本发明涉及生物医药制备外泌体，具体地说，涉及一种提高外泌体、类外泌体产量的方法。
背景技术：
1、外泌体是细胞主动分泌的膜性囊泡，起源于内涵体，直径约为40nm-100nm，可通过血液、淋巴液、脑脊液等体液系统转运至机体各处。外泌体的组成结构为脂质双分子膜包裹少量胞质，胞质中含有源细胞的各种成分，包含大量蛋白质、脂质、核酸。这些内容物在外泌体介导的细胞间物质和信息交流过程中起着关键作用。
2、近年来，外泌体逐渐应用于各类医学检测手段中，成为多种疾病的早期诊断标志物，递送小分子药物，甚至可以抑制细胞凋亡及炎症反应，参与机体的损伤修复等过程，具有非常广阔的应用前景。例如，癌细胞释放的外泌体可以包含特异性的蛋白质和rna，这些成分可以作为癌症早期诊断的标志物。此外，外泌体能够跨越生物屏障，如血脑屏障，因此它们在中枢神经系统疾病的诊断和治疗中也具有重要的应用潜力。外泌体在生物学功能和医学应用中具有重要地位。其主要功能包括：
3、细胞间通讯：外泌体可以作为细胞间通讯的载体，传递蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，从而影响受体细胞的功能。这种通讯机制在肿瘤生物学、免疫调节和组织修复等过程中起着重要作用。
4、疾病诊断：由于外泌体能够反映源细胞的状态，其内容物可以作为多种疾病的生物标志物。例如，癌症患者血液中的外泌体包含特异性mi crorna和蛋白质，可以用于癌症的早期诊断和预后评估。
5、药物递送：外泌体具有天然的纳米颗粒特性，能够保护和递送药物分子到特定的靶细胞或组织。利用外泌体作为药物递送系统，可以提高药物的稳定性和靶向性，减少副作用。
6、基因治疗：外泌体可以携带基因编辑工具(如cri spr/cas9系统)或治疗性rna分子，靶向修饰或调控特定基因表达，为基因治疗提供了一种新型的载体。
7、遗憾的是，外泌体的产量一直有待提高，存在的处理时间长、外泌体浓度小等缺陷。
技术实现思路
1、为此，本发明的发明人进行了各种尝试，以期提高外泌体纳米囊破的产率或产量。示例性地，本发明的发明人积极地进行了诸如如下尝试：
2、优化离心参数：通过优化离心速度、时间和温度等参数，减少外泌体的破裂和损失，增加产量。例如，低温离心可以保护外泌体的完整性，高效的梯度介质可以提高纯化效果。
3、开发新型分离介质：利用新型材料(如纳米材料、智能聚合物)开发高效的分离介质，结合离心和膜过滤技术，提高外泌体的分离效率和纯度。
4、引入微流控技术：微流控技术可以实现外泌体的高效分离和纯化，减少操作步骤和时间，同时保护外泌体的结构和功能。例如，利用微流控芯片进行连续化分离和纯化，可以显著提高处理效率和产量。
5、应用免疫捕获和亲和层析：结合免疫捕获和亲和层析技术，利用特异性抗体或配体分离外泌体，既能提高纯度，又能针对不同类型的外泌体进行分离和富集。
6、自动化和规模化制备设备：开发自动化和规模化的外泌体制备设备，能够连续化处理大规模样本，提高外泌体的生产效率和一致性，满足临床和工业应用的需求。
7、最终经过舍弃、选择和实验验证获得了本发明的外泌体制备方法，该方法可以显著提升外泌体的产量和纯度，降低生产成本，促进外泌体在医学诊断、药物递送和基因治疗等领域的广泛应用，推动其成为未来精准医疗和再生医学的重要工具。
8、本发明第一个目的在于提供一种提高外泌体、类外泌体产量的方法，包括：
9、贴壁培养干细胞至细胞汇合率为60％-70％，进行外泌体分泌诱导培养，获得含有外泌体的培养液；
10、在0℃-5℃下离心含有外泌体的培养液，获得含有外泌体的上清液a和细胞沉淀；
11、将细胞沉淀于-180℃～-40℃下冻存0.25h-0.75h，得到细胞沉淀冻存物；该操作通过使沉淀的细胞短暂的在低温环境中保存，使细胞表面以及细胞之间的水分快速凝结成冰晶，为细胞膜形成初步的微弱的机械性损伤，将冻存时间控制在0.25h-0.75h之间，避免了细胞内部环境进一步被破坏；
12、向细胞沉淀冻存物中添加2-5倍体积的pbs缓冲液，在60kpa-100kpa下，将其置于超声环境中进行解冻，解冻时间为5min-10min，得到重悬分解液；在细胞沉淀经过冻存处理的基础上，向细胞沉淀冻存物中添加一定量的pbs缓冲液，进行细胞沉淀冻存物的重悬，此时调节大气压强在60kpa-100kpa范围内可在细胞承受范围内提高细胞膜的通透性，促使细胞再次分泌一定量的外泌体，在超声环境中进行解冻一方面加速细胞沉淀的悬浮，另一方面通过外界振荡提高外泌体的分泌量；
13、在0℃-5℃下，以2500r/min-3000r/min的速度离心重悬分解液，获得分解上清液b和分解沉淀；
14、用pbs缓冲液重悬分解沉淀，进行物理挤压破碎，得到破碎悬液；
15、在0℃-5℃下离心破碎悬液，获得上清悬液c和破碎细胞沉淀；
16、收集上清液a、分解上清液b、上清悬液c，混匀，得到含有大量外泌体及类外泌体的囊泡悬液。
17、在一些可选实施方式中，在离心含有外泌体的培养液以获得上清液a的操作中，离心速度为1500r/min-2000r/min，离心时间为5min-10min。
18、在一些可选实施方式中，在冻存细胞沉淀以得到细胞沉淀冻存物的操作中，冻存温度优选为-60℃～-40℃，冻存时间优选为0.7h-0.75h。
19、在一些可选实施方式中，向细胞沉淀冻存物中添加pbs缓冲液的操作中，优选大气压强为80kpa-90kpa。
20、在一些可选实施方式中，向细胞沉淀冻存物中添加pbs缓冲液的操作中，向pbs缓冲液中滴加磷脂酶混合液，磷脂酶混合液的添加量为pbs缓冲液体积的2％-5％。由于细胞沉淀经过冻存处理，又很快由pbs缓冲液重悬成悬浮液，由磷脂双分子层构成的细胞膜上的冰晶位置形成了类似海绵的多孔结构，该结构首先对细胞膜造成了初步的机械性损伤，有助于提高后期物理挤压破碎细胞操作的效率，其次增大了细胞膜的表面积，提高了pbs缓冲液中添加的磷脂酶混合液在超声的环境中接触到细胞膜的概率，进一步提高了细胞膜的通透性，有助于外泌体和类外泌体扩散出细胞，提高外泌体及类外泌体的产量。
21、本发明中，干细胞来源于成体干细胞，例如存在于成人组织中，包括骨髓、脂肪组织、皮肤、肝脏等，的成体组织干细胞(adu l t t i ssue stem ce l l s)。成体干细胞在体内起到维持组织和器官功能的重要作用，其分化潜能相对较低，通常分化成与其来源组织相关的细胞类型，例如骨髓干细胞可以分化成各种血液细胞。
22、本发明中，干细胞来源于诱导多能干细胞(i psc)，其中诱导多能干细胞是通过基因工程技术将成体细胞(如皮肤细胞、血细胞等)重新程序化而成的多能干细胞，其具有与胚胎干细胞相似的多向分化潜能，但其来源更为广泛，且不具有涉及胚胎的伦理争议。
23、进一步地，本发明中，干细胞也可以来源于胎盘干细胞，胎盘干细胞存在于胎盘组织中，可从胎盘组织中分离获得。胎盘干细胞在近年来被发现具有干细胞特性，具有一定的分化潜能，被广泛用于研究和临床应用。
24、在一些可选实施方式中，磷脂酶混合液中，包括磷脂酶a1和磷脂酶a2，其中，磷脂酶a1和磷脂酶a2的质量比为2-5:1-3。在另一些可选实施方式中，磷脂酶混合液包括磷脂酶a1、磷脂酶a2、磷脂酶b1、磷脂酶b2、磷脂酶c或磷脂酶d中的一种或多种组合。
25、在一些可选的实施方式中，针对磷脂酶混合液的配方，除了包括磷脂酶a1和磷脂酶a2外，还可以添加磷脂酶b1、磷脂酶b2、磷脂酶c或磷脂酶d中的一种或多种组合。这样的多种磷脂酶的组合能够更全面地促进细胞膜的磷脂降解和外泌体释放，从而增加外泌体产量和改善外泌体的质量。磷脂酶的组合比例可以根据具体情况进行调整，以实现最佳的效果。
26、另外，在一些可选的实施方式中，针对物理破碎重悬的分解沉淀操作，采用微流控通道作为物理破碎的方式。微流控通道的设计具有精确控制流体流动和微小尺度加工的优势。挤压通道的宽度控制在10μm-15μm之间，破碎区宽度控制在2μm-5μm之间，可以实现对细胞的高效破碎，有利于释放细胞内的外泌体。这种微流控通道的应用可以提高外泌体产量，并且能够更好地控制外泌体的大小和质量，为后续的应用提供更好的基础。
27、在一些可选实施方式中，向囊泡悬液中滴加磁性纳米颗粒，于摇床上振荡吸附，获得磁微粒复合物，经后续处理得到囊泡富集液。在一些可选实施方式中，磁性纳米颗粒可为fe3o4纳米颗粒。
28、在一些可选实施方式中，用孔径为50nm-100nm的滤膜对囊泡悬液进行抽滤操作，经后续处理得到高浓囊泡滤液。
29、本发明第二目的在于提供一种外泌体的应用，采用上述的方法制备外泌体、类外泌体，用于制备外泌体注射剂。
30、本发明还提供了根据本发明的方法制备的外泌体、类外泌体在制备用于治疗与外泌体相关的疾病的药物中的用途。
31、外泌体在生物体内发挥多种重要功能，参与细胞间通讯、免疫调节、组织修复等过程。因此，外泌体在治疗多种外泌体相关疾病中展现出巨大的应用潜力。通过本发明的方法制备的外泌体，可以在以下几类疾病的治疗中发挥关键作用：
32、神经系统疾病：
33、阿尔茨海默病：外泌体可以递送神经营养因子、抗淀粉样蛋白药物等，促进神经细胞存活和功能恢复。
34、帕金森病：通过外泌体递送多巴胺前体药物或基因疗法，减缓神经退行性病变，改善患者症状。
35、心血管疾病：
36、心肌梗死：利用外泌体递送心肌保护因子、抗炎因子等，促进心肌细胞再生和修复，改善心功能。
37、动脉粥样硬化：通过外泌体递送抗氧化剂、降脂药物等，抑制动脉粥样硬化斑块的形成和发展。
38、免疫相关疾病：
39、自身免疫性疾病：如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等，外泌体可递送免疫调节剂，抑制过度免疫反应，缓解疾病症状。
40、移植排斥反应：通过外泌体递送免疫抑制剂，降低移植物排斥风险，提高移植成功率。
41、癌症：
42、实体瘤：外泌体可用于递送抗癌药物、基因编辑工具，靶向杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长和转移。
43、血液癌症：如白血病，通过外泌体递送化疗药物或靶向治疗分子，
44、提高药物在肿瘤细胞中的浓度，增强疗效。
45、感染性疾病：
46、病毒感染：外泌体可携带抗病毒药物或疫苗成分，促进病毒清除和免疫反应。例如，针对h iv、hbv等病毒的治疗。
47、细菌感染：利用外泌体递送抗生素或免疫增强剂，增强机体抗菌能力，促进感染控制。
48、示例性地，利用本发明所述方法制备的外泌体，通过化学修饰或基因工程手段装载特定药物分子。例如，采用电穿孔技术将s i rna分子装载至外泌体中，用于抑制特定基因的表达，治疗癌症或病毒感染。
49、另外，也可以优化外泌体功能，例如通过基因工程改造外泌体来源细胞，使外泌体表面表达特异性靶向分子(如抗体片段、受体配体等)，提高其在疾病靶组织中的富集效率，增强治疗效果。例如，修饰外泌体表面表达her2抗体，用于靶向治疗her2阳性乳腺癌。
50、与现有技术相比，本发明具有如下优点：
51、(1)采用本发明的方法可以高效的制备出含有大量外泌体及类外泌体的溶液，该方法包括三次操作，三次操作逐步的从同一批细胞中获得到外泌体以及类外泌体：第一步操作简单可控，通过离心即获得自然分泌的外泌体；第二步操作初步破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，提高细胞膜的通透性，再次获得一定数量的外泌体；第三次操作通过物理挤压破碎细胞的方式彻底将外泌体和类外泌体从细胞中分离。三次逐步加强的操作最大限度的将外泌体和类外泌体从细胞中提取出来，经后续处理得到高产量的外泌体及类外泌体。另外，磷脂酶的加入也进一步提高了外泌体产量。
52、(2)采用本发明的方法得到的外泌体溶液中，总蛋白浓度远高于通过传统方法得到的外泌体，且操作简单、耗时短、操作可控性强。
1.一种提高外泌体、类外泌体产量的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述离心含有外泌体的培养液以获得上清液a的操作中，离心速度为1500r/min-2000r/min，离心时间为5min-10min。
3.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，在所述冻存细胞沉淀以得到细胞沉淀冻存物的操作中，所述冻存温度为-60℃～-40℃，所述冻存时间为0.7h-0.75h。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，向所述细胞沉淀冻存物中添加pbs缓冲液的操作中，大气压强为80kpa-90kpa。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，向所述细胞沉淀冻存物中添加pbs缓冲液的操作中，向所述pbs缓冲液中滴加磷脂酶混合液，所述磷脂酶混合液的添加量为所述pbs缓冲液体积的2％-5％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶混合液中，包括磷脂酶a1和磷脂酶a2，其中，所述磷脂酶a1和所述磷脂酶a2的质量比为2-5:1-3。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，在所述物理破碎重悬的分解沉淀操作中，所述物理破碎的方式为采用微流控通道，所述微流控通道的挤压通道宽度为10μm-15μm、破碎区宽度为2μm-5μm。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，向所述囊泡悬液中滴加磁性纳米颗粒，于摇床上振荡吸附，获得磁微粒复合物，经后续处理得到囊泡富集液。
9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，用孔径为50nm-100nm的滤膜对所述囊泡悬液进行抽滤操作，经后续处理得到高浓囊泡滤液。
10.一种药物，其特征在于，其含有权利要求1-9任一所述的方法制备的外泌体、类外泌体。
11.根据权利要求10所述的药物，其为外泌体注射剂。
12.权利要求1-9任一所述的方法制备的外泌体、类外泌体在制备用于治疗与外泌体相关的疾病的药物中的用途。
