本发明涉及诊断性生物标志物，尤其涉及用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合及用途、检测方法、试剂盒。
背景技术：
1、罕见病一般指罕见的疾病、稀有的疾病，相对于常见病、多发病而言，是一大类散落在各个疾病系统的不同疾病的总称。目前全球无统一的罕见病定义，世界各国罕见病定义的表述方式通常为发病率或患病率或患病人数。
2、目前对罕见病的诊断通常通过对患者的基因进行检测，准确率高，但基因检测的检测时间长、对技术人员要求和检测成本高。人体血液中的代谢化合物对于指示人体的生理状态具有显著效果。因此，可采用易于检测的血液代谢标志物作为罕见病诊断的标志物，用于指导是否进一步进行基因检测以确诊。
技术实现思路
1、针对以上问题，本发明提供一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合及用途、检测方法、试剂盒，利用血液中与罕见病关联性强的血液代谢物组合判断患有罕见病的倾向的标志物，并且所采用一次定量测定多种血液代谢标志物的含量，可加快检测速度，同时降低检测成本，提升血液标志化合组合的应用效率。
2、第一方面，本发明提供一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合，所述血液代谢标志物组合由3-羟基丙酸、2-甲基枸橼酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱、甘氨酸、甲基丙二酸、苯丙氨酸、酪氨酸化合物中的至少任意两种组成。
3、作为本发明的进一步改进，所述血液代谢标志物组合为3-羟基丙酸、2-甲基枸橼酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱和甘氨酸化合物，所述罕见病为丙酸血症。
4、作为本发明的进一步改进，所述血液代谢标志物组合为甲基丙二酸、乙酰肉碱和丙酰肉碱化合物，所述罕见病为甲基丙二酸血症。
5、作为本发明的进一步改进，所述血液代谢标志物组合为苯丙氨酸和酪氨酸化合物；所述罕见病为高苯丙氨酸血症。
6、第二方面，本发明提供一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合在制备罕见病诊断产品中的用途，所述诊断产品中包括3-羟基丙酸、2-甲基枸橼酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱、甘氨酸、甲基丙二酸、苯丙氨酸、酪氨酸化合物中的至少两种。
7、第三方面，本发明提供一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合的检测方法，所述血液代谢标志物组合的检测采用以下步骤：
8、采集取样对象的末梢血液样本，干燥获得干血斑样本，并对干血斑样本进行前处理，得到含有与待测血液代谢标志物对应的内标工作液的前处理血液样本；
9、所述对干血斑样本进行前处理包括将干血斑样本添加含有不同血液代谢标志物对应同位素内标的内标工作液后先后进行超声和离心处理，得到上清液；所述内标工作液的制备包括制备混内标储备液和内标稀释液，并利用内标稀释液将混内标储备液稀释设定倍数；
10、依次配置液相色谱的流动相和色谱参数以及质谱的离子源参数和mrm参数，制备不同浓度的校准品，并根据配置好的液相色谱的流动相和色谱参数以及质谱的离子源参数和mrm参数对校准品进行测定获得不同血液代谢标志物的浓度标准曲线；
11、基于同位素内标法对前处理后的血液样本上清液采用液相色谱-质谱联用方法进行测定，根据获得的浓度标准曲线得到不同血液代谢标志物的含量检测结果；
12、其中所述流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为乙酸铵氨水水溶液，流动相b为乙酸铵氨水乙腈水溶液，采用流动相a和流动相b对上清液进行洗脱。
13、作为本发明的进一步改进，所述对干血斑样本进行前处理中超声时间不低于20min，离心时间不低于5min。
14、作为本发明的进一步改进，所述内标工作液为含有同位素内标与5mm硫酸锌的甲醇、乙腈、水混合物，甲醇、乙腈、水比例为42.5:42.5:15。
15、作为本发明的进一步改进，使用50％甲醇水溶液稀释待测血液代谢标志物同位素内标母液制备混内标储备液，冷冻保存；制备1:1的甲醇和乙腈，并添加15％的水，制得42.5:42.5:15的甲醇:乙腈:水混合溶液，将所述混合溶液每100ml溶解143.78mg硫酸锌七水合物，得到终浓度为5mm硫酸锌的42.5:42.5:15的甲醇:乙腈:水溶液，完成内标稀释液的制备并冷藏保存。作为本发明的进一步改进，所述流动相a为10mm乙酸铵0.04％氨水(v/v)水溶液，所述流动相b为10mm乙酸铵0.04％氨水(v/v)95％乙腈水溶液，采用梯度洗脱：
16、 时间(min) 流动相a(％) 流动相b(％) 0 10 90 0.5 10 90 6 60 40 7 60 40 7.01 10 90 8.5 10 90
17、。
18、作为本发明的进一步改进，制备浓度为1m乙酸铵水溶液，采用990ml纯化水，分别添加10ml1m乙酸铵水溶液和0.4ml浓氨水，混匀超声得到10mm乙酸铵0.04％氨水(v/v)水溶液的流动相a；制备浓度为1m乙酸铵水溶液，采用40ml纯化水和950ml乙腈，分别添加10ml1m乙酸铵水溶液和添加0.4ml浓氨水，混匀超声得到10mm乙酸铵0.04％氨水(v/v)95％乙腈水溶液的流动相b。
19、作为本发明的进一步改进，所述色谱参数包括进样量和流速，其中，所述进样量为5-10ul，所述流速为0.3-0.4ml/min，所述液相色谱的色谱柱为正向色谱柱；所述离子源参数为：
20、 参数 正离子模式 负离子模式 毛细管电压(kv) 0.5 1 脱溶剂气温度(℃) 400 400 脱溶剂气流量(l/hr) 1100 1100 锥孔气流量(l/hr) 150 150 喷雾气压(bar) 7.0 7.0
21、。
22、作为本发明的进一步改进，所述mrm参数为：
23、
24、
25、作为本发明的进一步改进，所述色谱柱的规格为beh amide，1.7μm，2.1*100mm。
26、第四方面，本发明提供一种包含上述血液代谢标志物组合的试剂盒。
27、本发明通过公开一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合及用途、检测方法、试剂盒，提供了能够指示罕见病的血液代谢标志物组合及其在指示罕见病方面的应用，在使用时，合理配置液相色谱-质谱联用方法所需要的流动相、色谱参数、质谱参数，优化了lc-ms/ms方法，保证了检测结果的稳定性和准确性，使得检测结果更能反映人体的真实生理状态，并且通过优化的lc-ms/ms可利用一个处理的血液样本实现多种化合物的检测，大大提升了检测速度，同时相应降低了检测成本，提升了血液代谢标志物的应用效率。
1.一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合，其特征在于，所述血液代谢标志物组合由3-羟基丙酸、2-甲基枸橼酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱、甘氨酸、甲基丙二酸、苯丙氨酸、酪氨酸化合物中的至少任意两种组成。
2.根据权利要求1所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合，其特征在于，所述血液代谢标志物组合为3-羟基丙酸、2-甲基枸橼酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱和甘氨酸化合物，所述罕见病为丙酸血症。
3.根据权利要求1所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合，其特征在于，所述血液代谢标志物组合为甲基丙二酸、乙酰肉碱和丙酰肉碱化合物，所述罕见病为甲基丙二酸血症。
4.根据权利要求1所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合，其特征在于，所述血液代谢标志物组合为苯丙氨酸和酪氨酸化合物；所述罕见病为高苯丙氨酸血症。
5.一种用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合在制备罕见病诊断产品中的用途，其特征在于，所述诊断产品中包括权利要求1-4任一项所述的血液代谢标志物组合。
6.一种对权利要求1-4任一项所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合的检测方法，其特征在于，所述血液代谢标志物组合的检测采用以下步骤：
7.根据权利要求6所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合的检测方法，其特征在于，所述对干血斑样本进行前处理中超声时间不低于20min，离心时间不低于5min。
8.根据权利要求6所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合的检测方法，其特征在于，所述流动相a为10mm乙酸铵0.04％氨水(v/v)水溶液，所述流动相b为10mm乙酸铵0.04％氨水(v/v)95％乙腈水溶液，采用梯度洗脱：
9.根据权利要求6所述的用于罕见病诊断的血液代谢标志物组合的检测方法，其特征在于，所述色谱参数包括进样量和流速，其中，所述进样量为5-10ul，所述流速为0.3-0.4ml/min，所述液相色谱的色谱柱为正向色谱柱；所述离子源参数为：
10.一种包含权利要求1-9任一项所述的血液代谢标志物组合的试剂盒。
