本发明涉及分子生物，具体为一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法。
背景技术：
1、微小rna(microrna，mirna)是一类能在基因转录后水平调节靶蛋白表达的非编码小分子rna，其通过降解靶mrna和抑制mrna翻译两种方式精细地、定量地调节细胞的多种功能。mirna在细胞分化、发育、疾病发生等过程中发挥重要作用。研究表明，表达紊乱的mrna参与了机体诸多疾病的发生发展。然而，目前对mirna表达调控机制的理解尚不深入，特别是在启动子区域与上游转录因子的相互作用方面。
2、研究表明，mirna受到的调控主要体现在dna甲基化和转录因子结合方面。目前常用的mirna甲基化检测方法包括：甲基化特异性聚合酶链反应和焦磷酸测序；转录因子结合检测方法主要为：电泳迁移率变化分析、染色质免疫沉淀和荧光素酶报告基因分析。虽然此些方法可以具体确定甲基化位点和转录因子结合位点，然而实验耗时、耗力，步骤繁琐，检测费用较高，不适用于初期筛选。
3、目前，有诸多数据库可以用来预测特定转录因子在dna上的结合，然而缺乏系统性、连贯性，且匹配度不高，干扰性较强。综上所述的问题，为此，我们提出一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，解决了现有的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，包括以下步骤：
4、步骤s1、预测mirna启动子甲基化情况；
5、步骤s2、预测转录因子结合情况；
6、步骤s3、验证转录因子与启动子的结合；
7、步骤s4、验证转录因子对mirna表达的影响。
8、优选的，所述步骤s1中，利用mirbase和ensembl网站确定mir-384基因启动子区；embosscpgplot网站分析启动子区dna序列的甲基化情况。
9、优选的，所述步骤s2中，ecrbrowser网站分析启动子区转录因子结合区域及其保守性；jaspar数据库筛选启动子区结合的转录因子。
10、优选的，所述步骤s3中，染色质免疫沉淀检测细胞中mir-384基因启动子区stat3的结合量，免疫共沉淀使用p-stat3抗体。
11、优选的，所述步骤s3中，细胞经1％甲醛交联后，加入裂解液，超声破碎染色质至200～1000bp，后续步骤严格按照ezmagnachiptmhisens试剂盒说明进行。
12、优选的，所述步骤s3中，提纯的dna使用荧光定量pcr试剂盒进行检测，引物如下：
13、site1，5’-atgctataaccaccacca，5’-cttgggatattgttctgtaa；
14、site2，5’-tgctgccttctgctttga，5’-caggcattgtgaacaatttcta。
15、优选的，所述步骤s4中，qrt-pcr检测stat3激活是否可以调节mir-384的转录；
16、步骤s41、将细胞培养于rpmi-1640培养基，rpmi-1640培养基采用10％fbs，1mmol/l谷氨酰胺，1％非必需氨基酸配制，隔天半量换液；
17、步骤s42、将细胞分为对照组、il-620ng/ml处理组和ag49010μm处理组；
18、步骤s43、trizol法提取细胞总rna，使用mircuteplusmirnafirst-strandcdna试剂盒合成cdna，采用mircuteplusmirnaqpcr试剂盒上机检测。
19、优选的，所述步骤s43中，引物如下：rorγt，5’-tgcaagactcatcgacaagg，5’-aggggattcaacatcagtgc；β-actin，5’-gagaccttcaacaccccagcc，5’-aatgtcacgcacgatttccc。
20、一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，包括以下步骤：
21、步骤s1、预测mirna启动子甲基化情况；
22、步骤s2、预测转录因子结合情况；
23、步骤s3、验证转录因子与启动子的结合；
24、步骤s4、验证转录因子对mirna表达的影响。
25、一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，具体的包括以下步骤：
26、步骤s1、预测mirna启动子甲基化情况：
27、利用ucsc和ensembl网站确定mir-30a基因启动子区；embosscpgplot网站分析启动子区dna序列的甲基化情况；
28、步骤s2、预测转录因子结合情况：
29、ecrbrowser网站分析启动子区转录因子结合区域及其保守性；
30、jaspar数据库筛选启动子区结合的转录因子；
31、步骤s3、验证转录因子与启动子的结合：
32、染色质免疫沉淀检测细胞中mir-30a基因启动子区creb的结合量；
33、细胞经1％甲醛交联后，加入裂解液，超声破碎染色质至200～1000bp，后续步骤严格按照试剂盒说明进行。
34、步骤s4、验证转录因子对mirna表达的影响：
35、qrt-pcr检测creb抑制是否可以调节mir-30a的转录。
36、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
37、本发明结合生物信息学和分子生物学技术，以mir-384和mir-30a基因启动子区为靶点，探索mir-384和mir-30a的转录调节机制，以期为研究mirna的表达提供一种可行的实验思路。
38、本发明中，p-stat3可以与mir-384启动子顺式激活元件中的保守位点结合，creb可以与mir-30a启动子顺式激活元件中的保守位点结合。
39、本发明中，stat3调节mir-384的转录，creb调节mir-30a的转录。
40、本发明经电泳迁移率变化分析和染色质免疫沉淀实验验证，结果准确，成功率高，此方法可简便、快捷、准确、无费用地筛选出有效的mirna上游调控方式。
1.一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s1中，利用mirbase和ensembl网站确定mir-384基因启动子区；embosscpgplot网站分析启动子区dna序列的甲基化情况。
3.根据权利要求1所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s2中，ecrbrowser网站分析启动子区转录因子结合区域及其保守性；jaspar数据库筛选启动子区结合的转录因子。
4.根据权利要求1所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s3中，染色质免疫沉淀检测细胞中mir-384基因启动子区stat3的结合量，免疫共沉淀使用p-stat3抗体。
5.根据权利要求4所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s3中，细胞经1％甲醛交联后，加入裂解液，超声破碎染色质至200～1000bp，后续步骤严格按照ezmagnachiptmhisens试剂盒说明进行。
6.根据权利要求5所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s3中，提纯的dna使用荧光定量pcr试剂盒进行检测，引物如下：
7.根据权利要求1所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s4中，qrt-pcr检测stat3激活是否可以调节mir-384的转录；
8.根据权利要求7所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，所述步骤s43中，引物如下：rorγt，5’-tgcaagactcatcgacaagg，5’-aggggattcaacatcagtgc；β-actin，5’-gagaccttcaacaccccagcc，5’-aatgtcacgcacgatttccc。
9.根据权利要求1所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的一种系统性检测mirna启动子甲基化及转录因子结合的方法，其特征在于，具体的包括以下步骤：
