本发明涉及一种抑制血管生成素样蛋白4(angptl4)基因表达的sirna、其缀合物、药物组合物以及其在预防和/或治疗血脂异常相关疾病中的用途。
背景技术：
1、血管生成素样蛋白4(angiopoetin-like 4，angptl4)是血管生成素样蛋白家族成员中的一员，属于一种分泌型蛋白，主要在脂肪和肝脏组织中表达，再分泌到血液中。其包含406个氨基酸序列，主要包含氨基端卷曲结构(n-terminal coiled-coil domain)和羧基端纤维蛋白原结构(c-terminal fibrinogen-like domain)两大功能性结构域，常以寡聚体、糖基化及各种亚型的形式存在；且两个结构域都是血管生成素家族成员的保守结构域。此外，angptl4还含有一个天门冬酰胺糖基化位点、一个camp、cgmp依赖的蛋白激酶磷酸化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点、4个肉豆蔻酰基化位点、4个酪蛋白激酶ii磷酸化位点。其表达受转化生长因子-β(transforming growth factor-β，tgf-β)、过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator-activated receptorδ,pparδ)、低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1alpha,hif1α)等因素的调控。
2、目前越来越多的证据表明angptl4的生物学功能在动脉粥样硬化、二型糖尿病、脂肪肝、肥胖等代谢疾病病理变化中起到关键作用。特别是其能够通过抑制lpl酶活性，从而在血和肝脏中的脂类代谢中起到关键作用。肝脏中脂类的代谢异常会导致tag(triacylglycerol，甘油三酯)和dag(1,2-二酰基甘油)的堆积，从而激活pkcε信号通路，导致胰岛素受体的激活被抑制，降低肝脏胰岛素敏感度。肝脏胰岛素敏感度降低会抑制血糖转化为肝糖原，促进糖原异化为葡萄糖，导致血糖升高。已有若干研究表明angptl4的表达与生物体内脂类和糖类代谢相关。
3、二型糖尿病及其相关的并发症在世界范围类有着很高的发病率，据国际糖尿病联盟统计，目前约有5.37亿成年人患有糖尿病(10％)，预计到2023年这一数字会上升到6.43亿，到2045年会上升到7.83亿，其中90％的是二型糖尿病。在我国，据《中国2型糖尿病防治指南2020年版》报道我国二型糖尿病发病率上升至11.2％。尽管近年来不断有治疗ii型糖尿病药物上市，但临床血糖控制以及患者依从性仍不理想。2020年《英国医学杂志》发表的调查研究显示，中国ii型糖尿病的治疗率为49％，而其中糖化血红蛋白(hba1c)达标的患者比例仅为49.4％。同时现有治疗ii型糖尿病药物给药频率较高，多数需要每天甚至每餐用药，患者的依从性有待提高。
4、本技术提供了一种靶向angptl4的小干扰rna(small interfering rna，sirna)制剂，能够通过特异的与angptl4的mrna结合，破坏angptl4 mrna的正常翻译模板功能，从而阻止其翻译angplt4蛋白质，从而解除对lpl酶活的抑制，降低tag、dag的含量，pkcε信号通路降低，胰岛素敏感度提升，改善血脂、血糖的代谢。
5、相比传统药物，sirna的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点；此外，还需要尝试在进一步提高活性的同时，避免引发脱靶效应、免疫刺激、细胞毒性等副作用。因此，开发出更多在血液中稳定、具有良好生物活性、细胞毒性较低且能够长效抑制angptl4基因表达的候选sirna成为迫切需要解决的问题；同时，利用上述抑制angptl4基因表达的候选sirna开发出能够有效预防和/或治疗血脂和血糖代谢异常相关疾病的药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。
技术实现思路
1、本发明提供了一种抑制angptl4基因表达的sirna，其特征在于，所述sirna包含正义链和反义链，其中，所述反义链包含与seq id no:2～seq id no:212中任一所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。
2、在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19～27个核苷酸；所述正义链长度为19～25个核苷酸。
3、在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19～23个核苷酸；所述正义链长度为19～21个核苷酸。
4、在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为23个核苷酸，所述正义链长度为21个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为22个核苷酸，所述正义链长度为20个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为21个核苷酸，所述正义链长度为21个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为21个核苷酸，所述正义链长度为19个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19个核苷酸，所述正义链长度为19个核苷酸。
5、在本发明的一些实施方案中，所述sirna包含一个或多个单链核苷酸突出端。例如1、2、3或4个核苷酸的突出端。在本发明的一些实施方案中，突出端可以在正义链、反义链或者其任何组合上。在本发明的一些实施方案中，突出端存在于sirna反义链或正义链的5’末端、3’末端或者两个末端上。
6、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链3’末端具有2个核苷酸的突出端。
7、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链3’末端具有2个核苷酸的突出端，且突出端为uu或者gg。
8、在本发明的一些实施方案中，所述sirna具有平末端。在本发明的一些实施方案中，所述sirna具有至少一个平末端，位于反义链的5’末端(或正义链的3’末端)。
9、在本发明的一些实施方案中，所述sirna具有两个平末端。
10、在本发明的一些实施方案中，所述反义链与seq id no:2～seq id no:212中所示的任一核苷酸序列差异不多于4个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链与seqid no:2～seq id no:212中所示的任一核苷酸序列差异不多于3个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链与seq id no:2～seq id no:212中所示的任一核苷酸序列差异不多于2个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链与seq id no:2～seq id no:212中所示的任一核苷酸序列差异不多于1个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链为seq id no:2～seq id no:212中所示的任一核苷酸序列。
11、在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配；在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过2个核苷酸的错配；在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过1个核苷酸的错配；在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链完全互补。
12、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的序列选自双链体1～双链体211的序列。
13、优选地，所述sirna的序列选自双链体143、双链体144、双链体146、双链体147、双链体148、双链体149、双链体209、双链体210、双链体211的序列。
14、在本发明的一些实施方案中，所述sirna至少含有一个修饰核苷酸。
15、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的正义链和/或反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸或核苷酸类似物。
16、优选地，所述修饰的核苷酸或核苷酸类似物选自2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-裂环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸、2’-烯丙基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、吗啉代核苷酸、苏糖核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、甘油核苷酸或碱基修饰的核苷酸。
17、在本发明的一些实施方案中，所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接。
18、优选地，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间均为硫代磷酸酯基连接。
19、在本发明的一些实施方案中，所述反义链5’端第一个核苷酸为为(e)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
20、本发明还提供了任一上述的sirna与缀合分子缀合而得的sirna缀合物；优选地，所述靶向配体为n-乙酰半乳糖胺。
21、在本发明的一些实施方案中，所述sirna缀合物选自缀合物1～缀合物242。
22、优选地，所述sirna缀合物选自缀合物1、缀合物5、缀合物15、缀合物16、缀合物17、缀合物19、缀合物21、缀合物22、缀合物23、缀合物28、缀合物92、缀合物93、缀合物120、缀合物130、缀合物133、缀合物225、缀合物227、缀合物234、缀合物235、缀合物236、缀合物238。
23、本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任一上述的sirna和/或任一上述的sirna缀合物和药学上可接受的载体。
24、本发明还提供了任一上述的sirna和/或任一上述的sirna缀合物和/或上述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与血管生成素样蛋白4(angptl4)基因过表达相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
25、进一步地，所述病理状况或疾病为与血脂异常相关的疾病；进一步优选地，所述与血脂异常相关的疾病为高脂血症、高甘油三酯血症、胰腺炎、家族性乳糜微粒血症综合征、糖尿病、2型糖尿病、心脏病、心肌梗塞、心绞痛或动脉粥样硬化。
26、本公开提供的sirna、sirna缀合物和药物组合物具有良好的稳定性、出色的angptl4基因抑制活性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性，并且能够显著降低血脂水平。
27、本发明中sirna靶向的angptl4基因的序列如seq id no:1所示：
28、seq id no:1(angptl4基因)
29、
30、
31、本发明中“sirna”是指含有能够以序列特异性方式降低或抑制信使rna(mrna)翻译的rna或rna类(例如化学修饰的rna)寡核苷酸分子。sirna可以通过rna干扰机制(例如通过与哺乳动物细胞的mrna干扰通路机制(rna诱导沉默复合物risc)的相互作用来诱导mrna降解)、或其它任意机制或通路发挥作用。虽然认为本发明所用的术语sirna药物主要通过rna干扰机制发挥作用，但所述sirna药物并不受限于或局限于任何特定的作用通路或机制。sirna药物包括但不限于：单链反义寡核苷酸、短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)和dicer酶底物。本发明所述的sirna药物由具有与作为靶标的mrna至少部分互补的寡核苷酸链构成。在一些实施方案中，本发明所述的sirna药物是双链的，且由反义链和与该反义链至少部分互补的正义链构成。
32、术语“序列”或“核苷酸序列”是指核碱基或核苷酸的顺序或次序，使用标准核苷酸命名法以字母顺序表示。
33、在本发明中，如无特别说明，c、g、u、a、t表示核苷酸的碱基组成，包括修饰和未修饰的核苷酸；m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟核苷酸；小写字母d表示与该字母d右侧相邻的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；gn表示表示与该标识gn右侧相邻的一个核苷酸为甘油核苷酸(gna)；tn表示表示与该标识tn右侧相邻的一个核苷酸为苏糖核苷酸(tna)；标识*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；evp表示与其右侧相邻的一个核苷酸是(e)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；iab表示反向脱碱基残基。galnac(l96)是指该处缀合有接头-靶向配体部分galnac(l96)。ser(gn)是指该处缀合有接头-靶向配体部分ser(gn)。
34、在本发明中，如无特别说明，大写字母i表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为(inosine)；mi即为核糖2’-位置为甲氧基取代的inosine；m6a表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为大写字母x表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为大写字母b表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为以上含有特殊碱基的核苷酸，如无特殊说明，均在核糖2’-位置有甲氧基取代。
35、在本发明中，如无特别说明，术语“互补”是指第一序列的寡核苷酸在一定条件下和第二序列的寡核苷酸杂交并形成双链结构的能力。“至少部分互补”是指两条序列可以是完全互补的，或者总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在相关条件下杂交的能力。另外在两个寡核苷酸设计成杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就确定互补性而言，这类突出端不应当视作错配。在本发明中，就满足以上杂交能力的要求时，“互补”序列还可以包括或完全形成自非watson(沃森)-crick(克里克)碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非watson(沃森)-crick(克里克)碱基对包括但不局限于g：u摇摆碱基配对或hoogstein(胡格斯腾)碱基配对。对应地，在本发明中，如无特别说明，“错配”是指在sirna双链体分子中，对应位置的碱基并未以互补的形式配对存在。
36、在本发明中，如无特别说明，“核苷酸序列的差异”是指相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸的碱基种类(a、u、g、c)发生了改变。例如，在原核苷酸序列中的一个核苷酸碱基为a时，在相同或相对应位置处的核苷酸碱基改变为u、c、g或核苷酸为dt、dc、dg等的情况下，认为该位置处存在核苷酸序列的差异。此处需要说明的是，在相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸仅在是否存在修饰或修饰类型方面存在区别的情况下，不认为该位置处存在核苷酸序列的差异。例如，在原核苷酸序列中的一个核苷酸碱基为u时，在相同或相对应位置处的核苷酸为dt或其它碱基修饰的核苷酸(如i、m6a、x、b)的情况下，不认为该位置处存在核苷酸序列的差异。
37、术语“正义链”是指rna分子上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链、有义链或正链，而与其互补的另外一条核苷酸序列即为反义链。
38、术语“反义链”与目标基因表达的mrna中的一段长度与所述反义链相同的核苷酸序列基本上反向互补或实质上反向互补。
39、在本发明中，如无特别说明，术语“药学上可接受的”是指载体、运载体、稀释剂、辅料和/或其所形成的盐/酯/水合物等通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
40、在本发明中，如无特别说明，术语“抑制”是指由于sirna介导的靶基因的mrna降解而使靶基因表达得以下调(down-regulation)的情况。所述“下调”是指相对于无sirna处理时，靶基因表达水平下降5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％以上或甚至100％的情况。其中，靶基因表达水平下降100％是指无可检测水平的靶基因表达。
41、在本发明的一些实施方式中，所述sirna还可根据需要含有修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸不会导致所述sirna抑制angptl4基因表达的功能明显削弱或丧失。目前，本领域存在多种可用于修饰sirna的方式，包括例如骨架修饰(如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(watts,j.k.,g.f.deleavey,and m.j.damha,chemically modified sirna:tools and applications.drug discov today,2008.13(19-20):p.842-55)。
42、在本发明的一些实施方式中，所述sirna的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，例如，所述修饰的核苷酸为核糖基团以及任选的磷酸基团被修饰的核苷酸基团，但不限于此。
43、在本发明的一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸或核苷酸类似物。
44、在本发明的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸选自：2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-裂环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸、2’-烯丙基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、吗啉代核苷酸、苏糖核苷酸(tna)、锁定核苷酸(lna)、解锁核苷酸(una)、甘油核苷酸(gna)或碱基修饰的核苷酸，但本发明不限于此。
45、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
46、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
47、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
48、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
49、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
50、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第3、7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
51、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
52、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、3、4、6、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第2位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
53、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、5、6、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第2位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
54、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、7、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第2位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
55、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、14、16、18、20位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第1、3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
56、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第1、3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
57、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、14、16位为2’-氟核苷酸，第7位为甘油核苷酸(gna)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
58、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第6位为甘油核苷酸(gna)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
59、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第4位为甘油核苷酸(gna)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
60、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第5位为甘油核苷酸(gna)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
61、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第7位为甘油核苷酸(gna)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
62、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第6位为甘油核苷酸(gna)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
63、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、5、7、12位为2’-脱氧核苷酸，第14位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。在本发明的一些实施方式中，所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其它位点为2’-甲氧基核苷酸。
64、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、5、7、12位为2’-脱氧核苷酸，第6、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。在本发明的一些实施方式中，所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其它位点为2’-甲氧基核苷酸。
65、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第5、7、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
66、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
67、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
68、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
69、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
70、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为19个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、12、14、16、18位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
71、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第14为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
72、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
73、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第22位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
74、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第23位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
75、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
76、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第21位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
77、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第22位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
78、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
79、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第6、8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
80、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
81、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第6、8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
82、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
83、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第20位为苏糖核苷，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
84、在本发明的一些实施方案中，所述sirna的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第21位为苏糖核苷，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述sirna的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。
85、在本发明的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸为磷酸基团被硫代磷酸酯基团修饰的核苷酸。即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。
86、在本发明的一些实施方式中，所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接。
87、在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、正义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间，至少有一个为硫代磷酸酯基连接；优选为至少有四个为硫代磷酸酯基连接；在本发明的一些实施方式中，至少有六个为硫代磷酸酯基连接；在本发明的一些实施方式中，八个均为硫代磷酸酯基连接。
88、在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
89、在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
90、在本发明的一些实施方案中，反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
91、在本发明一些实施方案中，正义链可包括一个或多个封端残基或部分，称为“封端残基”。“封端残基”是可以掺入sirna的核苷酸序列的一个或多个末端的非核苷酸化合物或其他部分。在本发明一些实施方案中，封端残基存在于正义链的5'末端、3'末端或5'末端和3'末端两者处。
92、在本发明一些实施方案中，添加反向脱碱基残基(iab)作为封端残基。可参见f.czauderna,nucleic acids res.,2003,31(11),2705-16。在本发明一些实施方案中，正义链的5'端和/或3'端可以包含多于一个反向脱碱基脱氧核糖部分作为封端残基。
93、在本发明一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(iab)添加到正义链的3'端。在本发明一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(iab)添加到正义链的5'端。在本发明一些实施方案中，可在接头-靶向配体部分与sirna正义链的核苷酸序列之间插入一个或多个反向脱碱基残基。在本发明一些实施方案中，在sirna正义链的一个或多个末端处或附近包含一个或多个反向脱碱基残基。
94、在本发明一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(iab)添加到正义链的5'端。在本发明一些实施方案中，可在接头-靶向配体部分与sirna正义链的核苷酸序列之间插入一个或多个反向脱碱基残基。
95、反向脱碱基残基可以经由磷酸酯、硫代磷酸酯或其他核苷间键联连接。
96、在本发明的一些实施方式中，所述反义链5’端第一个核苷酸选自如下结构：
97、
98、其中，basse为碱基a、u、g、c、t或其它核苷酸碱基。
99、在本发明的一些实施方式中，所述反义链5’端第一个核苷酸选自如下结构：
100、
101、其中，basse为碱基a、u、g、c、t或其它核苷酸碱基。
102、在本发明的一些实施方式中，所述反义链5’端第一个核苷酸为(e)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
103、在本发明的一些实施方案中，所述sirna至少含有一个碱基修饰的核苷酸。
104、在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸的碱基选自如下结构：
105、
106、在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸位于sirna反义链的第5、6、7、8位。
107、在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸位于sirna中的单链核苷酸突出端。
108、优选地，所述sirna反义链含有2个核苷酸的突出端，所述碱基修饰的核苷酸为sirna反义链突出端的第1个核苷酸。
109、优选地，所述sirna反义链含有2个核苷酸的突出端，所述碱基修饰的核苷酸为sirna反义链突出端的第2个核苷酸。
110、在本发明中，如无特别说明，“缀合”是指两个或多个化学部分之间通过共价连接的方式彼此连接；“缀合物”是指各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物；“sirna缀合物”是指一个或多个化学部分共价连接至sirna上而形成的化合物。此处需要说明的是，各个化学部分可以直接连接至sirna上，也可以通过接头连接至sirna上。
111、在本发明中，如无特别说明，“接头-靶向配体”中的“-”是指接头与靶向配体共价连接。
112、在本发明的一些实施方式中，本发明的sirna与药学上可接受的缀合分子可以缀合得到sirna缀合物。在本发明的一些实施方式中，所述sirna共价缀合至所述缀合分子。为降低缀合对sirna活性可能带来的影响，sirna与缀合分子的缀合位点可以在sirna正义链的3’端或5’端，也可在反义链的5’端。在一些实施方式中，sirna与缀合分子的缀合位点还可以在sirna的内部序列中。
113、所述药学上可接受的靶向配体可以是sirna给药领域常规使用的靶向配体，例如但不限于以下靶向配体或其衍生物中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素e)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、n-乙酰半乳糖胺(galnac)；叶酸(folate)；或肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
114、在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体为n-乙酰半乳糖胺。
115、在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体直接连接至sirna正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体直接连接至sirna正义链的5’末端。
116、在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体通过接头连接至sirna正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，所述靶向配体通过接头连接至sirna正义链的5’末端。
117、在本发明的一些实施方式中，接头-靶向配体部分具有如下结构：
118、
119、或
120、
121、其中，r选自氢、辅助基团。在本发明的一些实施方式中，辅助基团包括但不限于长链烷基、长链烯基、长链炔基、胆固醇基团、类胆固醇基团、聚乙二醇基团；在本发明的一些实施方式中，辅助基团包括但不限于多肽。
122、在本发明的一些实施方式中，接头-靶向配体部分为galnac(l96)，具有如下结构：
123、
124、在本发明的一些实施方式中，galnac(l96)连接至sirna正义链的3’末端。
125、在本发明的一些实施方式中，galnac(l96)连接至sirna正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)。
126、在本发明的一些实施方式中，接头-靶向配体部分为ser(gn)，具有如下结构：
127、
128、在本发明的一些实施方式中，ser(gn)连接至sirna正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，ser(gn)连接至sirna正义链的5’末端。
129、在本发明的一些实施方式中，ser(gn)同时连接至sirna正义链的3’末端和5’末端。
130、本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开所述的sirna作为活性成分和药学上可接受的载体。
131、在本公开的一些实施方式中，所述药物组合物含有1种如第一方面所述的sirna。在本公开的另一些实施方式中，所述药物组合物含有至少2种如第一方面所述的sirna(例如但不限于2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)作为活性成分。优选地，所述至少2种如第一方面所述的sirna各自靶向angptl4基因中的不同靶序列，由此可期望针对不同靶序列同时发挥作用而带来协同效果。此处，所谓的“不同靶序列”是指靶序列之间不存在重叠、或靶序列之间重叠的连续核苷酸个数少于5个(例如重叠的连续核苷酸个数为4个、3个、2个、1个、0个)。在此情况下，所述至少2种如第一方面所述的sirna可以以任意不同比例存在。优选地，所述至少2种如第一方面所述的sirna彼此之间可以以1:100～100:1的摩尔比存在；更优选地，所述至少2种如第一方面所述的sirna彼此之间可以以1:10～10:1、1:5～5:1或1:2～2:1的摩尔比存在。在本公开的一些实施方式中，所述至少2种如第一方面所述的sirna以相同的摩尔比存在。
1.一种用于抑制angptl4基因表达的sirna，其特征在于：所述sirna包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与seq id no:2～seq id no:212所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。
2.根据权利要求1所述的sirna，其特征在于：所述反义链长度为19～27个核苷酸；所述正义链长度为19～25个核苷酸；
3.根据权利要求1所述的sirna，其特征在于：所述反义链与seq id no:2～seq id no:212示的任一核苷酸序列差异不多于3个核苷酸；
4.根据权利要求1所述的sirna，其特征在于：所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配；
5.根据权利要求1-4任一所述的sirna，其特征在于：所述sirna的序列选自双链体1～双链体211的序列；
6.根据权利要求1-5任一所述的sirna，其特征在于：所述sirna至少含有一个修饰核苷酸。
7.根据权利要求1-6任一所述的sirna，其特征在于：所述sirna的正义链和/或反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸或核苷酸类似物；
8.根据权利要求1-7任一所述的sirna，其特征在于：所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接；
9.根据权利要求1-8任一所述的sirna，其特征在于：所述反义链5’端第一个核苷酸为为(e)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
10.权利要求1-9中任一项所述的sirna与缀合分子缀合而得的sirna缀合物；优选地，所述靶向配体为n-乙酰半乳糖胺。
11.根据权利要求10所述的sirna缀合物，其特征在于：所述sirna缀合物选自缀合物1～缀合物242；
12.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含权利要求1-9中任一项所述的sirna和/或如权利要求10-11所述的sirna缀合物和药学上可接受的载体。
13.权利要求1-9任一所述的sirna和/或如权利要求10-11所述的所述的sirna缀合物和/或权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与血管生成素样蛋白4(angptl4)基因过表达相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述病理状况或疾病为与血脂异常相关的疾病；进一步优选地，所述与血脂异常相关的疾病为高脂血症、高甘油三酯血症、胰腺炎、家族性乳糜微粒血症综合征、糖尿病、2型糖尿病、心脏病、心肌梗塞、心绞痛或动脉粥样硬化。
