本发明属于分子标记，尤其涉及一种黄瓜csapt3基因及其dna甲基化分子标记和应用。
背景技术：
1、黄瓜(cucumis sativus l.)是葫芦科甜瓜属一年生攀援草本植物，黄瓜含有丰富的维生素c、维生素k、钾和镁等营养成分，对人体健康有诸多益处。食用黄瓜有助于促进消化、润肠通便、利尿排毒、消肿减肥和增强免疫力。同时，黄瓜中的黄瓜酶具有显著的抗氧化作用，能够延缓皮肤衰老，保持肌肤弹性，因此在美容护肤品中被广泛应用，经济和保健价值极高。
2、蚜虫，是半翅目蚜总科的统称，目前已经发现的蚜虫总共有10个科约4400种，其中多数属于蚜科，广泛分布于世界各地，每年造成粮食作物减产5-20％，是全球十大经济害虫之一。蚜虫危害作物众多，其中尤其与黄瓜生产期一致，其在黄瓜幼嫩部位产生大量蜜露造成煤污病，影响植物光合作用，进而导致植物养分不足，同时还能传播病毒，导致植株萎蔫或死亡，在生产上危害十分严重。黄瓜生产上常用治蚜手段是喷施农药，但会出现“3r”问题，因此从基因方面考虑，培育抗蚜品种才是应对黄瓜蚜虫胁迫危害的根本途径，才能根本上解决生产上的虫害问题。
3、在真核生物中，核苷酸胞嘧啶碱基的5号碳原子上可以在dna甲基转移酶的催化下引入一个甲基基团，这一现象称为dna甲基化。dna甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在调控基因表达和抑制转座子活动中具有重要作用。生物体能够根据环境变化调整其dna甲基化水平，进而产生不同的表型以适应新环境，这些表型变化还可以遗传给后代。这使得dna甲基化变化与生物逆境胁迫响应密切相关。
4、目前，黄瓜表观遗传相关的研究内容较少，dna甲基化在黄瓜上对于蚜虫胁迫的响应机制尚不明确，黄瓜中也没有可以用于选育蚜虫抗性种质的分子标记，因此，得到一种能够应用于黄瓜抗蚜育种，进而获得优良遗传性状优良品种的dna甲基化的分子标记成为了目前急需解决的技术问题。且传统的黄瓜抗蚜性筛选鉴定方法较费工费时费力，易受外界不稳定因素干扰而造成准确性的下降，急需一种能够快速准确的鉴定黄瓜抗蚜性的方法。
技术实现思路
1、发明目的：为了解决传统黄瓜抗蚜性筛选鉴定存在的费工费时费力及精准度不高的上述技术问题，本发明旨在提供一种黄瓜csapt3基因及其分子标记，利用该分子标记可以有效、快速筛选出黄瓜抗蚜虫品种，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。
2、本发明还提供了黄瓜csapt3基因的dna甲基化分子标记扩增引物对和应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种黄瓜csapt3基因，所述csapt3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本发明所述基于黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记的核苷酸序列如seqid no.2所示。
5、其中，用于扩增和检测所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记的引物对为：
6、上游引物：aaattttaggtatattgttttaggatatta；
7、下游引物：aaaccaaaaattaaaaaatttaaatac。
8、本发明所述黄瓜csapt3基因或所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或引物对的应用，包括如下任意一种或者多种：
9、(1)在检测黄瓜dna甲基化中的应用；
10、(2)选育或检测具有抗蚜虫黄瓜品种中的应用；
11、(3)在鉴定抗蚜虫黄瓜品种中的应用；
12、(4)在抗蚜虫黄瓜品种制种中的应用。
13、本发明所述黄瓜csapt3基因或所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或引物对在提升黄瓜抗蚜优良品种的选育速率中的应用。
14、进一步地，选育具有抗蚜虫黄瓜品种包括以下步骤：
15、s1、提取待测黄瓜基因组dna；
16、s2、亚硫酸盐转换dna后纯化；
17、s3、以纯化后的dna为模板，利用权利要求3所述引物进行pcr扩增；
18、s4、对扩增产物进行测序并分析数据，参照所述权利要求2所述分子标记选择csapt3基因甲基化水平低的植株，即为黄瓜抗蚜种质。
19、进一步地，所述步骤s2中亚硫酸盐转化的反应体系为：dna7-10μl、ct conversionmix 130-150μl，ddh2o 13-15μl；
20、扩增程序为：①98℃10min；②64℃40min；③98℃5min；④64℃40min；⑤98℃5min；⑥64℃40min；⑦4℃hold。
21、进一步地，所述步骤s3中pcr扩增体系为：亚硫酸盐修饰后的基因组dna 2-5μl、2×epiart hs taq master mix 25-30μl、正反向引物各2-3μl、ddh2o 19-20μl；
22、扩增程序为①95℃3min；②95℃15sec，50℃15sec，72℃2sec，33cycles；③72℃5min。
23、本发明所述黄瓜csapt3基因或所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或引物对在筛选甲基化程度低的个体作为育种亲本中的应用。
24、本发明所述黄瓜csapt3基因或所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或引物对在培育甲基化程度低的黄瓜种质中的应用。
25、本发明以感蚜黄瓜品种jy30以及抗蚜黄瓜品种bn32-7为样本，对其进行接虫处理，通过全基因组亚硫酸盐测序(wgbs)和转录组，并通过差异甲基化和差异表达分析分别得到了黄瓜蚜虫抗感品种的差异甲基化区域(dmr)、差异甲基化区域相关基因(dmrgene)、差异表达基因(deg)和差异甲基化相关的差异表达基因(dmr deg)，分析得到csapt3基因在黄瓜抗蚜材料bn32-7中为dmr deg，在黄瓜感蚜材料jy30中该基因未被诱导发生差异甲基化和差异表达，因此可以通过该基因来判断黄瓜种质的抗蚜性，进而确定了位于csapt3基因的dna甲基化分子标记csapt3。将黄瓜csapt3基因的dna甲基化分子标记csapt3应用于抗蚜程度不同的黄瓜种质的筛选，通过亚硫酸盐处理、分子标记csapt3的引物进行pcr扩增和sanger测序对抗蚜程度不同种质csapt3的dna甲基化水平的检测加以验证。
26、结果表明，黄瓜csapt3基因的dna甲基化分子标记csapt3的dna甲基化水平与黄瓜抗蚜性有关，不同种质黄瓜的抗蚜性与dna甲基化水平之间呈负相关，即dna甲基化水平越低，黄瓜的抗蚜性越高，同时本发明得到的结果与传统黄瓜抗蚜性鉴定方法所得结果相一致，证明本发明所提供的分子标记，能够应用于黄瓜抗蚜种质选育。
27、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
28、本发明开发了全新的黄瓜csapt3基因及其黄瓜dna甲基化分子标记，黄瓜蚜虫响应相关的基因csapt3的分子标记csapt3的dna甲基化水平与黄瓜抗蚜性有关，不同种质黄瓜的抗蚜性与dna甲基化水平之间呈负相关，即分子标记csapt3的dna甲基化水平越低，黄瓜的抗蚜性越高，因此这个分子标记在黄瓜抗蚜种质选育中具有巨大的应用前景，同时本发明设计了特定的用于扩增和检测的分子标记的引物对，其可以有效快速，筛选出黄瓜抗蚜优良品种，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。
29、本发明通过分子标记设计了针对csapt3基因分子标记csapt3的dna甲基化引物，可用于有效、准确、定量检测黄瓜csapt3基因分子标记csapt3的dna甲基化程度。本发明提供的黄瓜csapt3基因的dna甲基化分子标记可作为新型的表观遗传分子标记，为培育具有蚜虫抗性的黄瓜分子育种提供理论依据和遗传基础，同时应用于黄瓜抗蚜种质选育，能有效提升黄瓜抗蚜优良品种的选育速率。
1.一种黄瓜csapt3基因，其特征在于，所述csapt3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种基于黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种用于扩增和检测权利要求2所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对为：
4.一种权利要求1所述黄瓜csapt3基因或权利要求2所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或权利要求3的引物对的应用，特征在于，所述应用包括如下任意一种或者多种：
5.一种权利要求1所述黄瓜csapt3基因或权利要求2所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或权利要求3的引物对在提升黄瓜抗蚜优良品种的选育速率中的应用。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，选育具有抗蚜虫黄瓜品种包括以下步骤：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤s2中亚硫酸盐转化的反应体系为：dna7-10μl、ct conversion mix 130-150μl，ddh2o 13-15μl；
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤s3中pcr扩增体系为：亚硫酸盐修饰后的基因组dna2-5μl、2×epiart hs taq master mix 25-30μl、正反向引物各2-3μl、ddh2o 19-20μl；
9.一种权利要求1所述黄瓜csapt3基因或权利要求2所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或权利要求3的引物对在筛选甲基化程度低的个体作为育种亲本中的应用。
10.一种权利要求1所述黄瓜csapt3基因或权利要求2所述黄瓜csapt3基因的黄瓜dna甲基化分子标记或权利要求3的引物对在培育甲基化程度低的黄瓜种质中的应用。
