本技术涉及生物工程，具体涉及一种基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统及其应用。
背景技术：
1、在下一代工业微生物技术中，利用生物工程改造重组微生物(包括例如重组盐单胞菌等极端微生物)是提高发酵效率、降低发酵成本的基本方法之一。工程发酵中，工程菌的早期开发一般选用诱导型启动子以便确定目标基因的表达强度，然后以相同表达强度的组成型启动子替代诱导型启动子得到在吨级的发酵罐中生产的工程菌。然而，这种组成型启动子从菌株开始生长就使目的基因表达，由此对生产菌造成了很大的负担，尤其这些基因表达的蛋白，容易形成细胞毒性，对于还没形成群体优势的生产菌，不仅影响产品产量，而且造成菌株前期生长缓慢，甚至不生长。
2、相关技术中，在极端微生物例如嗜盐单胞菌halomonas bluephagenesis td1.0中公开了响应于异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)的t7-like启动子，是目前该菌株中应用最广且效果最佳的诱导系统，但该系统依赖于价格高昂的iptg，由此使得生产成本大幅增加，目前仅局限在实验室研发阶段使用，而难以推广到工厂生产阶段。
3、由此，亟待开发一种与iptg诱导响应效果相当的、对所施加的诱导剂高度耐受的且成本效益高的外源基因表达调控系统和方法。
技术实现思路
1、本技术至少从以下方面解决了相关技术的问题之一。
2、为此，本技术的实施例提供了一种基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统，所述盐单胞菌(halomonas sp.)天然性具有乳糖利用缺陷，其特征在于，所述系统包含乳糖调控系统，所述乳糖调控系统包含：乳糖代谢蛋白编码基因，所述乳糖代谢蛋白选自以下中的一个或多个：β-半乳糖苷酶(lacz)和/或β-半乳糖苷透性酶(lacy)；所述乳糖调控系统还包含乳糖操纵序列(laco)；和阻遏蛋白(laci)编码基因，所述乳糖代谢蛋白通过转运和异构化乳糖，达到调控阻遏蛋白的效果，影响所述阻遏蛋白和乳糖操纵序列的结合与分离，从而调控所述外源基因的表达。
3、在一些实施例中，所述乳糖代谢蛋白还包括β-半乳糖苷乙酰基转移酶(laca)。
4、在一些实施例中，所述乳糖调控系统还包含：一个或多个第一启动子，所述第一启动子基于所述乳糖操纵序列调控所述乳糖代谢蛋白的表达，可选地，所述乳糖操纵序列包含于所述第一启动子中，可选地，所述乳糖操纵序列独立于所述第一启动子存在，可选地，所述第一启动子选自plac、pporin、pporin68、pporin203、pporin278、pporin70、pporin58、pporin141、pporin221、pporin185、ptac、ptrc、pmmp1或与其具有至少80％同一性的序列，优选为plac或pporin68，其中所述plac、pporin、pporin68、pporin203、pporin278、pporin70、pporin58、pporin141、pporin221、pporin185、ptac、ptrc、pmmp1的序列分别如seq id no：1、seq id no：3、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、seq id no：21、seq id no：22、seq id no：16所示。
5、在一些实施例中，所述乳糖调控系统还包含：第二启动子，所述第二启动子调控所述阻遏蛋白的表达，以调节所述第一启动子对所述乳糖代谢蛋白表达的调控，可选地，所述第二启动子选自placi、pporin、pporin68、pporin203、pporin278、pporin70、pporin58、pporin141、pporin221、pporin185、pmmp1或与其具有至少80％同一性的序列，优选为placi或pporin70，其中所述placi的序列如seq id no：23所示。
6、在一些实施例中，所述乳糖调控系统还包含：第三启动子，所述第三启动子基于所述乳糖操纵序列调控所述外源基因的表达，可选地，所述第三启动子为t7启动子或pmmp1启动子，其中所述pmmp1启动子的序列如seq id no：16所示，可选地，所述乳糖调控系统还包含核糖体结合位点，所述核糖体结合位点的序列可选地如seq id no：15所示。
7、在一些实施例中，所述乳糖操纵序列如序列seq id no：19所示、所述β-半乳糖苷酶的序列如seq id no：11所示、所述β-半乳糖苷透性酶的序列如seq id no：12所示、所述β-半乳糖苷乙酰基转移酶的序列如seq id no：13所示。
8、在一些实施例中，所述盐单胞菌为嗜盐属bluephagenesis种(halomonasbluephagenesis)单胞菌，优选地，所述嗜盐属bluephagenesis种单胞菌选自以下中的一种或多种：halomonas bluephagenesis td01和halomonas bluephagenesis td1.0。
9、在一些实施例中，基于所述乳糖调控系统包含多个所述第一启动子，所述多个第一启动子分别各自调控所述乳糖代谢蛋白中的一个或多个的表达，可选地，所述多个第一启动子的至少部分间具有不同序列，由此具有不同的表达调控强度，可选地，所述系统包含一个、两个、三个或四个以上的所述第一启动子。
10、在一些实施例中，所述系统还包括增强子和/或沉默子，以调节所述乳糖代谢蛋白编码基因、所述阻遏蛋白编码基因和/或外源基因的表达；可选地，所述乳糖代谢蛋白编码基因、所述阻遏蛋白编码基因和/或外源基因各自为单拷贝或多拷贝。
11、在一些实施例中，所述第一启动子、第二启动子和/或第三启动子是组成型启动子或诱导型启动子、优选为组成型启动子。
12、本技术的实施例还提供了一种表达载体，其包含如上述实施例中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统。
13、本技术的实施例还提供了一种工程化改造的盐单胞菌，包含如上述实施例中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统或如上述实施例中任一项所述的表达载体，可选地，所述盐单胞菌为嗜盐属bluephagenesis种(halomonasbluephagenesis)单胞菌，优选地，所述嗜盐属bluephagenesis种单胞菌选自以下中的一种或多：halomonas bluephagenesis td01和halomonas bluephagenesis td1.0，可选地，所述工程化改造的盐单胞菌选自以下中的一种或多种：h.bluephagenesis tdzh13、tdzh14、tdzh15、tdzh244、tdzh274、tdzh275、tdzh276、tdzh333、tdzh334和tdzh335。
14、本技术的实施例还提供了一种基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的方法，所述盐单胞菌天然性具有乳糖利用缺陷，所述方法包括：将如上述实施例中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统引入所述盐单胞菌；和施加乳糖，以诱导所述盐单胞菌表达所述外源基因，可选地，所述乳糖的施加浓度为0-25mm、优选为10-5-102mm。
15、本技术的实施例还提供了根据上述实施例中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统、如上述实施例中任一项所述的表达载体或如上述实施例中任一项所述的盐单胞菌在生物产品制备中的应用。
16、在一些实施例中，所述生物产品为包括：蛋白类、核酸类、酸类、醇类、酯类产品和/或其它有机或无机化合物，可选地，所述蛋白类产品包括：氨基酸、酶或其衍生物，可选为赖氨酸、精氨酸、肌醇、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶，可选地，所述核酸类产品包括：核苷酸、多核苷酸，包括dna和rna或其衍生物，可选为dna或rna分子探针、引物、测序接头、标签序列或crispri/crispra中使用的sgrna，可选地，所述酸类产品包括：3-羟基丙酸、5-氨基乙酰丙酸，可选地，所述醇类产品包括：肌醇、1,3-丙二醇，可选地，所述酯类产品包括：pha，可选地，所述其它有机或无机化合物包括：1,5-戊二胺、乙偶姻、番茄红素，其中所述pha可选地选自以下中的一种或多种：3-羟基丁酸(3hb)均聚物phb，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸(4hb)二元共聚物p(3hb-co-4hb)，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸(3hv)三元共聚物phbv4hb，3-羟基丁酸(3hb)和3-羟基己酸二元共聚物phbhhx，3-羟基丙酸(3hp)的均聚物或共聚物，其中所述3-羟基丙酸的均聚物为p3hp，所述3-羟基丙酸的共聚物为p(3hb-co-3hp)或phbhp。
17、本技术的实施例实现了如下有益效果：
18、本技术提出了一种基于乳糖调控系统的在盐单胞菌中调控外源基因表达的系统和方法，通过将该系统引入具有天然性乳糖利用缺陷(即天然状态下无法利用乳糖)的盐单胞菌，能够使其产生与iptg响应相当甚至优于iptg响应的诱导效果，并且相较于iptg响应调控系统，微生物表现出对诱导剂乳糖更高的耐受性，对微生物的生存和生长影响较小。本技术提出的调控系统生物友好、性价比高，能够降低发酵中的生产成本、提高生产效益，对大规模生物合成和生物制造具有重要意义。
1.一种基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统，所述盐单胞菌(halomonassp.)天然性具有乳糖利用缺陷，其特征在于，所述系统包含乳糖调控系统，所述乳糖调控系统包含：
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述乳糖代谢蛋白还包括β-半乳糖苷乙酰基转移酶(laca)。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述乳糖调控系统还包含：
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述乳糖调控系统还包含：
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述乳糖调控系统还包含：
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述乳糖操纵序列如序列seq id no：19所示、所述β-半乳糖苷酶的序列如seq id no：11所示、所述β-半乳糖苷透性酶的序列如seqid no：12所示、所述β-半乳糖苷乙酰基转移酶的序列如seq id no：13所示。
7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述盐单胞菌为嗜盐属bluephagenesis种(halomonas bluephagenesis)单胞菌，
8.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，基于所述乳糖调控系统包含多个所述第一启动子，所述多个第一启动子分别各自调控所述乳糖代谢蛋白中的一个或多个的表达，
9.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统还包括增强子和/或沉默子，以调节所述乳糖代谢蛋白编码基因、所述阻遏蛋白编码基因和/或外源基因的表达；
10.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一启动子、第二启动子和/或第三启动子是组成型启动子或诱导型启动子、优选为组成型启动子。
11.一种表达载体，包含如权利要求1至10中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统。
12.一种工程化改造的盐单胞菌，包含如权利要求1至9中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统或如权利要求10所述的表达载体，
13.一种基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的方法，所述盐单胞菌天然性具有乳糖利用缺陷，其特征在于，所述方法包括：
14.根据权利要求1至9中任一项所述的基于乳糖调控盐单胞菌中外源基因表达的系统、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求13所述的盐单胞菌在生物产品制备中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述生物产品为包括：蛋白类、核酸类、酸类、醇类、酯类产品和/或其它有机或无机化合物，
