本发明提供了大规模黄病毒疫苗生产和制造的方法。本文提供的方法专门考虑用于大规模生产和制造活的减毒黄病毒疫苗，诸如活的减毒登革病毒疫苗。此外，本文提供的方法涉及活的、减毒的、单价、二价、三价或四价的病毒疫苗产品的配制。
背景技术：
1、扩大疫苗制造能力对于阻止疾病的全球传播以及阻止病毒新变种的出现至关重要。疫苗生产和制造的最大挑战之一是经济地利用资源来满足向全球数十亿人日益增加的递送挑战。
2、黄病毒是持续对公众健康构成日益扩大的威胁的一类病毒。这些是媒介传播的rna病毒，这些病毒可能意外地出现在人类群体中并导致一系列潜在的严重疾病，包括肝炎、血管休克综合征、脑炎、急性弛缓性麻痹、先天性异常和胎儿死亡。这种流行病学模式已经在过去70年中出现过多次，包括登革病毒(dengue virus)和西尼罗河病毒(west nilevirus)的流行，以及最近在美洲爆发的寨卡病毒(zika virus)疫情。黄病毒现在遍布全球，和每年感染人数多达4亿。值得关注的问题，世界不同地区的人类和动物中已报告了其他特征不太明确的黄病毒的爆发。这些病毒在人类间持续流行传播的可能性知之甚少。因此，迫切需要更经济、更高效且更稳健的大规模生产和制造黄病毒的方法，所述方法可以可靠地提升制造能力并满足高需求。
3、在所有疫苗制造步骤中都观察到供给压力的早期迹象，例如用于感染第一生产培养物的工作毒种，或生产疫苗组分的生物反应器，或纯化病毒的色谱和过滤步骤，或包含疫苗组分的过滤器和小瓶。这些单独的挑战可能具有复合效应：单一输入的缺乏会扰乱整个制造过程。因此，迫切需要重新发明在每个步骤提供与日益增长的疫苗需求同步的经济定制过程的大规模疫苗生产和制造。
技术实现思路
1、本发明提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：(i)在生长培养基中提供细胞，(ii)用包含低moi的黄病毒的感染培养基感染步骤(i)的所述细胞，(iii)收获以获得收获物，(iv)加工步骤(iii)的所述收获物以获得加工的收获物，以及(v)纯化步骤(iv)的所述加工的收获物，其中步骤(v)包括至少一个色谱步骤。
2、本发明提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：(i)在生长培养基中提供细胞，(ii)用包含低moi的黄病毒的感染培养基感染步骤(i)的所述细胞，(iii)收获以获得收获物，(iv)加工步骤(iii)的所述收获物以获得加工的收获物，以及(v)纯化步骤(iv)的所述加工的收获物，其中步骤(v)包括至少一个色谱步骤。在本文中，步骤(ii)中的感染方法是静态的，其中细胞以单层形式感染。
3、本发明提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：(i)在生长培养基中提供细胞，(ii)用包含低moi的黄病毒的感染培养基感染步骤(i)的所述细胞，(iii)收获以获得收获物，其中收获包括第一收获步骤和至少一个进一步收获步骤，并且其中在所述第一收获步骤前至少12至30小时进行培养基更换，(iv)加工步骤(iii)的所述收获物以获得加工的收获物，以及(v)纯化步骤(iv)的所述加工的收获物，其中步骤(v)包括至少一个色谱步骤。
4、本发明提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：(i)在生长培养基中提供细胞，(ii)用包含低moi的黄病毒的感染培养基感染步骤(i)的所述细胞，(iii)收获以获得收获物，其中收获包括第一收获步骤和至少一个进一步收获步骤，并且其中在所述第一收获步骤前至少12至30小时进行培养基更换，(iv)加工步骤(iii)的所述收获物以获得加工的收获物，以及(v)纯化步骤(iv)的所述加工的收获物，其中步骤(v)包括至少一个色谱步骤。在本文中，步骤(ii)中的感染方法是静态的，其中细胞以单层形式感染。
5、本发明提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：(i)在生长培养基中提供细胞，(ii)用包含低moi的黄病毒的感染培养基感染步骤(i)的所述细胞，(iii)收获以获得收获物，(iv)加工步骤(iii)的所述收获物以获得加工的收获物，以及(v)纯化步骤(iv)的所述加工的收获物，其中步骤(v)包括至少一个色谱步骤，并且其中步骤(v)包括以下连续步骤：(v-a)离子交换色谱法以获得纯化的收获物，和(v-b)超滤。
6、本发明提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造的方法，其包括以下连续步骤：(i)在生长培养基中提供细胞，(ii)用包含黄病毒的感染培养基感染步骤(i)的所述细胞，(iii)收获以获得收获物，(iv)加工步骤(iii)的所述收获物以获得加工的收获物，以及(v)纯化步骤(iv)的所述加工的收获物，其中步骤(v)包括至少一个色谱步骤，其中步骤(iii)至(v)中的ph保持在7.6至8.1的范围，并且其中(a)在步骤(iii)至(v)中任何时间点出现的最大ph与(b)在步骤(iii)至(v)中任何时间点出现的最小ph之间的差不大于0.4或0.3个单位。
7、根据本发明，优选地，生产培养的总表面积在量级上可达到35,000cm2或更大，例如50,000cm2至1,000,000cm2、100,000cm2至1,000,000cm2、50,000cm2至450,000cm2、100,000cm2至450,000cm2。
8、根据本发明，优选地黄病毒为登革病毒，优选地，登革病毒选自由活的、减毒登革-2病毒血清型、登革2/1嵌合体、登革2/3嵌合体和登革2/4嵌合体组成的组。
9、本发明还提供了一种大规模黄病毒疫苗生产和制造的方法，其包括配制药物制剂。所述药物制剂优选包含四价登革病毒疫苗，所述四价登革病毒疫苗包含活的减毒登革-2病毒血清型、登革2/1嵌合体、登革2/3嵌合体和登革2/4嵌合体。
1.一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中的所述感染方法是静态的，和/或所述细胞以单层形式感染。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述低moi小于0.008。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述低moi为0.005或更低。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中收获包括第一收获步骤和任选地至少一个进一步收获步骤。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(iii)中的收获包括从步骤(ii)中获得的所述细胞收集上清液。
7.如权利要求6所述的方法，其中收集所述上清液后紧接着添加新鲜培养基。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中在所述第一收获步骤前至少12至30小时进行培养基更换。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述培养基更换包括丢弃所述上清液并添加新鲜培养基。
10.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述第一收获步骤在感染后第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天或第10天进行。
11.如权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述至少一个进一步收获步骤包括多达九个，优选五个进一步收获步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中每个收获步骤之间的间隔为至少20至30小时。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括在生长培养基中扩增细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述生长培养基不包含非离子表面活性剂。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是贴壁细胞。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞包含丰富的黄病毒受体。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞包含丰富的登革病毒受体。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞选自由madin-da rby犬肾细胞、猴细胞系pmk、vero细胞及人细胞系hek 293、mr c 5、per.c6、pmk和wi-38组成的组。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞为vero细胞。
20.如权利要求2至19中任一项所述的方法，其中步骤(ii)的所述感染培养基覆盖所述细胞单层。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括孵育所述细胞50至250分钟、60至200分钟或70至150分钟。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述细胞在介于36至39℃之间的温度范围孵育。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)后紧接着是一个、两个、三个或四个洗涤步骤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞用pbs、dpbs或tbs洗涤。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)包括所述收获物的澄清。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述收获物的澄清包括一个或多个深度过滤步骤。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述一个或多个深度过滤步骤包括采用孔径为0.1μm至1μm的过滤器。
28.如权利要求26至27中任一项所述的方法，其中所述一个或多个深度过滤步骤包括采用异质双层过滤器。
29.如权利要求25至28中任一项所述的方法，其中在澄清后立即冷冻所述收获物。
30.如权利要求6所述的方法，其中在收集所述上清液后立即冷冻所述收获物。
31.如权利要求30所述的方法，其中对从第一收获步骤和至少一个进一步收获步骤获得的汇集收获物进行所述澄清。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)包括所述收获物的稳定。
33.如权利要求32所述的方法，其中稳定包括将稳定缓冲液添加到所述收获物或所澄清的收获物中。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述稳定缓冲液包含糖、表面活性剂和蛋白质。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(v)包括以下连续步骤：
36.如权利要求35所述的方法，其中所述离子交换色谱法是阴离子交换色谱法。
37.如权利要求35至36所述的方法，其中步骤(v-a)是对澄清且稳定的收获物进行的。
38.如权利要求35至7中任一项所述的方法，其中步骤(v-b)的超滤是切向流过滤。
39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中在步骤(v-a)后获得的所述纯化收获物包含50ng/ml或更低的宿主细胞dna。
40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中在步骤(v-b)的所述超滤后获得原料药。
41.如权利要求35至40中任一项所述的方法，其还包括加工所述原料药的步骤(vi)，优选包括用冲洗缓冲液对超滤膜进行至少一个冲洗步骤以获得包含缓冲液冲洗液和原料药的组合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中包含所述原料药和所述缓冲液冲洗液的所述组合物是散装原料药。
43.如权利要求41至42中任一项所述的方法，其中所述冲洗缓冲液包含糖、表面活性剂和蛋白质。
44.如权利要求35至45中任一项所述的方法，其中步骤(v-b)的所述原料药的体积是步骤(v-a)后获得的所述纯化收获物的体积的1/2至1/10。
45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中
46.如权利要求45所述的方法，其中在(iii)的所述第一收获步骤后20-30小时进行第二收获步骤，并在同一天重复步骤(iv)至(vi)以获得第二散装原料药。
47.如权利要求46所述的方法，其中进行总共多达十个收获步骤一获得十份散装原料药，优选进行总共多达六个收获步骤一获得六份散装原料药，其中每个收获步骤之间的间隔为20-30小时。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：登革血清型1(denv-1)诸如登革2/1嵌合体、登革血清型2(denv-2)、登革血清型3(denv-3)诸如登革2/3嵌合体和登革血清型4(denv-4)诸如登革2/4嵌合体。
49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：由seq id no:1和/或2表示的tdv-1、由seq id no:3和/或4表示的tdv-2、由seq idno:5和/或6表示的tdv-3和由seq id no:7和/或8表示的tdv-4。
50.如权利要求42至47中任一项所述的方法，其包括加工所述散装原料药的步骤(vii)，包括
51.如权利要求50所述的方法，其包括储存从步骤(vii-b)获得的所述冷冻散装原料药的步骤(viii)，优选其中步骤(viii)与步骤(vii-a)和(vii-b)在同一天进行。
52.如权利要求50和51中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：登革血清型3(denv-3)诸如登革2/3嵌合体和登革血清型4(denv-4)诸如登革2/4嵌合体。
53.如权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：由seq id no:5和/或6表示的tdv-3和由seq id no:7和/或8表示的tdv-4。
54.如权利要求42至47中任一项所述的方法，其包括加工所述散装原料药的步骤(vii)，包括
55.如权利要求54所述的方法，其包括储存从步骤(vii-e)获得的所述冷冻散装原料药的步骤(viii)，优选其中步骤(viii)与步骤(vii-a)至(vii-e)在同一天进行。
56.如权利要求54至55所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：登革血清型1(denv-1)诸如登革2/1嵌合体和登革血清型2(denv-2)。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：由seq id no:1和/或2表示的tdv-1、由seq id no:3和/或4表示的tdv-2。
58.如权利要求51-53或55-57中任一项所述的方法，其还包括配制药物制剂的步骤(ix)。
59.如权利要求58所述的方法，其中配制药物制剂包括以下连续步骤：
60.如权利要求59所述的方法，其中所述配制缓冲液包含第一赋形剂缓冲液(feb)和第二赋形剂缓冲液(seb)。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述feb和所述seb各自包含四种盐、糖、非离子表面活性剂和蛋白质。
62.如权利要求59至61中任一项所述的方法，其中步骤(ix-a)包括解冻两份、三份或四份散装原料药，所述散装原料药各自包含选自由活的减毒登革病毒组成的组的不同登革血清型，所述活的减毒登革病毒选自由以下组成的组：登革血清型1(denv-1)诸如登革2/1嵌合体、登革血清型2(denv-2)、登革血清型3(denv-3)诸如登革2/3嵌合体、登革血清型4(denv-4)诸如登革2/4嵌合体。
63.如权利要求59至62中任一项所述的方法，其中步骤(ix-a)包括解冻两份、三份或四份散装原料药，所述散装原料药各自包含选自以下的不同登革血清型：由seq id no:1和/或2表示的tdv-1、由seq id no:3和/或4表示的tdv-2、由seq id no:5和/或6表示的tdv-3和由seq id no:7和/或8表示的tdv-4。
64.如权利要求62或63所述的方法，其中在步骤(ix-a)之后立即和在步骤(ix-b)之前，将两份、三份或四份解冻的散装原料药混合。
65.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述病毒疫苗为二价、三价或四价，优选其中所述病毒疫苗为四价登革疫苗tak-003。
66.如权利要求48至65中任一项所述的方法，其中所述活的减毒登革-2病毒血清型是denv-2 16681来源的den-2pdk-53变体形式，所述den-2pdk-53变体形式在ns1-53、5’ncr-57和ns3-250处具有三重突变，使得ns3蛋白的氨基酸位置250含有缬氨酸残基，并且其中所述嵌合体具有作为病毒骨架的所述den-2pdk-53基因组且所述den-2pdk-53基因组的编码衣壳、前膜/膜或包膜的一个或多个结构蛋白基因或其组合被来自den-1、den-3或den-4的一个或多个相应结构蛋白基因置换。
67.如权利要求48至66中任一项所述的方法，其中所述登革2/1嵌合体具有两个另外的突变，使得ns2a蛋白的氨基酸位置116含有亮氨酸残基并且ns2b蛋白的氨基酸位置92含有天冬氨酸残基，其中所述活的减毒登革-2病毒血清型具有两个另外的突变，使得prm蛋白的氨基酸位置52含有谷氨酸残基并且ns5蛋白的氨基酸位置412含有缬氨酸残基，其中所述登革-2/3嵌合体具有作为病毒骨架的所述den-2pdk-53基因组并且所述den-2pdk-53基因组的prm-e基因(nt-457至2373)被来自野生型den-3 16562的相应prm-e基因置换，并且其中所述登革-2/3嵌合体在来自野生型den-3 16562的所述相应prm-e基因处具有一个另外的突变，使得e蛋白的氨基酸位置223含有丝氨酸残基，并且其中所述登革-2/4嵌合体具有两个另外的突变，使得所述ns2a蛋白的氨基酸位置66含有甘氨酸残基并且所述ns4a蛋白的氨基酸位置21含有缬氨酸残基，并且其中所述登革-2/4嵌合体就所述ns2a蛋白的氨基酸99含有精氨酸或赖氨酸残基而言为混合基因型。
68.如权利要求48至67中任一项所述的方法，其中所述登革-2/1嵌合体具有作为病毒骨架的所述den-2pdk-53基因组并且所述den-2pdk-53基因组的prm-e基因(nt-457至2379)被来自野生型den-1 16007的相应prm-e基因置换，其中所述登革-2/3嵌合体具有作为病毒骨架的所述den-2pdk-53基因组并且所述den-2pdk-53基因组的prm-e基因(nt-457至2373)被来自野生型den-3 16562的相应prm-e基因置换，并且其中所述登革-2/4嵌合体具有作为病毒骨架的所述den-2pdk-53基因组并且所述den-2pdk-53的prm-e基因(nt-457至2379)被来自野生型den-4 1036的相应prm-e基因置换。
69.如权利要求48至68中任一项所述的方法，其中所述活的减毒登革-2病毒血清型由seq id no:3的多核苷酸或seq id no:4的多肽表示；所述登革2/1嵌合体具有来自修饰的活的减毒登革-2病毒血清型的非结构蛋白和由seq id no:1的多核苷酸或seq id no:2的多肽表示的登革-1病毒血清型的结构蛋白；所述登革2/3嵌合体具有来自修饰的活的减毒登革-2病毒血清型的非结构蛋白和由seq id no:5的多核苷酸或seq id no:6的多肽表示的登革-3病毒血清型的结构蛋白；并且所述登革2/4嵌合体具有来自修饰的活的减毒登革-2病毒血清型的非结构蛋白和由seq id no:7的多核苷酸或seq id no:8的多肽表示的登革-4病毒血清型的结构蛋白。
70.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法提供高病毒滴度。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法与包含相同的工艺步骤但其中在步骤(ii)，用包含高moi的黄病毒的感染培养基感染所述细胞的方法相比，提供更高的平均病毒滴度，优选其中高moi是指大于0.008的moi。
72.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法与包含相同的工艺步骤但其中在步骤(ii)，用包含高moi的黄病毒的感染培养基感染所述细胞并且在所述第一收获步骤前12-30小时进行培养基更换的方法相比，提供更高的平均病毒滴度，优选其中高moi是指大于0.008的moi。
73.如权利要求70中任一项所述的方法，其中所述高病毒滴度是大于7.0log10 pfu/ml，优选大于7.5log10 pfu/ml的滴度。
74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中大规模包括表面积为35,000cm2或更大的生产培养物。
75.如权利要求74所述的方法，其中大规模包括表面积为50,000cm2或更大的生产培养物。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中大规模包括表面积为100,000cm2或更大的生产培养物。
77.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒疫苗是活的减毒四价登革疫苗，优选tak-003。
78.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iii)至(v)中的ph保持在7.6至8.1的范围，并且其中
79.如权利要求45至77中任一项所述的方法，其中步骤(iii)至(vi)中的ph保持在7.6至8.1的范围，并且其中
80.如权利要求50至77中任一项所述的方法，其中步骤(iii)至(vii)中的ph保持在7.6至8.1的范围，并且其中
81.一种大规模黄病毒疫苗生产和制造方法，其包括以下连续步骤：
82.如权利要求78所述的方法，其中权利要求78(a)与78(b)之间的差不大于0.3个单位。
83.如权利要求79所述的方法，其中权利要求79(a)与79(b)之间的差不大于0.3个单位。
84.如权利要求80所述的方法，其中权利要求80(a)与80(b)之间的差不大于0.3个单位。
85.如权利要求81所述的方法，其中权利要求81(a)与81(b)之间的差不大于0.3个单位。
86.如权利要求78所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求78(a)与权利要求78(b)之间的差大于0.4个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
87.如权利要求79所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求79(a)与权利要求79(b)之间的差大于0.4个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
88.如权利要求80所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求80(a)与权利要求80(b)之间的差大于0.4个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
89.如权利要求81所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求81(a)与权利要求81(b)之间的差大于0.4个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
90.如权利要求81中任一项所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求81(a)与权利要求81(b)之间的差大于0.3个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
91.如权利要求82所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求82(a)与权利要求82(b)之间的差大于0.3个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
92.如权利要求83所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求83(a)与权利要求83(b)之间的差大于0.3个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
93.如权利要求84所述的方法，其中所述方法与具有相同工艺步骤但允许权利要求84(a)与权利要求84(b)之间的差大于0.3个单位的相同方法相比，产生更高的病毒产量。
94.如权利要求86至93中任一项所述的方法，其中病毒产量的增加为至少约1mg/cm2，诸如1.5mg/cm2。
95.如权利要求81至94中任一项所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：登革血清型1(denv-1)、登革血清型2(denv-2)、登革血清型3(denv-3)和登革血清型4(denv-4)。
96.如权利要求48、62或95所述的方法，其中所述黄病毒是选自以下的活的减毒登革病毒：登革2/1嵌合体、登革血清型2、登革2/3嵌合体和登革2/4嵌合体。权利要求95：一种通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的病毒组合物。
97.一种通过根据权利要求65至94所述的方法获得的病毒疫苗。
98.一种药物包装，其包含通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的病毒疫苗。
