【】本发明涉及新型治疗性细胞因子及其在治疗中的应用方法。尤其是，本发明涉及新型二聚体细胞因子，更具体地涉及强制构象/结构受限的二聚体细胞因子及其在治疗中的应用。
背景技术
0、
背景技术：
1、细胞因子是对人类治疗具有巨大潜在价值的生物分子。细胞因子可以调节免疫系统，并且在癌症、炎症、免疫反应、组织再生等方面发挥了重要作用。尽管细胞因子具有巨大的潜力，但是只有少数细胞因子被批准用于治疗目的。原因在于，除了低血清半衰期、较高生产成本、多效性、高毒性等之外，其中许多细胞因子可能具有不良的副作用，因为这些细胞因子通常靶向不同的细胞类型(参见图2)。
2、已经提出了不同的方法来改善所选细胞因子的药效性和药代动力性(例如，将igg-fc区域融合到il-72或者或针对其中许多细胞因子3采用聚乙二醇佐剂)。需要改进的其他特性包括这些细胞因子的亲和力和抗蛋白水解性和/或这些细胞因子的毒性，这可以通过以下方式来部分解决：设计靶向与一种或多种受体的相互作用的表面突变，以在最大程度提高疗效4的前提下施用较低的剂量。
3、一种可能会降低细胞因子毒性的方式是，通过利用治疗性细菌来局部递送这些细胞因子。被广泛描述的是，采用原位产生和递送感兴趣的治疗分子的重组细菌5。许多类似的努力同样在动物模型中表现出了较高的功效，但是尚未取得临床成功，部分原因是在疾病部位难以达到和维持足够有效的治疗分子浓度。尽管如此，生产成本较低、可以口服或局部给药且全身副作用最小的有效疗法(例如，引起痤疮的痤疮丙酸杆菌；https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31981578/)的前景持续激发着对利用微生物作为治疗剂的兴趣。一些公司正在开发用于人类治疗的细菌(例如，pulmobiotics、eligo bioscience、synlogic、azitra、intrexon、rebiotix)或者利用含有将在目标细菌中表达的感兴趣基因的噬菌体(例如，armata pharmaceuticals、eligo bioscience)。
4、另一种降低毒性和提高功效的方式可以是，将细胞因子融合到将其靶向所需作用部位的分子(例如，抗体)，并引入突变，这些突变将会相对改变对受体组件的不同组分之一的亲和力，最终涉及到受体组分在不同细胞中的不同表达水平(例如，il2及其受体α(il-2ra))；或者将其融合到防止受体识别并在正确位置从细胞因子释放的其他蛋白质结构域。
5、在上述背景下，当通过常规方法或者利用生物递送载体给药时，需要新的和/或改进的治疗性细胞因子、疗法和/或方法来提高细胞因子的半衰期、安全性、功效、特异性和/或局部靶向性。
6、本发明旨在克服或至少减轻现有技术中的一个或多个缺陷。
技术实现思路
0、
技术实现要素：
1、本发明涉及一种单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中这些细胞因子单体结构域之一或其功能部分的序列是不连续的，并且被另一个细胞因子单体结构域或其功能部分的序列中断。
2、在一个实施方式中，第一细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是不连续的，并且被第二细胞因子单体结构域或其功能部分的序列中断。
3、在该实施方式的一些方面，第一细胞因子单体结构域的第一序列部分对应于天然细胞因子单体结构域的n-端部分，并且第一细胞因子单体结构域的第二序列部分对应于天然细胞因子单体结构域的c-端部分。
4、在该实施方式的其他方面，第一细胞因子单体结构域的第一序列部分对应于天然细胞因子单体结构域的c-端部分，并且第一细胞因子单体结构域的第二序列部分对应于天然细胞因子单体结构域的n-端部分。
5、在另一个实施方式中，第二细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是不连续的，并且被第一细胞因子单体结构域或其功能部分的序列中断。
6、在该实施方式的一些方面，第一i类细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是序列连续的，而第二细胞因子单体结构域的序列是这样的：第二i类细胞因子单体中设置在第一i类细胞因子单体或其功能部分的n-端的第一序列部分对应于天然i类细胞因子单体的n-端部分，并且第二i类细胞因子单体中设置在第二i类细胞因子单体或其功能部分的c-端的第二序列部分对应于天然i类细胞因子单体的c-端部分。
7、在该实施方式的其他方面，第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是连续的且与其天然序列顺序相反，而第一ii类细胞因子单体结构域的序列是这样的：第一ii类细胞因子单体结构域中设置在第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分的n-端的第一序列部分对应于天然ii类细胞因子单体结构域的n-端部分，并且第一ii类细胞因子单体结构域中设置在第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分的c-端的第二序列部分对应于天然ii类细胞因子单体结构域的c-端部分。
8、在另一个实施方式中，本发明涉及一种单链二聚体细胞因子多肽，其包括第一细胞因子单体和第二细胞因子单体，该第一细胞因子单体和该第二细胞因子单体形成结构域交换二聚体，其中连接肽将第一细胞因子单体的n-端与第二细胞因子单体的c-端桥接起来。
9、本发明进一步涉及一种含有本发明的单链二聚体多肽的多肽。
10、本发明进一步涉及一种编码本发明的单链二聚体多肽或含有该单链二聚体多肽的多肽的核酸。
11、本发明还涉及一种含有本发明的核酸的表达载体。
12、还提供了一种宿主细胞，其包括本发明的核酸或表达载体。
13、本发明还涉及一种包括本发明的单链二聚体多肽或含有该单链二聚体多肽的多肽的药物组合物。
14、还提供了一种治疗疾病的方法，其包括：向有需求的受治疗者(可选地，将从炎症反应或细胞增殖速率的减少或增加中受益的受治疗者)施用本发明的单链二聚体多肽或含有该单链二聚体多肽的多肽。
15、本发明进一步涉及一种用于治疗疾病(可选地，将从炎症反应或细胞增殖速率的减少或增加中受益的疾病)的本发明的单链二聚体多肽或含有该单链二聚体多肽的多肽。
16、本发明进一步涉及一种用于制备治疗疾病(可选地，将从炎症反应或细胞增殖速率的减少或增加中受益的疾病)的药物的本发明的单链二聚体多肽或含有该单链二聚体多肽的多肽。
17、广义而言，本公开涉及可以提供有益疗效的新细胞因子多肽变体的结构设计。这些治疗性多肽可以通过技术人员可用的任何方法(例如，口服、喷雾、注射或利用如病毒、噬菌体和/或细菌之类的生物载体)递送给目标受治疗者。
18、本公开的新细胞因子多肽变体包括多对细胞因子单体序列，这些细胞因子单体序列共价连接而形成单链多肽。细胞因子单体序列可以衍生自相同或不同的野生型细胞因子蛋白质序列。有益的是，本公开的单链多肽折叠形成包括两个结构域(例如，左侧3d结构域和右侧3d结构域)的三级结构，其中每个3d结构域可以具有该3d结构域所基于/衍生的天然细胞因子单体的功能和/或活性；或者可以具有不同的功能或活性。
19、根据一个方面，公开了一种单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中第一细胞因子单体结构域或其功能部分通过肽连接子与第二细胞因子单体结构域或其功能部分融合，其中该肽连接子序列包括5个或更少(优选为3个或更少)的相邻gly和/或ser残基。适宜的是，改造肽连接子的序列包含约3个至约20个氨基酸。在实施方式中，改造肽连接子具有约3个至约16个氨基酸、约3个至约12个氨基酸、约3个至约8个氨基酸、约4个至约8个氨基酸或者约4个至约6个氨基酸。
20、根据第二个方面，公开了一种单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中第二细胞因子单体结构域或其功能部分的序列插入第一细胞因子单体结构域的序列中，使得第一细胞因子单体的第一序列部分设置在第二细胞因子单体或其功能部分的n-端，并且第一细胞因子单体的第二序列部分设置在第二细胞因子单体或其功能部分的c-端。有益的是，该单链二聚体细胞因子多肽具有三级结构，该三级结构包括左侧3d细胞因子结构域和右侧3d细胞因子结构域，并且其中左侧3d细胞因子结构域通过两个桥接连接肽与右侧3d细胞因子结构域连接。在实施方式中，左侧3d细胞因子结构域适宜为由第一细胞因子单体结构域或其功能部分的第一序列部分和第二序列部分形成的分裂结构域细胞因子，而右侧3d细胞因子结构域适宜为由第二细胞因子单体结构域或其功能部分形成的连续结构域细胞因子。
21、根据第三个方面，公开了一种单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中第二细胞因子单体结构域或其功能部分的序列插入第一细胞因子单体结构域的序列中，使得第一细胞因子单体的第一序列部分设置在第二细胞因子单体或其功能部分的n-端，并且第一细胞因子单体的第二序列部分设置在第二细胞因子单体或其功能部分的c-端。在各种实施方式中，第一细胞因子单体结构域的第一序列部分对应于天然细胞因子单体的c-端部分，并且第一细胞因子单体结构域的第二序列部分对应于天然细胞因子单体的n-端部分。
22、根据第四个方面，公开了一种单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中第一细胞因子单体结构域序列衍生自与第二细胞因子单体结构域序列不同类型的细胞因子；并且其中左侧细胞因子结构域是由第一细胞因子单体结构域或其功能部分的第一序列部分和第二序列部分形成的分裂结构域细胞因子，而右侧3d细胞因子结构域是由第二细胞因子单体结构域或其功能部分形成的连续结构域细胞因子。适宜的是，该单链二聚体细胞因子多肽具有三级结构，该三级结构包括由第一细胞因子单体结构域或其功能部分形成的左侧3d细胞因子结构域和由第二细胞因子单体结构域或其功能部分形成的右侧3d细胞因子结构域。有益的是，第一细胞因子单体结构域通过两个桥接连接肽与第二细胞因子单体结构域连接。在实施方式中，第一细胞因子单体结构域衍生自ii类细胞因子，而第二细胞因子单体衍生自i类细胞因子；或者第一细胞因子单体结构域衍生自i类细胞因子，而第二细胞因子单体衍生自ii类细胞因子。
23、根据第五个方面，公开了一种单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中第一细胞因子单体结构域序列衍生自与第二细胞因子单体结构域序列不同类型的细胞因子；并且其中该单链二聚体细胞因子多肽具有三级结构，该三级结构包括由第一细胞因子单体结构域或其功能部分形成的左侧3d细胞因子结构域和由第二细胞因子单体结构域或其功能部分形成的右侧3d细胞因子结构域。在各种实施方式中：(i)第一细胞因子单体结构域序列衍生自il-10或ifnγ细胞因子序列，而第二细胞因子单体结构域序列衍生自i类或ii类细胞因子序列；或者(ii)第一细胞因子单体结构域序列衍生自i类或ii类细胞因子序列，而第二细胞因子单体结构域序列衍生自il-10或ifnγ细胞因子序列。
24、本公开还包括分离多核苷酸，这些分离多核苷酸包括本公开的任一多肽。还包括含有这些多核苷酸的载体，比如噬菌体或病毒载体。
25、此外，本公开包括含有本发明的多核苷酸的细胞和/或表达本公开的多肽的细胞。
26、本公开还涉及包括本公开的多肽、多核苷酸、载体和/或细胞的药物组合物。
27、此外，本公开还涉及包含本公开的多肽、多核苷酸、载体、细胞和/或(药物/治疗)组合物的医学治疗的治疗应用和方法。
28、在条款和/或所附权利要求书中定义了本公开的各个方面和实施方式。在本文的其他地方描述了本发明概念的其他方面和实施方式。
29、应当认识到的是，除非另有说明，否则本发明的一个方面或实施方式的任何特征可以与本发明的任何其他方面或实施方式中的特征的任何组合相结合，并且这种结合都在所要求保护的发明的范围内。因此，本发明以任何和所有的组合包含了本公开的所有条款和权利要求，除非这种组合是不相容的。
1.一种单链二聚体细胞因子多肽包括：(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中所述细胞因子单体结构域之一或其功能部分的序列是不连续的，并且被另一个细胞因子单体结构域或其功能部分的序列中断。
2.根据权利要求1所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括(a)第一细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二细胞因子单体结构域或其功能部分，其中所述第二细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是序列连续的，而所述第一细胞因子单体结构域的序列是这样的：所述第一细胞因子单体结构域的第一序列部分设置在所述第二细胞因子单体结构域或其功能部分的n-端，并且所述第一细胞因子单体结构域的第二序列部分设置在所述第二细胞因子单体或其功能部分的c-端。
3.根据权利要求2所述的单链二聚体细胞因子多肽，其中所述第一细胞因子单体结构域的第一序列部分对应于天然细胞因子单体结构域的n-端部分，并且所述第一细胞因子单体结构域的第二序列部分对应于所述天然细胞因子单体结构域的c-端部分。
4.根据权利要求2或3所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括：
5.根据权利要求3或4所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体i类多肽，包括：(i)第一i类细胞因子单体的n-端部分，包括所述第一i类细胞因子单体的α-螺旋a、b；(ii)将所述第一i类细胞因子单体的α-螺旋b与第二i类细胞因子单体的α-螺旋c桥接起来的连接肽；(iii)所述第二i类细胞因子单体的c-端部分，包括所述第二i类细胞因子单体的α-螺旋c、d；(iv)将所述第二i类细胞因子单体的α-螺旋d与所述第二i类细胞因子单体的α-螺旋a桥接起来的连接肽；(v)所述第二i类细胞因子单体的n-端部分，包括所述第二i类细胞因子单体的α-螺旋a、b；(vi)将所述第二i类细胞因子单体的α-螺旋b与所述第一i类细胞因子单体的α-螺旋c桥接起来的连接肽；以及(vii)所述第一i类细胞因子单体的c-端部分，包括所述第一i类细胞因子单体的α-螺旋c、d。
6.根据权利要求3或4所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链
7.根据权利要求3、4和6中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是：
8.根据权利要求3、4、6和7中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体il-22多肽，包括序列seq id no:65,seq id no:66,seq id no:282、seq id no:283、seqid no:284、seq id no:285、seq id no:286、seq id no:287或seq id no:288或者与其具有至少80％同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与il-22受体1和/或il-22受体2相互作用水平的序列。
9.根据权利要求3、4和6中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体il-10-il-22多肽，包括序列seq id no:76或者与其具有至少80％同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与il-10受体和il-22受体相互作用水平的序列或者由其组成。
10.根据权利要求2所述的单链二聚体细胞因子多肽，其中所述第一细胞因子单体结构域的第一序列部分对应于天然细胞因子单体结构域的c-端部分，并且所述第一细胞因子单体结构域的第二序列部分对应于所述天然细胞因子单体结构域的n-端部分。
11.根据权利要求2或10所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括：
12.根据权利要求10或11所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体i类多肽，其中：
13.根据权利要求10至12中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其基于短链i类细胞因子，并且是：
14.根据权利要求10至12中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其基于长链i类细胞因子，并且是：
15.根据权利要求10至13中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是二聚体il-2，并且包括seq id no:89-(xn1)-seq id no:90-(xn2)-seq id no:91，其中所述肽连接子xn1、xn2是相同的，并且包括seq id no:270、seq id no:271、seq id no:272、seq id no:273、seq id no:274或seq id no:275或者由其组成。
16.根据权利要求10或11所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体ii类多肽，其中：
17.根据权利要求1所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括(a)第一i类细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二i类细胞因子单体结构域或其功能部分，其中所述第一i类细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是序列连续的，而所述第二细胞因子单体结构域的序列是这样的：所述第二i类细胞因子单体中设置在所述第一i类细胞因子单体或其功能部分的n-端的第一序列部分对应于天然i类细胞因子单体的n-端部分，并且所述第二i类细胞因子单体中设置在所述第二i类细胞因子单体或其功能部分的c-端的第二序列部分对应于所述天然i类细胞因子单体的c-端部分。
18.根据权利要求1或17所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括：
19.根据权利要求17或18所述的单链二聚体细胞因子多肽，其中：
20.根据权利要求17至19中任一项所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体il-2多肽，并且包括序列seq id no:296或者与其具有至少80％同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与il-2受体相互作用水平的序列或者由其组成。
21.根据权利要求1所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括：(a)第一i类细胞因子单体结构域或其功能部分；以及(b)第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分，其中所述第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分的序列是序列连续的且与其天然序列顺序相反，而所述第一ii类细胞因子单体结构域的序列是这样的：所述第一ii类细胞因子单体结构域中设置在所述第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分的n-端的第一序列部分对应于天然ii类细胞因子单体结构域的n-端部分，并且所述第一ii类细胞因子单体结构域中设置在所述第二ii类细胞因子单体结构域或其功能部分的c-端的第二序列部分对应于所述天然ii类细胞因子单体结构域的c-端部分。
22.根据权利要求2或21所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体ii类细胞因子多肽，包括：
23.根据权利要求5至7、12至16和19所述的单链二聚体细胞因子多肽，其中所述桥接连接肽的序列包含约3个至约20个氨基酸、约3个至约16个氨基酸、约4个至约12个氨基酸、约4个至约8个氨基酸、约3个至约8个氨基酸或者约3个至约6个氨基酸；并且其中所述连接肽序列包括5个或更少(适宜地3个或更少)的相邻gly和/或ser残基；可选地，其中所述连接肽是结构化连接子。
24.根据权利要求1所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括第一细胞因子单体结构域和第二细胞因子单体结构域，所述第一细胞因子单体结构域和所述第二细胞因子单体结构域形成交换结构域二聚体，所述交换结构域二聚体是i类细胞因子，并且所述单链二聚体细胞因子多肽从n-端到c-端包括第一细胞因子单体结构域和第二细胞因子单体结构域，所述第一细胞因子单体结构域包括所述第二细胞因子单体的螺旋a至螺旋c和所述第一细胞因子单体的螺旋d，所述第二细胞因子单体结构域包括所述第二细胞因子单体的螺旋d和所述第一细胞因子单体的螺旋a至螺旋c，其中连接肽将所述第二细胞因子单体的螺旋d与所述第一细胞因子单体的螺旋a桥接起来。
25.根据权利要求24所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是二聚体il-5多肽，包括序列seq id no:101-(ntct)-seq id no:102(其中(ntct)是肽连接子)或者与其具有至少80％同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与il-5受体相互作用水平的序列。
26.根据权利要求1所述的单链二聚体细胞因子多肽，包括第一细胞因子单体和第二细胞因子单体，所述第一细胞因子单体和所述第二细胞因子单体形成交换结构域二聚体且是ii类细胞因子，并且所述单链二聚体细胞因子多肽从n-端到c-端包括第一细胞因子单体结构域和第二细胞因子单体结构域，所述第一细胞因子单体结构域包括所述第二细胞因子单体的螺旋a至螺旋c和所述第一细胞因子单体的螺旋d至螺旋f，所述第二细胞因子单体结构域包括所述第二细胞因子单体的螺旋d至螺旋f和所述第一细胞因子单体的螺旋a至螺旋c，其中连接肽将所述第二细胞因子单体的螺旋f与所述第一细胞因子单体的螺旋a桥接起来。
27.根据权利要求26所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体il-10，并且包括序列seq id no:11-(ntct)-seq id no:12(其中(ntct)是肽连接子)或者与其具有至少80％序列同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与il-10受体相互作用水平的序列。
28.根据权利要求27所述的单链二聚体il-10多肽，包括seq id no:9或seq id no:10或者与其具有至少80％同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与il-10受体相互作用水平的序列。
29.根据权利要求26所述的单链二聚体细胞因子多肽，其是单链二聚体ifnγ，并且包括序列seq id no:14-(ntct)-seq id no:15(其中(ntct)是肽连接子)或者与其具有至少80％序列同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与ifnγ受体相互作用水平的序列。
30.根据权利要求29所述的单链二聚体多肽，包括seq id no:18或者与其具有至少80％序列同一性且保持至少相同的稳定性和/或至少相同的与ifnγ受体相互作用水平的序列。
31.一种多肽，包括根据权利要求1至30中任一项所述的单链二聚体多肽。
32.一种核酸，编码包括权利要求1至31中任一项所述的多肽。
33.一种表达载体，包括根据权利要求32所述的核酸。
34.一种宿主细胞，包括根据权利要求32所述的核酸或根据权利要求33所述的表达载体。
35.一种药物组合物，包括根据权利要求1至31中任一项所述的多肽。
36.一种治疗疾病的方法，包括：向有需求的受治疗者(可选地，将从炎症反应或细胞增殖速率的减少或增加中受益的受治疗者)施用根据权利要求1至31中任一项所述的多肽。
37.根据权利要求1至31中任一项所述的多肽，用于治疗疾病(可选地，将从炎症反应或细胞增殖速率的减少或增加中受益的疾病)。
38.根据权利要求1至31中任一项所述的多肽，用于制备治疗疾病(可选地，将从炎症反应或细胞增殖速率的减少或增加中受益的疾病)的药物。
