最后通过肉眼观察或使用紫外分光光度计检测反应液，当反应液体系中不存在幽门螺杆菌时，反应液颜色由暗红色变为紫色，当反应液体系中存在幽门螺杆菌时，反应液颜色则为暗红色。
11.进一步的，所述试剂盒的检出限为25cfu/ml。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过aunps在聚集和解聚过程中颜色的变化，实现了对较低浓度幽门螺杆菌(25cfu/ml)的检测，且具有较良好的特异性，本发明与c13呼气检测法相比具有检测成本低、检测时间短(20分钟)以及不具有放射性等优点，因而有望成为临床中幽门螺杆菌感染的一种检测手段。
附图说明
13.图1为本发明的实施例的纳米金颗粒(aunps)表征结果；
14.图2为本发明的实施例的不同碱基数的探针所对应溶液的吸光值；
15.图3为本发明的实施例的幽门螺杆菌比色生物传感器检测法的检测原理图；
16.图4为本发明的实施例的比色生物传感器检测法的灵敏度和线性范围确定结果图；
17.图5为本发明的实施例的阴性对照及目标菌株的吸收波长对比图。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
19.实施例：
20.本实施例使用紫外可见分光光度计和透射电子显微镜(tem)对本实施例使用的aunps进行了表征。见附图1，其中a为aunps溶液的吸收峰，b为aunps的大小及形态特征；可见aunps在530nm处有特征吸收峰，且无其他杂峰出现，具有良好的特异性和稳定性；tem结果显示aunps分散良好，为直径约20nm的球形颗粒。
21.本实施例对探针的最佳长度、aunps和探针的结合位点进行了优化，如表1所示，对表1中的五组探针的表现均进行了测试。本实施例将aunps分别连在每组两个探针的远端，即：probe-1的5’端和probe-2的3’端，得到d-aunps探针，结果表明该探针(d-aunps)虽然同样能与幽门螺杆菌特异性核酸适配体结合，但溶液颜色没有发生变化，以上现象的发生可能是由于d-aunps探针与幽门螺杆菌特异性核酸适配体的结合仅在一定程度上缩短了
aunps之间的距离，但尚不足以引发aunps的有效聚集。因此本实施例又将aunps连在了每组两个探针的近端，即：probe-1的3’端和probe-2的5’端，此时在幽门螺杆菌特异性核酸适配体存在的情况下，溶液颜色由暗红色变为紫色，表明探针引发了aunps的有效聚集。
22.表1寡核苷酸探针长度的优化
[0023][0024][0025]
见附图2，其中小图为不同碱基数的探针所对应溶液的颜色，16～20号管分别对应碱基对数为16～20bp的探针混合溶液；最终结果显示探针probes-1
20
和peobes-2
20
引发的颜色变化最为明显，因此将20bp的长度作为探针的最佳长度。
[0026]
接下来用上述aunps与探针probes-1
20
和peobes-2
20
研究了该探针的各项检测性能，所用的幽门螺杆菌特异性核酸适配体序列如下：ccaggaggaccctattctcgtgtatcgacgagatccagtg(5’端至3’端)。所有待检样本均经由四川大学华西第四医院伦理委员会审批，编号为hxsy-ec-2021025，研究共采集了102份患者粪便样本，其中35份样本经c13呼气检测法检测为幽门螺杆菌阳性，另外67份样本为阴性，所有样本均于-80℃下保存。
[0027]
纳米金颗粒(aunps)溶液制备：采用柠檬酸钠还原法制备aunps，具体如下：将15mg haucl4溶于51.5ml去离子水中，搅拌加热至100℃；随后加入3.5ml 1％柠檬酸钠溶液(w/v)并继续加热直至溶液由浅黄色变为暗红色，得到aunps溶液，于4℃下保存备用。
[0028]
寡核苷酸探针修饰纳米金颗粒(aunps)：将20μl寡核苷酸探针(探针probes-1
20
和peobes-2
20
)与等体积的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)混合后室温孵育2小时，随后加入150μl aunps溶液，室温孵育4小时；将孵育后的溶液以12000rpm4℃离心30分钟，用200μl缓冲液(100mm nacl，5mm kcl，50mm tris-hcl，1mm mgcl2，ph 7.5)重悬沉淀，4℃下保存备用。
[0029]
比色生物传感器检测法：使用缓冲液将每个实验菌株(本实验室培养)从固体琼脂培养基上冲洗下来并调整od
600
至0.6，得到菌液；随后将5μl幽门螺杆菌特异性核酸适配体与200μl修饰了aunps的寡核苷酸探针溶液混合，室温孵育10min，再加入10μl菌液室温孵育10min，最后通过肉眼观察或使用紫外分光光度计测定吸光值以判定反应结果。
[0030]
比色生物传感器检测法用于粪便检测：将5
×
5mm的粪便样本用500μl生理盐水稀
释混匀，得到待检液，随后将5μl幽门螺杆菌特异性核酸适配体与200μl修饰了aunps的寡核苷酸探针溶液混合，室温孵育10min，再加入10μl待检液室温孵育10min；最后通过肉眼观察或使用紫外分光光度计测定吸光值以判定反应结果。
[0031]
见附图3，展示了基于aunp的比色生物传感器检测法的检测原理，其中右上角的图片为阳性样本及阴性样本的颜色对比，其中一管呈暗红色，为幽门螺杆菌阳性样本；其中一管呈紫色，为幽门螺杆菌阴性样本。两条寡核苷酸链(probe-1和probe-2)能与幽门螺杆菌特异性核酸适配体互补结合，且均有一端修饰了aunps。当体系中不存在幽门螺杆菌时，探针自发与幽门螺杆菌特异性核酸适配体结合，从而导致纳米金颗粒(aunps)的聚集，使溶液颜色由暗红色变为紫色；而当体系中存在幽门螺杆菌时，幽门螺杆菌特异性核酸适配体优先与菌体结合，导致探针解离，溶液颜色变为暗红色。
[0032]
本实施例确定了将本实施例的探针与比色生物传感器检测法结合检测幽门螺杆菌的灵敏度和线性范围。将幽门螺杆菌菌液进行梯度稀释，见附图4，其中a为不同菌液浓度下反应产物的紫外吸收光谱，小图中1～5号管分别为100、300、500、800、1000cfu/ml菌液浓度下的溶液颜色；b图为不同菌液浓度下反应产物的吸收峰波长。随着菌液浓度的上升，反应产物的吸收峰发生蓝移，说明aunps开始解聚；此外溶液颜色也由紫色变为暗红色。如图4b所示，在100-1000cfu/ml范围内，a530和菌液浓度之间呈良好的线性关系，r2＝0.9796。该方法的检出限(lod)为25cfu/ml(s/n＝3)，与已有检测方法的检测相当甚至更优，对比结果见表2。
[0033]
表2幽门螺杆菌比色生物传感器检测法与其他检测方法的比较
[0034]
[0035][0036]
本实施例通过检测其他细菌(包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌)对本实施例的方法特异性进行了评估，本研究所用菌株包括幽门螺杆菌(h.pylori)(atcc 43504)、大肠杆菌菌(e.coli)(atcc 8099)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)(atcc 6538)、单增李斯特菌(l.monocytogenes)(atcc 19118)和铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)(atcc27853)均购自于美国模式培养物集存库(atcc)，鼠伤寒沙门氏菌lt2(s.typhimurium)由犹他大学kelly t.hughes教授惠赠。见附图5，空白对照和除幽门螺杆菌外其他细菌所对应的吸收峰与目标菌株(幽门螺杆菌)的吸收峰之间存在明显差异，说明该方法具有较好的特异性。研究进行了三次重复实验，溶液吸光值的波动及标准误差均较小，表明本方法具有较好的可重复性。
[0037]
本实施例使用比色生物传感器检测法对102份粪便样本进行检测，结果表明所有经c13呼气检测法确定为阳性的样本，用比色生物传感器检测法检测的结果也均为阳性。
[0038]
本实施例成功建立了一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测方法，同时构建了可与幽门螺杆菌特异性核酸适配体结合的寡核苷酸探针，并对其进行了纳米金颗粒(aunps)修饰。当反应体系中不存在幽门螺杆菌时，结合了幽门螺杆菌特异性核酸适配体的寡核苷酸探针会导致aunps的聚集，从而使溶液的颜色由暗红色变为橙色；而当幽门螺杆菌特异性核酸适配体与幽门螺杆菌结合时，溶液的颜色仍为暗红色。
[0039]
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
技术特征：1.一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括幽门螺杆菌特异性核酸适配体和经aunps修饰的寡核苷酸探针，所述幽门螺杆菌特异性核酸适配体的核苷酸序列见seq id no：1，所述寡核苷酸探针包括探针probe-1
20
和probe-2
20
，probe-1
20
的5’端和probe-2
20
的3’端均修饰有巯基，probe-1
20
和probe-2
20
的核苷酸序列分别见seq id no：2和seq id no：3。2.根据权利要求1所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，其特征在于，经aunps修饰的寡核苷酸探针的制备方法如下：首先采用柠檬酸钠还原法制备aunps溶液，制备方法如下：将15mg haucl4溶于51.5ml去离子水中，搅拌加热至100℃；随后加入3.5ml 1％柠檬酸钠溶液(w/v)并继续加热直至溶液由浅黄色变为暗红色，得到aunps溶液；之后对寡核苷酸探针进行修饰，修饰方法如下：将20μl寡核苷酸探针与等体积的三(2-羧乙基)膦盐酸盐混合后室温孵育2小时，随后加入150μl制备好的aunps溶液，室温孵育4小时；将孵育后的溶液以12000rpm 4℃离心30分钟，用200μl缓冲液重悬沉淀即得，于4℃下保存备用。3.根据权利要求2所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液的组成如下：100mm nacl，5mm kcl，50mm tris-hcl，1mm mgcl2，ph 7.5。4.根据权利要求3所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测方法如下：将5
×
5mm的粪便样本用500μl生理盐水稀释混匀后得到样本悬液，随后将5μl幽门螺杆菌特异性核酸适配体与200μl经胶体金修饰的寡核苷酸探针溶液混合，于室温下孵育10min，再加入10μl样本悬液并于室温孵育10min，最后通过肉眼观察或使用紫外分光光度计检测反应液，当反应液体系中不存在幽门螺杆菌时，反应液颜色由暗红色变为紫色，当反应液体系中存在幽门螺杆菌时，反应液颜色则为暗红色。5.根据权利要求4所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检出限为25cfu/ml。
技术总结本发明涉及幽门螺杆菌检测技术领域，公开了一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒，所述试剂盒包括幽门螺杆菌特异性核酸适配体和经纳米金颗粒(AuNPs)修饰的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括探针Probe-1
技术研发人员：唐田 周琛 方楚斌 费宇 方蓉 肖丽娜 廖娟 汪川
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/7/5
