本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种对tnf-α具有结合亲和力的多肽及其用途。
背景技术：
1、tnf-α是一种具有广泛生物学活性的炎症细胞因子，主要由活化的巨噬细胞，单核细胞和t淋巴细胞产生，通过下游的tnfr1和tnfr2受体信号通路介导其生物学活性。人tnf-α前体(跨膜型，mtnf-α，26kda)由233个氨基酸组成，在tnf-α转化酶tace的作用下，切除信号肽，形成成熟的157个氨基酸残基的可溶性tnf-α(stnf-α，17kda)。除了以可溶形式起作用外，tnf-α还可以以跨膜型形式通过活化tnf-α受体以配体的形式起作用。
2、1998年，全球第一个tnf-α抑制剂英夫利昔单抗获批上市，开启了以tnf-α抑制剂为首的生物制剂治疗类风湿性关节炎(ra)，炎症性肠病等自身免疫相关疾病的时代。截止目前，国外已获批的tnf-α抑制剂(除去仿制药)共有5款，即英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、培塞利珠单抗(certolizumabpegol)和戈利木单抗(golimumab)。tnf-α抑制剂的使用给患者带来了良好的临床疗效，可有效阻断病情的进展，改善患者的生活质量和身体机能，但基于抗体的药物受到昂贵的生产成本而使其费用高昂。国内有调查显示，tnf-α抑制剂的使用率为9％，但其费用占ra患者年平均药费的49％(3975±17071元)。国外有研究显示，使用tnf-α抑制剂后，药物费用增长了数倍。因此，tnf-α抑制剂所带来的健康效益与其高昂的药物成本(包括药物成本和其他卫生资源利用成本)逐渐引起了人们的关注。另外，基于抗体大分子的靶向治疗仍然存在其应用的局限性，如渗透性差、具有较强的免疫性(抗药物抗体产生而大大降低其治疗效果)和毒副反应严重等有待进一步研究改善。因此，探索新型小分子tnf-α拮抗剂是非常有吸引力和极具应用前景的，并将会创造巨大的经济和社会效益。
3、川崎病(kd)是一种以幼儿为主的急性多系统血管炎性疾病，kd会引起心肌炎和血管炎，损害中小动脉，尤其是冠状动脉，导致动脉瘤的形成。动脉瘤的主要心血管后遗症包括冠状动脉狭窄、血栓形成、心肌缺血、心肌梗塞甚至死亡。尽管大剂量静脉注射免疫球蛋白(ivig)可有效降低冠状动脉瘤的发生，但大约15％-20％的kd患者对ivig抵抗并且这部分患者具有更高的冠状动脉瘤风险。不幸的是，目前除了ivig之外没有可用的治疗方法来阻止动脉壁损伤的进展并防止动脉瘤形成。
4、研究表明，在川崎病急性期炎症中一些炎症介质例如tnf-α明显升高，并且已证实其在诱发川崎病冠状动脉炎症和动脉瘤形成的过程中扮演着重要的角色。tnf-α能够通过促进nf-κb/p65的磷酸化和核移位，增加血管内皮细胞粘附因子icam-1、vcam-1和e-selectin的表达，进而诱导血液中活化的淋巴细胞、单核细胞及血小板向受损血管表面聚集，最终引起血管更深的免疫损伤。tnf-α还可以通过激活基质金属蛋白酶(mmp-9)进而导致弹性蛋白的破坏和血管壁动脉瘤的形成。因此，使用tnf-α拮抗剂可能是预防kd患者冠状动脉瘤形成的一种有效治疗策略，并且目前正处于临床试验中。
5、因此，迫切需要开发有效的治疗策略，例如小分子靶向制剂，以改善ivig耐药川崎病患者的临床结果。
6、affibody亲和体分子与抗体相比有着独特的优势，比如化学性质稳定、穿透性良好、可修饰性强、在血浆中易于清除等。因此，亲和体分子在临床诊断和分子靶向治疗中有着重要的作用。
7、因此，本领域对仍需继续以tnf-α为核心的亲和体分子筛选及其特性的研究。
技术实现思路
1、为有效对本发明的内容进行阐述，先对部分核心材料进行初步介绍：新型小分子材料例如非抗体亲和性蛋白affibody，作为新一代抗体，与靶分子的结合特征与抗体相似，但与抗体相比具有一些独特的优势，例如(i)低免疫原性，(ii)相对分子质量小，能够快速定位于作用部位，而从血液和非特异性迅速清除；并且由于affibody分子良好的组织穿透力，能够到达一些抗体分子所无法到达的靶部位(iii)稳定的物理和化学性质，和(iv)易于工程改造而不影响其生物学活性。affibody分子衍生自金黄色葡萄球菌蛋白a的免疫球蛋白g(igg)结合结构域，是新近开发的一类小的(58aa，6.5kda)稳健支架蛋白。可以随机突变igg结合结构域的三个α-螺旋区域中的十三个特定氨基酸以构建亲和体文库。之后研究人员将b段的第29位氨基酸甘氨酸突变为丙氨酸，增加了其结构的稳定性，从而称作为affibodyz结构域。金葡菌a蛋白z结构域(简称为zwt)由58个氨基酸组成，具有三个α螺旋结构，分子量约为7kda。在第一、第二螺旋区域上有13个特定的氨基酸位点，分别位于q9(谷氨酰胺)、q10(谷氨酰胺)、n11(天冬酰胺)、f13(苯丙氨酸)、y14(酪氨酸)、l17(亮氨酸)、h18(组氨酸)、e24(谷氨酸)、e25(谷氨酸)、r27(精氨酸)、n28(天冬酰胺)、q32(谷氨酰胺)、k35(赖氨酸)。蛋白骨架序列不变的情况下，这13个氨基酸位点的突变不会影响整体结构。通过将结构域z的α-螺旋受体的13个特定氨基酸行随机化设计，可以产生针对各种靶抗原的相应affibody分子。
2、通过噬菌体展示技术筛选能够特异性结合不同靶抗原的affibody。噬菌体展示技术筛选获得的affibody亲和体分子，与抗体相比具有比如化学性质稳定、穿透性良好、可修饰性强，在血浆中易于清除等特点。
3、本发明的目的是提供一种对tnf-α具有结合亲和力的多肽及其用途。
4、本发明的其一目的是提供一种对tnf-α具有结合亲和力的多肽，该多肽的序列如seq id no:2-4所示。
5、在本发明的另一方面，提供一种双特异性或多特异性抗体，其包含序列如seq idno:2-4所示的任一项所述的多肽。为产生所述双特异性或多特异性抗体，可以将本发明的多肽或其抗原结合片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
6、在一个优选例中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合tnf-α，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
7、在另一优选例中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。
8、在另一优选例中，所述的多肽通过柔性肽g3s与结合白蛋白的白蛋白结合结构域abd035相连。
9、在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的对tnf-α蛋白具有结合亲和力的多肽。
10、在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的双特异性或多特异性抗体。
11、在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。
12、在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。
13、在本发明的另一方面，提供一种缀合物，其包含任一项所述的多肽或任一项所述的双特异性或多特异性抗体以及偶联部分。
14、在一个优选例中，所述偶联部分选自蛋白标签，蛋白标签选自his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp中的一种或多种。
15、在另一优选例中，偶联部分选自可检测的标记，可检测的标记选自酶、放射性核素、荧光染料或生物素。
16、在另一优选例中，偶联部分选自治疗剂，所述治疗剂位抗炎药物或者免疫抑制剂。
17、在另一优选例中，偶联部分选自生物活性多肽。
18、在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：任一所述的对tnf-α蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的双特异性或多特异性抗体，或所述的分离的核酸分子，或所述的重组载体或所述的宿主细胞，或所述的缀合物；和药学上可接受的载体。
19、在本发明的另一方面，提供一种对tnf-α蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的双特异性或多特异性抗体，或所述的分离的核酸分子，或所述的重组载体或所述的宿主细胞，或所述的缀合物，或所述药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗与tnf-α有关的疾病；所述与tnf-α有关的疾病为自身免疫性疾病。
20、在一个优选例中，所述与tnf-α有关的疾病选自炎症性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊椎炎、银屑病关节炎、葡萄膜炎、血管炎。
21、在一个优选例中，所述与tnf-α有关的疾病选自川崎病血管炎。
22、在本发明的另一方面，提供一种对tnf-α蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的缀合物用于制备检测试剂的用途，所述检测试剂用于检测tnf-α在样品中的存在或其水平。
23、本发明的其它方面由于本技术的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
24、下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍
1.一种对tnf-α具有结合亲和力的多肽，其特征是：所述的对tnf-α具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如seq id no:2-4任一所示。
2.双特异性或多特异性抗体，其包含权利要求1任一项所述的多肽。
3.权利要求2所述的双特异性或多特异性抗体，其中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合tnf-α，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
4.权利要求2所述的双特异性或多特异性抗体，其中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。
5.权利要求2所述的双特异性或多特异性抗体，其中，所述双特异性抗体为：权利要求1任一项所述的多肽通过柔性肽g3s与结合白蛋白的白蛋白结合结构域abd035相连。
6.一种缀合物，其包含权利要求1任一项所述的多肽或权利要求2-5任一项所述的双特异性或多特异性抗体以及偶联部分，所述偶联部分选自蛋白标签，蛋白标签选自his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp中的一种或多种；或偶联部分选自可检测的标记，可检测的标记选自酶、放射性核素、荧光染料或生物素；或偶联部分选自治疗剂，所述治疗剂位抗炎药物或者免疫抑制剂；或偶联部分选自生物活性多肽。
7.一种药物组合物，其特征是：其包含：权利要求1任一所述的对tnf-α蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求2-5所述的双特异性或多特异性抗体或权利要求6所述的缀合物；和药学上可接受的载体。
8.权利要求1任一项的多肽、权利要求2-5任一项所述的双特异性或多特异性抗体、或权利要求6任一项所述的缀合物、或权利要求7任一项所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗与tnf-α有关的疾病；所述与tnf-α有关的疾病为自身免疫性疾病。
9.根据权利要求8所述的应用，所述与tnf-α有关的疾病选自炎症性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊椎炎、银屑病关节炎、葡萄膜炎、血管炎。
10.根据权利要求9所述的应用，所述与tnf-α有关的疾病选自川崎病血管炎。
