本申请涉及神经调节蛋白4的检测，具体涉及nrg4检测引物、crrna、crispr组合物、试剂盒及应用。
背景技术：
1、神经调节蛋白4(neuregulins4，nrg4)属于表皮生长因子样蛋白家族(epidermalgrowthfactor，egf)，主要在神经、肺、肝脏、心脏和脂肪等组织中表达。nrg4与细胞膜表面的特异性酪氨酸激酶受体erbb4结合激活下游信号通路，在表皮细胞增殖、组织发育、神经突触生长分化及脂质代谢等方面发挥着重要作用。作为新发现的脂肪因子，关于nrg4的研究多集中于糖脂代谢紊乱方面，包括肥胖、非酒精性脂肪肝及心血管疾病等。然而，现有技术并未对血液中的nrg4表达量提供检测途径，尤其是针对血液肿瘤患者的检测。
技术实现思路
1、本申请发明人将nrg4(gene id:145957)的外显子(loc124903616)作为靶序列，将其反转录成rna，构建靶向切割该反转录的rna的crrna、cas酶和报告rna，依次构建crispr反应体系，从而实现对其靶向切割。将其切割产物通过报告rna的信号放大，能够与免疫层析试纸结合，实现可视化检测，从而使得对nrg4的检测更加方便和准确，检测手段更加便捷。
2、基于此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
3、第一方面，实施例公开了一种引物对。所述引物对与神经调节蛋白4的的靶序列匹配，靶序列如seq id no.1所示。所述引物对包括如seq id no.2～3所示的dna分子。
4、第二方面，实施例公开了一种如seq id no.5所示的crrna，靶向如seq id no.1所示的靶序列。
5、第三方面，实施例公开了一种crispr组合物。所述crispr组合物包括lwacas13a蛋白和crrna或二者形成的复合体。所述crrna如seq id no.5所示，靶向如seq id no.1所示的靶序列。
6、在第三方的一些实施例中，所述crispr组合物还包括荧光报告rna，5’-fam-uuuuu-biotin-3’。
7、第四方面，实施例公开了一种试剂盒。所述试剂盒包括rpa扩增试剂和crispr检测试剂。所述rpa扩增试剂以50μl计包括75mm tris，50mm醋酸钾，25mm醋酸镁，25mmβ巯基乙醇，3.5％聚乙二醇-2000，2mmatp，200mm dntps，20mm多聚磷酸，50ng/μl多聚磷酸激酶，250nm如seq id no.2上游引物，250nm seq id no.3所示的下游引物，300ng/μl tthreca蛋白，600ng/μltthssb蛋白，0.26u/μl dna聚合酶bst3.0和0.1u/μlm-mlv逆转录酶。所述crispr检测试剂以19μl计包括：2μl、7.9ng/μl lwacas13a、1μl 10ng/μl的如seq id no.5所示的crrna、1.25μl 2μm荧光报告rna、0.5μl 5u/μlt7rna聚合酶、0.4μl 1m hepes缓冲液、0.18μl 1m mgcl2溶液、0.8μlrntp mix(25mmatp、25mm gtp、25mm utp、25mm ctp)、1μlrna酶抑制剂(40u/ml)和11.87μl无酶水。
8、利用特异性rpa引物扩增nrg4片段，即nrg4靶序列，该特异性片段经重组聚合酶等温扩增的dna片段，再经t7进行转录生成大量的反转录rna(靶序列rna)。报告rna(ssrna)的两端分别修饰fam荧光基团和生物素(biotin)基团。结合探针rna于切割同时产生荧光信号，能够有效地实现对nrg4进行高特异性、高灵敏度检测，并且通过与酶联免疫技术的可视化相结合，为疫病检测突破常规实验室检测仪器与环境的束缚奠定了强有力的基础。
9、在第四方面的一些实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括：100mm tris-hcl、50mm nacl、0.1mm edta、0.01％sds、0.04％十二烷基硫酸锂和2％甜菜碱。
10、第五方面，实施例还公开了一种试剂盒。该试剂盒包括免疫层析试纸、rpa扩增试剂和crispr检测试剂。所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有t线和c线的nc膜和吸水滤纸，所述t线由链霉亲和素形成，所述c线由所述胶体金标记抗体的二抗形成。当反应体系中cas13a/crrna复合体识别靶序列rna时，会激活cas13a的附带切割活性，进而切割报告rna，产生荧光信号。37℃反应1h后，将反应液稀释10倍滴入样品孔。若反应体系中存在大量的目标病毒核酸，ssrna的报告基团会被全部切割，即fam会与生物素分离，样品垫里金标fam抗体会与fam结合，随着虹吸作用，流向免疫层析试纸顶部。当经过质控区，质控线上的链霉素会结合体系生物素，进而显色，被剪切下来的fam继续向上进入检测区。检测区包被fam抗体的二抗，结合fam抗体后显色。当反应体系中存在少量的目标病毒核酸，报告基团切割不完全，即仍有部分金标fam抗体/fam/生物素，t线上的二抗会结合这部分fam，进而显色，但颜色较浅，呈弱阳性。当反应体系中不存在目标病毒核酸，ssrna报告基团被胶体金标记，质控线上的链霉素会结合报告基团上的生物素，进而显色，ssrna无法继续流向检测区，截留至质控区，而检查区不显色呈阴性。通过将上述的crispr检测体系与试纸条结合，能够实现对nrg4的可视化检测，检测结果判读更加便捷。
11、在一些实施例中，所述胶体金标记抗体为抗fitc抗体。
12、第五方面，实施例公开了第一方面所述的引物对、第二方面所述的crrna、第三方面所述的crispr组合物或第四方面所述的试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
13、1)检测目标核酸是否为神经调节蛋白4的核酸；
14、2)检测目标核酸是否为神经调节蛋白的外显子(loc124903616)核酸；
15、3)检测体外样本中是否还有如1)～3)任一所述目标核酸，可选地，所述体外样本选自血液样本、个体样本、组织样本、唾液样本、汗液样本、尿液样本、咽拭子样本、乳液样本、精液样本、皮肤擦拭样本、粪便样本、痰液样本中的至少一项。
16、本申请实施例提供的nrg4检测引物、crrna、crispr组合物、试剂盒及应用，能够对nrg4的特异序列进行快速扩增，使得检测特异性强。扩增产物能够被crrna或crispr组合物靶向切割，切割效率高，切割产物能够极大增强检测的特异性和灵敏度。利用报告rna对切割产物进行信号关联和放大，能够实现在免疫层析试纸上的可视化检测，促使检测过程更加便捷，便于推广应用。
1.一种引物对，其与人nrg4基因的靶序列匹配，靶序列如seq id no.1所示，所述引物对包括如seq id no.2～3所示的dna分子。
2.如seq id no.5所示的crrna，靶向如seq id no.1所示的靶序列。
3.一种crispr组合物，包括lwacas13a蛋白和crrna，和/或所述lwacas13a蛋白和所述crrna形成的复合体；所述crrna如seq id no.5所示，靶向如seq id no.1所示的靶序列。
4.根据权利要求4所述的crispr组合物，还包括荧光报告rna，5’-fam-uuuuu-biotin-3’。
5.一种试剂盒，包括：
6.根据权利要求5所述的试剂盒，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括：100mmtris-hcl、50mmnacl、0.1mm edta、0.01％sds、0.04％十二烷基硫酸锂和2％甜菜碱。
7.一种试剂盒，其包括：
8.根据权利要求7所述的试剂盒，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括：100mmtris-hcl、50mmnacl、0.1mm edta、0.01％sds、0.04％十二烷基硫酸锂和2％甜菜碱。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，所述胶体金标记抗体为抗fitc抗体。
10.如权利要求1所述的引物对、如权利要求2所述的crrna、如权利要求3或4所述的crispr组合物、或如权利要求5～9任一所述的试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：
