本发明属于单克隆抗体类药物分析领域，具体涉及一种单抗注射液的完整分子量、还原分子量、氨基酸序列覆盖及修饰分析的结构确证方法。
背景技术：
1、单克隆抗体(简称单抗)是一种复杂的高分子糖蛋白，具有复杂的立体结构，作为一种生物药，不同种类的单抗作用靶点不同，因此一些微小的结构变化可能会对其安全性和有效性产生显著的影响，常见的结构变化主要与工艺变化和稳定性相关，例如光照和高温可能会引起单抗的聚集造成过敏等副作用，工艺条件的改变会引起单抗的糖基化修饰不同。因此在单抗的生产及储存过程中，需要多方位的对其结构进行鉴定分析，以保证工艺可控及结构稳定。
2、高分辨质谱由于其分辨率高、灵敏度强、专属性好的特性，使其在小分析化学药中具有广泛的应用，目前可以作为结构鉴定的基础手段。而单抗药物由于结构复杂多样性，导致结构确证的方法均不完全通用，新品种均需进行液相和质谱条件的一系列优化后才适用，因此需开发一种通用且简便的方法。单抗注射液完整质量分析是无需对单抗进行化学修饰，直接进行分析的方法，可提供单抗的完整分子量及不同糖型的相对定量信息，但由于盐浓度较高及变性液对质谱的损伤，一般方法均需进行浓缩截留后进行，本方法采用高浓度变性后稀释，降低干扰物质，并通过液相截留低分子量干扰物质，简便且快速通用。单抗注射液的还原分子量可通过将单抗二硫键打开后，从亚基水平上提供单抗轻重链的分子量信息，可以对其糖基化修饰及基础结构进行分析。单抗的氨基酸序列是单抗的基础结构，传统的n端或c端测序技术最多可以测定末端几十个氨基酸，使用液相色谱-高分辨质谱仪测定氨基酸序列覆盖度，是全序列的测定，包括不同酶反应将药物蛋白酶解为大小不一的肽段，逐一分析，对比分析每个氨基酸的具体情况及不同二级碎片离子信息可分析得到不同肽段的结构与修饰位点，在肽段水平进行结构表征，可得到氨基酸取代或互补或错误转录等多重信息。
技术实现思路
1、要解决的技术问题：为了解决单克隆抗体药物结构确证方法的复杂性、通用性的问题，缩短前处理时间，保证注射液质量，结合单抗结构和序列特性，本发明建立了一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，具体步骤为：s1.单抗注射液变性稀释后进样，液相色谱进行分离，高分辨质谱一级质谱鉴定，建立完整分子量的测定方法，并使用biofinder软件对其结果进行解卷积确证解析；s2.将单抗注射液变性还原，烷基化后，经液相色谱进行分离，高分辨质谱一级质谱鉴定，建立还原分子量的测定方法，并使用bio finder软件对其结果进行解卷积确证解析；s3.还原分子量样品酶切后，经液相色谱进行分离，高分辨质谱二级质谱进行鉴定，建立氨基酸序列覆盖度的测定方法，并使用bio finder软件对其结果进行归属确证解析。本发明建立的结构确证方法可用于单克隆抗体注射液的结构确证，可以准确地确证单抗的完整分子量、还原分子量、氨基酸序列覆盖度，专属性强、抗干扰能力强、测定过程简便直接。
2、技术方案：一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，包括以下步骤：
3、s1.完整分子量及糖基化修饰测定：取1000-3000μg单抗注射液蛋白，加入50-200μl5-8m尿素溶液，37℃反应0.5-3h后，稀释10倍后，10000-13000r/min离心10-15min，取上清液，制得完整分子量样品，经液相色谱进行分离，高分辨质谱一级质谱鉴定，建立完整分子量的测定方法，并使用bio finder软件对其结果进行解卷积确证解析；
4、s2.还原分子量及糖型测定：取1000-3000μg单抗注射液蛋白，加入50-200μl5-8m尿素溶液和3-10μl50-150mg/ml二硫苏糖醇，37℃反应1h后，加碘乙酰胺烷基化15-60min，离心换液至1％碳酸氢铵后，10000-13000r/min离心10-15min，取上清液，制得还原分子量样品，经液相色谱进行分离，高分辨质谱一级质谱鉴定，建立还原分子量的测定方法，并使用bio finder软件对其结果进行解卷积确证解析；
5、s3.氨基酸序列覆盖度测定：取s2中还原分子量样品，加入3-20μg酶，37-60℃超声酶切4-12h，加入5-10μl50％甲酸终止反应，10000-13000r/min离心10-15min，取上清液，经液相色谱进行分离，高分辨质谱二级质谱进行鉴定，建立氨基酸序列覆盖度的测定方法，并使用bio finder软件对其结果进行归属确证解析。
6、进一步的，所述单抗注射液蛋白包括贝伐珠单抗注射液、信迪利单抗注射液、阿得贝利单抗注射液、西妥昔单抗注射液、利妥昔单抗注射液和曲妥珠单抗注射液。
7、进一步的，所述步骤s1中完整分子量的液相色谱和高分辨质谱一级质谱条件如下：
8、其中，液相色谱条件为：
9、色谱柱：1500a苯基色谱柱，mabpactm rp，4μm，2.1x 50mm；
10、流动相：a为0.02-0.2％酸性水溶液、b为0.02-0.2％酸性有机溶液；
11、柱温：30-80℃；
12、进样量：2-10μl；
13、流速：0.2-0.4ml/min；
14、梯度洗脱程序：0-(1～3)min，10％b；(1～3)-(6～8)min，10％b→50％-90％b；(6～8)-(6.1～8.1)min，50％-90％b；(6.1～8.1)-(8～15)min，10％b；
15、高分辨质谱一级质谱条件：
16、质谱分辨率设置为17500；
17、喷雾电压：3-3.8kv；
18、毛细管温度：250-400℃；
19、鞘气流速：15-60arb；
20、辅助气流速：10-35arb；
21、probe温度：200-400℃；
22、agc：3e6；
23、母离子扫描范围：m/z 1800-4000；
24、s lens：50；
25、bio finder软件解析条件：peak detection quality measure 95％，masstolerance 6-20ppm，glycosylationn-linked cho glycosylation，max.numberofmodifications 2-4。
26、进一步的，所述酸性水溶液包括甲酸水溶液、乙酸水溶液和三氟乙酸水溶液；所述酸性有机溶液包括甲酸甲醇溶液、乙酸甲醇溶液、三氟乙酸甲醇溶液、甲酸乙腈溶液、乙酸乙腈溶液和三氟乙酸乙腈溶液。
27、进一步的，所述步骤s2中还原分子量的液相色谱和高分辨质谱一级质谱条件如下：
28、其中，液相色谱条件为：
29、色谱柱：1500a苯基色谱柱，mabpactm rp，4μm，2.1x 50mm；
30、流动相：a为0.02-0.2％酸性水溶液、b为0.02-0.2％酸性有机溶液；
31、柱温：30-80℃；
32、进样量：2-10μl；
33、流速：0.2-0.4ml/min；
34、梯度洗脱程序：0-(1～3)min，25％b；(1～3)-(10～15)min，25％b→30％-35％b；(10～15)-(13～20)min，30％-35％b→70％-90％b；(13～20)-(13.1～20.1)min，70％-90％b→25％b；(13.1～20.1)-(15～30)min，25％b；
35、高分辨质谱一级质谱条件：
36、质谱分辨率设置为17500；
37、喷雾电压：3-3.8kv；
38、毛细管温度：250-400℃；
39、鞘气流速：15-60arb；
40、辅助气流速：10-35arb；
41、probe温度：200-400℃；
42、agc：3e6；
43、母离子扫描范围：m/z 600-2600；
44、s lens：50；
45、bio finder软件解析条件：peak detection quality measure 95％，masstolerance 6-20ppm，glycosylationn-linked cho glycosylation，max.numberofmodifications 2-4。
46、进一步的，所述步骤s3中酶包括胰蛋白酶、g1u-c酶、v8酶和lys-c酶。
47、进一步的，所述步骤s3中氨基酸序列覆盖度的液相色谱和高分辨质谱二级质谱条件如下：
48、其中，液相色谱条件为：
49、色谱柱：c18色谱柱，acquity uplc peptite csh c18，1.7μm，2.1x150mm；
50、流动相：a为0.02-0.2％酸性水溶液、b为0.02-0.2％酸性有机溶液；
51、柱温：30-80℃；
52、进样量：2-5μl；
53、流速：0.2-0.4ml/min；
54、梯度洗脱程序：0-(2～5)min，3％b；(2～5)-(30～85)min，3％b→30％-40％b；(30～85)-(40～95)min，30％-40％b→80％-95％b；(40～95)-(40.01～95.01)min，80％-95％b→3％b；(40.01～95.01)-(50～100)min，3％b；
55、高分辨质谱二级质谱条件：
56、质谱分辨率：一级70000，二级17500；
57、喷雾电压：3-3.8kv；
58、毛细管温度：250-400℃；
59、鞘气流速：15-60arb；
60、辅助气流速：10-35arb；
61、probe温度：200-400℃；
62、母离子扫描范围：m/z200-2000；
63、bio finder软件解析条件：s/n threshold 20，glycosylation cho。
64、有益效果：
65、1.本发明采用液质联用技术，专属性强，灵敏度高，使用样品量少，不易受样品中杂质干扰，方法通用且测定过程简便直接，无需浓缩及过滤，通过对完整分子量、还原分子量、氨基酸序列覆盖度的分析，可用于后续多批次或其他品种的单抗注射液的结构确证。
1.一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述单抗注射液蛋白包括贝伐珠单抗注射液、信迪利单抗注射液、阿得贝利单抗注射液、西妥昔单抗注射液、利妥昔单抗注射液和曲妥珠单抗注射液。
3.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于，所述步骤s1中完整分子量的液相色谱和高分辨质谱一级质谱条件如下：
4.根据权利要求3所述的一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述酸性水溶液包括甲酸水溶液、乙酸水溶液和三氟乙酸水溶液；所述酸性有机溶液包括甲酸甲醇溶液、乙酸甲醇溶液、三氟乙酸甲醇溶液、甲酸乙腈溶液、乙酸乙腈溶液和三氟乙酸乙腈溶液。
5.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于，所述步骤s2中还原分子量的液相色谱和高分辨质谱一级质谱条件如下：
6.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于：所述步骤s3中酶包括胰蛋白酶、g1u-c酶、v8酶和lys-c酶。
7.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体注射液的高分辨质谱结构确证方法，其特征在于，所述步骤s3中氨基酸序列覆盖度的液相色谱和高分辨质谱二级质谱条件如下：
