本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种用于靶向rna编辑的单链反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，aso)、一种编辑rna的方法、组合物及其应用。
背景技术：
1、靶向rna编辑以可逆和可调的方式操作遗传信息，不会对基因组造成永久性的改变，因此它与dna编辑相比更为安全，在治疗应用中具有一定优势。rna编辑主要包含腺苷(a)到肌苷(i)的转化和胞苷(c)到尿苷(u)的转化，分别通过腺苷脱氨酶(adar)和胞苷脱氨酶发生。研究最广泛的rna编辑系统是adar介导的a-to-i的编辑，其中adar成员adar1(异构体p110和p150)和adar2已被设计用于a-to-i rna编辑。adar是一种多结构域蛋白，其通过识别结构域识别特定的dsrna序列和/或构象，并使用催化结构域通过核碱基的脱氨基化将a变为i。在翻译过程中a被读取为鸟苷(g)并与c配对，完成蛋白质序列的重新编码。
2、一些rna编辑工具已经被设计用于靶向a-to-i的转换。通过基因工程的方法将adar蛋白或其催化结构域与噬菌体λn肽、snap标签、ms2或dcas13b蛋白融合(pmid：34569891)，并设计一个向导rna(guide rna，grna)来将adar融合蛋白引导至靶位点，从而获得rna的定向编辑。也有研究显示，过表达adar1或adar2蛋白与含有r/g基序(adar招募区)的grna一起可实现靶向rna编辑。
3、研究人员进一步利用内源adar蛋白进行rna编辑，无需外源蛋白，仅需引入一段grna即可完成内源adar蛋白的招募和对目标rna的编辑，此种编辑方法包括两大类。
4、第一类grna包含一段靶向区和一段招募区，靶向区用于与包括目标腺苷的目标rna区域互补，招募区用于招募天然存在于细胞中的adar蛋白并对靶向区进行rna编辑。wo2016/097212(proqr therapeutics)描述了同时具有靶向区和招募区的寡核苷酸结构，其中招募区为单链分子内的茎环结构，靶向区包含部分化学修饰。wo2017/050306描述了与上述结构类似的rna编辑工具，并在随后的申请cn112752844a中报道了基于上述工具进一步开发的名为“restore”的rna编辑技术。所述restore优化了招募区序列，并在整条grna序列上分布了密集的化学修饰，但是需要在ifn-γ存在的前提下(诱导adar1 p150亚型的表达)才能有较高的编辑效率，而ifn-γ是决定自身免疫发展和严重程度的关键因子，这使之在医学领域的应用大打折扣。wo2022078569a1进一步公开了名为“cluster”的rna编辑方法，所述cluster的grna在restore招募区和靶向区的基础上，增加了3-10个募集序列簇，以提高rna编辑的序列靶向性和灵活性。wo2022026928(adarx pharmaceuticals)也描述了由靶向区和招募区组成的grna，其中招募区由双链rna互补形成的分子间结构，靶向区和招募区包含大量化学修饰，以达到较高编辑效率。wo2022147573a1(mali prashant et al)公开了一种环化的grna策略，通过共价闭环结构保护cadrna不受核酸外切酶的影响，其中所述cadrna通过招募区募集内源adar，从而实现高效且持久的rna编辑。
5、第二类grna是一段仅包含靶向区的单链反义寡核苷酸。wo2017/220751(proqrtherapeutics)公开的单链反义寡核苷酸aon包含18-50个核苷酸，所述aon具有一个或多个复杂修饰的核苷酸，且5’和3’以硫代磷酸酯键连接，但编辑效率不高，申请pct/ep2017/071912(proqr therapeutics)进一步通过特殊化学修饰以提高编辑。wo/2020/074001(博雅辑因)记载了称为“leaper”的rna编辑方法，leaper使用的grna包含60-200个与目标rna互补配对的线性核苷酸drna，所述drna的5’和3’包含甲基化和/或硫代磷酸酯化修饰，针对目标腺苷产生较高效的编辑，但其对于治疗应用通常过长。hk40062258a(博雅辑因)在leaper的基础上，进一步开发了leaper 2.0，该方法将drna环化，保护drna不受核酸外切酶的影响，以实现持久编辑。
6、但是，以上rna编辑系统都具有一定局限性。针对第一类rna编辑系统：首先，外源编辑蛋白和grna的异位表达最理想的体内递送方法是病毒载体，腺相关病毒aav是较为理想的病毒载体，但是其负载量难以同时容纳编辑蛋白和grna；其次，非人类来源蛋白质的异位表达具有引发免疫原性的潜在风险，并且可能被适应性免疫系统损害编辑活性；再次，adar的过表达极易影响其本身的内源基因编辑，造成内稳态的紊乱，具有致病风险。最后，adar的过表达会引起转录组全局的脱靶现象，引发致癌风险。针对第二类rna编辑系统：使用包含一段靶向区和一段招募区的grna或者一段仅包含靶向区的单链反义寡核苷酸虽然可以募集内源adar以避免上述问题，但是仍存在编辑效率低的问题。
7、因此，亟待对募集内源adar的rna编辑系统进行进一步改进，提高单链反义寡核苷酸与目标rna的结合稳定性，从而提高rna编辑系统的编辑效率。
技术实现思路
1、本技术提供了一种用于靶向rna编辑的单链反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，aso)。本技术提供的aso包含靶向区(specificity domain，sd)和辅助结合区(binding helper domain，bhd)，能够与目标rna形成双链复合物。所述aso可以通过细胞中存在的adar酶对靶向rna区域中存在的靶腺苷进行脱氨基化，所述bhd利于aso与目标rna的稳定结合，提高编辑效率。本技术还提供使用所述aso编辑rna的方法，组合物及其应用。
2、一方面，本技术提供了一种用于靶向rna编辑的单链反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，aso)，其中所述aso包含靶向区(specificity domain，sd)和辅助结合区(binding helper domain，bhd)，其中所述sd与靶向rna区域互补配对，所述bhd与非靶向rna区域互补配对，所述aso能够与目标rna形成双链复合物。
3、在某些实施方式中，所述aso中，所述靶向rna区域与非靶向rna区域非连续。
4、在某些实施方式中，所述靶向rna区域和所述非靶向rna区域间隔的长度为4-1000nt。
5、在某些实施方式中，所述靶向rna区域和所述非靶向rna区域间隔的长度为4-200nt。
6、在某些实施方式中，所述靶向rna区域和所述非靶向rna区域间隔的长度为200-500nt。
7、在某些实施方式中，所述靶向rna区域和所述非靶向rna区域间隔的长度为500-1000nt。
8、在某些实施方式中，所述靶向rna区域和所述非靶向rna区域间隔的长度为4nt、8nt、11nt、12nt、24nt、25nt、36nt、237nt、340nt、343nt、494nt、681nt。
9、在某些实施方式中，所述bhd与非靶向rna区域完全互补配对。
10、在某些实施方式中，所述bhd与非靶向rna区域互补配对，存在一个或多个错配、摆动、缺失、和/或凸起。
11、在某些实施方式中，所述bhd具有选自下组中的一种或者多种修饰：硫代磷酸酯化修饰、2’-ome、2’-f、lna、una。
12、在某些实施方式中，所述bhd具有硫代磷酸酯化修饰、2’-ome、lna、2’-moe、肌苷替代修饰。
13、在某些实施方式中，所述bhd的长度为8-40nt。
14、在某些实施方式中，所述bhd的长度为15nt、20nt、25nt。
15、在某些实施方式中，所述aso包含一个或者多个bhd。
16、在某些实施方式中，所述一个或者多个bhd不形成分子内二级结构。
17、在某些实施方式中，所述一个或者多个bhd形成分子内二级结构。
18、在某些实施方式中，所述多个bhd不形成分子间二级结构。
19、在某些实施方式中，所述多个bhd形成分子间二级结构。
20、在某些实施方式中，所述bhd与sd不形成分子间二级结构。
21、在某些实施方式中，所述bhd与sd形成分子间二级结构。
22、在某些实施方式中，所述bhd在所述sd的5’端。
23、在某些实施方式中，所述bhd在所述sd的3’端。
24、在某些实施方式中，所述多个bhd在所述sd的5’端和/或3’端。
25、在某些实施方式中，所述bhd与sd直接连接。
26、在某些实施方式中，所述bhd与sd间接连接。
27、在某些实施方式中，所述bhd与sd通过linker间接连接。
28、在某些实施方式中，所述linker包括常规(磷酸二酯)或修饰(如硫代磷酸)的一个或多个核苷酸、寡肽或任何其他化学连接子。
29、在某些实施方式中，所述linker选自下组中的一种或者多种：aaa、aaac、aacaa、aaaacaaaa、peg2、c6。
30、在某些实施方式中，所述linker为aaa。
31、在某些实施方式中，所述linker为aaac。
32、在某些实施方式中，所述linker为aacaa。
33、在某些实施方式中，所述linker为aaaacaaaa。
34、在某些实施方式中，所述linker为peg2。
35、在某些实施方式中，所述linker为c6。
36、在某些实施方式中，所述bhd增加aso与目标rna形成双链复合物的稳定性。
37、在某些实施方式中，所述sd与靶向rna区域完全互补配对或在一个或多个错配、摆动、缺失、和/或凸起。
38、在某些实施方式中，所述sd具有选自下组修饰的一种或者多种：糖修饰、碱基修饰。
39、在某些实施方式中，所述sd具有选自下组中的一种或者多种修饰：硫代磷酸酯化修饰、2’-ome、2’-f、lna、una。
40、在某些实施方式中，所述sd具有硫代磷酸酯化修饰。
41、在某些实施方式中，所述sd具有选自下组修饰的一种或者多种：2’-ome、2’-f、lna、una、2’-fana、dna碱基替代、肌苷替代修饰。
42、在某些实施方式中，所述sd具有2’-ome修饰。
43、在某些实施方式中，所述sd具有2’-f修饰。
44、在某些实施方式中，所述sd的长度为20-50nt。
45、在某些实施方式中，所述sd的长度为30nt。
46、在某些实施方式中，所述靶向rna区域包含靶腺苷。
47、在某些实施方式中，所述靶向rna区域的长度为15-60nt。
48、在某些实施方式中，所述靶向rna区域的长度为30nt。
49、在某些实施方式中，所述非靶向rna区域不包含靶腺苷。
50、在某些实施方式中，所述非靶向rna区域的长度为5-50nt。
51、在某些实施方式中，所述非靶向rna区域的长度为15nt，20nt，25nt。
52、在某些实施方式中，所述aso通过细胞中存在的adar酶对靶向rna区域中存在的靶腺苷进行脱氨基化。
53、在某些实施方式中，所述目标rna选自下组中的一种或者多种：pre-mrna、mrna、rrna、trna、lnc-rna、snrna、snorna。
54、另一方面，本技术提供了一种编辑rna的方法，其包含使用所述的aso。
55、在某些实施方式中，所述方法包含以下步骤：
56、(1)提供所述的aso；
57、(2)允许细胞摄取所述aso；
58、(3)允许所述aso与目标rna结合；
59、(4)允许细胞内adar酶将靶向rna区域中的靶腺苷脱氨基成为肌苷；
60、(5)鉴定靶向rna区域中肌苷的存在。
61、在某些实施方式中，所述方法能够招募内源脱氨基酶对特定核苷酸位点进行脱氨基反应。
62、另一方面，本技术提供了一种或者多种分离的核酸分子，其编码所述的aso、或aso包含的sd、或aso包含的bhd。
63、另一方面，本技术提供了表达载体，其表达所述的一种或者多种分离的核酸分子。
64、另一方面，本技术提供了递送载体，其递送所述的aso。
65、另一方面，本技术提供了细胞，其包含所述的aso、所述的一种或者多种分离的核酸分子所述的表达载体、和/或所述的递送载体。
66、在某些实施方式中，所述细胞为真核细胞。
67、在某些实施方式中，所述细胞是人类细胞或小鼠细胞。
68、在某些实施方式中，所述细胞是肝细胞。
69、在某些实施方式中，所述细胞是神经细胞。
70、另一方面，本技术提供了药物组合物，其包含所述的aso，所述的一种或者多种分离的核酸分子，所述的表达载体，所述的递送载体，所述的细胞，和/或药学上可接受的载体。
71、另一方面，本技术提供了所述的aso，所述的分离的核酸分子，所述的表达载体，所述的递送载体，所述的细胞，所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
72、另一方面，本技术提供了所述的aso，所述的一种或者多种分离的核酸分子，所述的表达载体，所述的递送载体，所述的细胞，所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
73、另一方面，本技术提供了一种预防和/或治疗疾病和/或病症，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的aso，所述的一种或者多种分离的核酸分子，所述的表达载体，所述的递送载体，所述的细胞，所述的药物组合物。
74、本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
1.一种用于靶向rna编辑的单链反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，aso)，其中所述aso包含靶向区(specificity domain，sd)和辅助结合区(binding helper
2.根据权利要求1所述的aso，其中所述靶向rna区域与非靶向rna区域非连续，所述靶向rna区域和所述非靶向rna区域间隔的长度为4-1000nt。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的aso，其中所述bhd与非靶向rna区域完全互补配对。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的aso，其中所述bhd具有选自下组中的一种或者多种修饰：硫代磷酸酯化修饰、2’-ome、2’-f、lna、una、2’-moe、肌苷替代修饰。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的aso，其中所述一个或者多个bhd之间，或者一个或者多个bhd与sd之间，不形成分子间二级结构和/或分子内二级结构。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的aso，其中所述一个和/或多个bhd在所述sd的5’端和/或3’端。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的aso，其中所述bhd与sd直接连接或者间接连接。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的aso，其中所述sd具有选自下组中的一种或者多种修饰：硫代磷酸酯化修饰、2’-ome、2’-f、lna、una、2’-moe、2’-fana、dna碱基替代修饰，肌苷替代修饰。
9.编辑rna的方法，其包含使用权利要求1-8中任一项所述的aso。
10.药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的aso，和/或药学上可接受的载体。
