本发明属于植物基因工程，涉及芸薹属bnnst2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用，尤其涉及通过针对bnnst2基因内部第199bp处c单碱基有无设计kasp分子标记，以及通过敲除bnnst2基因两种方法来提高油菜角果抗裂性。
背景技术：
1、油菜(brassica napus l.)是一种重要的油料作物，其在世界范围内被广泛种植。油菜角果的易裂性对其机械化收获具有较大的影响，其抗裂角性差导致的减产已成为影响产量的重要因素。由于目前生产上利用的油菜品种在成熟时特别容易裂角，人工收获一般会造成大约10％的产量损失，机械化收割则损失更加严重。如遇到恶劣气候，产量损失可高达50％以上。而且裂角散失的籽粒萌发形成自生苗，不但影响下茬作物的生长，同时也增加了施用除草剂去除再生苗的成本。目前生产上采取提前收获的方法避免裂角造成的产量损失和对下茬作物的不良影响，但该措施会造成油菜籽中叶绿素含量增加，油含量下降及品质降低。因此，提升栽培油菜品种角果裂角抗性是实现机械化生产，稳定收获产量和保证油菜籽品质的一项紧迫任务。
2、油菜的角果开裂由多种因素共同作用，作物的基因型、生长环境和收获方式等多种因素共同决定了油菜的抗裂角性。油菜抗裂角性由少数主效基因和多微效基因共同影响决定，而且存在基因和基因之间的互作。油菜角果开裂的生理基础较为复杂，大致可分三个过程。首先是角果离区的发育和形成。角果离区位于角果边缘与胚座框之间，具有两层结构：即紧邻角果皮边缘的木质化层(由数层木质化细胞构成)和紧邻胚座框的分离层(由数层非木质化细胞构成)，角果开裂发生在分离层。其次，果瓣内皮层b的木质化也会影响角果的开裂。角果成熟后，外果皮及中果皮失水收缩，但内皮层b的木质化细胞仍保持原有形态，为角果开裂储存并提供张力。最后，植物自身水解酶类的分泌，这些水解酶使离区分离层细胞的联系疏松，加上果皮的张力最终导致角果开裂(文雁成等，2009)。这些复杂的生理过程，受外界温度和植物自身激素调节、细胞壁木质化等过程影响，相对应植物内部涉及到复杂的基因调控网络。
3、油菜与模式植物拟南芥同属十字花科，其角果结构与裂角过程十分类似，而拟南芥裂角的分子机制研究较为深入，为油菜的裂角抗性分子研究提供了借鉴和指导。在拟南芥中涉及的调控角果开裂基因众多，主要分为三类：第一类为角果离区发育形成相关的shp1、shp2、ind、alc和nst1基因(liljegren等，2000；liljegren等，2004)，其中ind调控离区木质化层和分离层的形成发育，alc调控离区分离层的形成发育(girin等，2011；ballester和ferrándiz，2017)；ful和rpl基因分别在果瓣和胚座框表达，抑制离区向果瓣和胚座框的入侵(roeder等，2003；kay等，2012)；ap2对shp和ind进行负调控，限制离区向外扩张(ripoll等，2011)；nst1和nst3直接参与内果皮b的木质化(oda和fukuda，2012)。此外，bp、ntt和wox13等都参与拟南芥角果离区的发育形成(ballester和ferrándiz，2017)。第二类是与激素调控相关的基因，ind通过pid、pin3和wag2动态调节离区生长素的含量，以此调控角果开裂(vangelderen等，2016)。ind也能直接作用于赤霉素合成基因ga3ox1，调控离区赤霉素的含量，赤霉素对离区的形成有十分重要的作用(lenser等，2013)。另外，有研究表明细胞分裂素在果瓣边缘的含量非常高，用细胞分裂素处理shp1shp2突变体可以恢复裂角表型(zuniga-mayo等，2016)。第三类是与裂角相关的酶类，adpg1和adpg2是多聚半乳糖醛酸酶，在离区的分离层表达，对分离层细胞的细胞壁结构进行修饰，使细胞间的联系松弛，在角果皮张力的作用下使分离层裂开(ogawa等，2009)；最近研究证明纤维素酶cel6和半纤维素酶man7，通过对细胞壁的修饰来控制拟南芥角果开裂(he等，2018)。借鉴拟南芥的研究成果，等(2006)在芥菜型油菜中过量表达拟南芥ful基因得到了抗裂角性提高的材料。braatz等(2018)通过对bnaind和bnaalc基因进行突变，也部分改良了甘蓝型油菜的抗裂角性(braatz等，2018a；2018b)。li等(2018)证明在拟南芥和十字花科作物中通过温度变化诱导ind的表达可以促进角果开裂。我国学者通过crispr-cas9基因编辑的方法，同时突变油菜中两个bnaind基因获得了抗裂角的油菜资源(zhai等，2019)。因此，拟南芥裂角分子调控的研究结果，为油菜裂角抗性研究提供了丰富的理论指导。
4、传统的育种改良手段受环境影响大，且育种周期较长，油菜角果抗裂角性的鉴定困难，导致油菜抗裂角性的遗传改良较难。传统qtl定位和关联分析已在油菜中识别出多个与抗裂角性相关的位点，但大多属于环境特异的微效位点，难以直接应用于育种。本发明前期利用全基因组关联分析的方法定位到一个油菜基因组上主效应位点，表型贡献率达到32％。但充分挖掘目标位点下功能基因，利用主效抗裂角基因和抗性变异，开发更多提高油菜抗裂角性分子育种的方法，仍十分必要。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供了两种与芸薹属bnnst2基因有关的全新分子育种方法在提高油菜角果抗裂性中的应用：其一，根据bnnst2基因在第199位单碱基c缺失造成移码突变，导致蛋白序列提前终止，开发了一个功能性等位变异kasp标记，其能有效区分抗裂角性差异油菜品系，并加速选育抗裂角油菜品种；其二，本发明还发现bnnst2基因被敲除突变后，仅提高抗裂角性指数，与油菜的产量等农艺性状不存在显著的关联，也可用于选育抗裂角油菜品种。本发明为抗裂角油菜品种的选育提供了更多途经，在降低芸薹属植物落籽获延迟落籽以及保持角果可脱粒性等方面意义重大。
2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、本发明的目的之一是提供了芸薹属bnnst2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用，所述应用通过针对bnnst2基因内部第199bp处c单碱基的有无设计kasp分子标记，或者通过敲除bnnst2基因来进行。
4、本发明的目的之二是提供了一种kasp分子标记，所述kasp分子标记即为所述应用中针对bnnst2基因内部第199bp处c单碱基的有无所设计的kasp分子标记。
5、本发明中的kasp分子标记基于一个新型的功能性等位变异，其位于甘蓝型油菜极显著的抗裂角位点下的功能基因bnnst2内启动子后199bp处，在易裂角的油菜品种(系)中基因型是c，在抗裂角油菜品种(系)中基因型是缺失(-)，二者所对应的基因型分别表述为bnnst2基因型和bnnst2基因型。
6、所述功能性等位变异与抗裂角性相关联，且存在显著相关性。
7、进一步的，所述kasp分子标记的引物序列如seq id no.7～seq id no.9所示。
8、本发明中的kasp分子标记含有3条引物(st2fc，nst2f-和nstr)，由一条靶向第目标片段区间5’端序列的反向引物和两条分别靶向bnnst2和bnnst2目标区间3’端序列组成，可以分别扩增出来fam和hex两个荧光信号，因此可用于检测油菜自然群体和育种过程中的bnnst2/bnnst2基因型。
9、本发明的目的之三是提供了所述kasp分子标记在对不同抗裂角性油菜品系进行基因分型和/或在加速选育抗裂角油菜品种中的应用。
10、本发明的目的之四是提供了一种对不同抗裂角性油菜品系进行基因分型的方法，所述方法包括使用所述kasp分子标记。
11、本发明中对不同抗裂角性油菜品系进行基因分型的方法，包括以下步骤：
12、(1)提取待测油菜样品的基因组dna：利用ctab法提取待测样品叶片中的dna，烘干后加入100μl超纯水溶解；
13、(2)选择变异位点进行引物设计：通过单倍型挖掘到等位基因变异位点，在等位变异位点利用标记引物扩增出差异片段，引物要求能够很好的区分抗裂角性差异的品种(所述引物即序列如seq id no.11～seq id no.13所示的引物st2fc，nst2f-和nstr)。
14、(3)抗裂角性标记的扩增：将两条引物用超纯水稀释到10μm后，按照体积比nst2fc：nst2f-：nstr：超纯水＝6：6：15：23的比例进行混合，形成10μm的primer mix混合引物，并按照反应液体系和程序进行pcr扩增；
15、(4)抗裂角基因型检测方法：采用荧光检测仪收集检测扩增产物发出的荧光信号，用于检测油菜bnnst2基因内部等位变异，查看基因分型结果。
16、本发明的目的之五是提供了一种加速选育抗裂角油菜品种的方法，所述方法包括使用所述kasp分子标记。
17、本发明的目的之六是提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体即为所述应用中敲除bnnst2基因时所构建的重组表达载体。
18、进一步的，所述重组表达载体的构建及检测引物序列如seq id no.10～seq idno.15所示。
19、本发明的目的之七是提供了所述重组表达载体在选育抗裂角油菜品种中的应用。
20、本发明的目的之八是提供了一种选育抗裂角油菜品种的方法，所述方法包括使用所述重组表达载体。
21、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
22、本发明提供了两种与芸薹属bnnst2基因有关的全新分子育种方法在提高油菜角果抗裂性中的应用：其一，根据bnnst2基因在第199位单碱基c缺失造成移码突变，导致蛋白序列提前终止，开发了一个功能性等位变异kasp标记，其能有效区分抗裂角性差异油菜品系，并加速选育抗裂角油菜品种；其二，本发明还发现bnnst2基因被敲除突变后，仅提高抗裂角性指数，与油菜的产量等农艺性状不存在显著的关联，也可用于选育抗裂角油菜品种。本发明为抗裂角油菜品种的选育提供了更多途经，在降低芸薹属植物落籽获延迟落籽以及保持角果可脱粒性等方面意义重大。
1.芸薹属bnnst2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用，其特征在于，所述应用通过针对bnnst2基因内部第199bp处c单碱基的有无设计kasp分子标记，或者通过敲除bnnst2基因来进行。
2.一种kasp分子标记，其特征在于，所述kasp分子标记即为权利要求1所述应用中针对bnnst2基因内部第199bp处c单碱基的有无所设计的kasp分子标记。
3.根据权利要求2所述的kasp分子标记，其特征在于，所述kasp分子标记的引物序列如seq id no.7～seq id no.9所示。
4.权利要求2～3任一所述的kasp分子标记在对不同抗裂角性油菜品系进行基因分型和/或在加速选育抗裂角油菜品种中的应用。
5.一种对不同抗裂角性油菜品系进行基因分型的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2～3任一所述的kasp分子标记。
6.一种加速选育抗裂角油菜品种的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2～3任一所述的kasp分子标记。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1所述应用中敲除bnnst2基因时所构建的重组表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的构建及检测引物序列如seq id no.10～seq id no.15所示。
9.权利要求7～8任一所述的重组表达载体在选育抗裂角油菜品种中的应用。
10.一种选育抗裂角油菜品种的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求7～8任一所述的重组表达载体。
