本发明涉及用于从核酸中降低内毒素水平或去除内毒素的方法。为此，在使用基于膜或单块的吸附剂进行核酸的阴离子交换色谱纯化期间添加某种类型的两性离子洗涤剂。
背景技术：
1、由于用于外源性表达或治疗性应用的重组dna的渐增的重要性，对用于从生物来源获得高纯度核酸(例如质粒dna)的快速和有效方法的需求在不断增加。特别地，对还可以以较大规模进行的纯化方法的需求也在增加。高纯度质粒dna的使用在诸如转基因的亚克隆、聚合酶链式反应(pcr)扩增、dna测序和体外mrna合成的各种应用中都是关键的。因此，以高产率和质量生成质粒dna的方案已得到认真关注。
2、用于纯化，特别是相对大量的核酸(例如质粒dna)的许多已知方法包括色谱纯化步骤。这个步骤的效率通常也决定了制造方法的效率和有效性。
3、纯化尤其是质粒dna的另一个问题是由将质粒dna与其分离的杂质引起的。这些首先是基因组dna和rna。纯化核酸时的另一种杂质是内毒素。内毒素是位于革兰氏阴性宿主细胞(例如大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(lps)。在细胞的裂解期间，除了质粒dna外，还释放了lps和其它膜组分。内毒素可以以每细胞约3.5x106个拷贝的数量存在于细胞中(escherichia coli and salmonella typhimurium cell.and mol.biology,j.l.ingraham等人编辑，1987，asm)，并且因此是质粒dna分子的数量的大于104倍。由于这个原因，从革兰氏阴性宿主细胞中获得的质粒dna通常含有大量的内毒素。然而，这些物质导致许多不期望的副反应(morrison和ryan，1987，ann.rev.med.38，417-432；boyle等人1998，dnaandcellbiology，17，343-348)。如果旨在将质粒dna用于基因疗法和疫苗，则极为重要的是，由于杂质引起的炎症性或坏死性副反应不发生。因此，对用于降低内毒素浓度到可能的最低水平的有效方法有很大的需求。
4、用于降低内毒素水平的已知方法基于多个纯化步骤，其经常使用阴离子交换色谱。
5、首先，通过已知方法例如碱裂解消化宿主细胞。其它裂解方法，例如使用高压、煮沸裂解、使用洗涤剂或通过溶菌酶消化，也是合适的。
6、以这种方式获得的介质，即“澄清的裂解物”中的质粒dna，主要被相对小的细胞组分、来自在先处理步骤的化学物质、rna、蛋白质和内毒素污染。去除这些杂质通常需要多个后续纯化步骤，其中阴离子交换色谱是一种可能。
7、阴离子交换色谱的缺点是相当大量的内毒素与质粒dna结合在一起，并且不能以这种方式充分分离。为了降低内毒素水平，因此另外的纯化步骤，例如色谱步骤(凝胶过滤)或用异丙醇、乙酸铵或聚乙二醇沉淀是必需的。组合色谱方法(例如阴离子交换色谱)和另外的内毒素去除步骤的纯化方法，使得能够获得内毒素含量低于50eu/mg质粒dna的质粒dna。然而，这种类型的方法通常是复杂的，耗时的，并且对于纯化相对大量的dna的合适性仅有限。
8、wo 95/21179描述了用于降低内毒素水平的方法，其中首先将澄清的裂解物与水性盐溶液和洗涤剂预孵育。接下来通过离子交换色谱进行纯化，其中用另外的盐溶液洗涤离子交换材料，并且洗脱质粒dna并随后例如通过异丙醇沉淀，进一步纯化。这种方法同样具有上述缺点。
9、us6617443公开了使用无盐洗涤剂溶液和其官能团键合至触手的吸附剂，从核酸制备物中去除内毒素的方法。
10、wo2009/129524公开了适合于小规模以平行格式纯化质粒dna的方案，使质粒dna与两性离子洗涤剂接触。
11、us6428703描述了通过使生物大分子与非离子洗涤剂接触并执行色谱纯化来纯化生物大分子的方法。
12、us2005/245733报告了使用碳水化合物非离子洗涤剂和硅胶色谱或有机聚合物树脂来减少质粒制备中的内毒素的方法。
13、所有这些文件都显示了从内毒素纯化质粒dna的方法。但尽管如此，对组合增强性能与高有效性的方法存在需求。
技术实现思路
1、生物制药和生物技术行业的下游方法通常依赖于基于珠的树脂在填充床柱中作为固定相的色谱步骤。树脂典型地具有在30和500μm之间的直径，并通常提供具有高结合容量的有效色谱技术。然而，该方法相当缓慢，并且代表了生物分子生产中的主要成本，因为溶质分子到树脂孔内的结合位点的输送受到颗粒内扩散的限制。即使在低流速下，柱上的压降也很高，并且在处理期间由于床层固结和柱体堵塞而增加。因此，在过去几十年中，已开发了几种其它创新的固定相(包括单块和膜)，作为对经典色谱载体的可能替代物。使用膜或单块的主要优点归因于短的扩散时间，因为分子和膜或单块中的活性位点之间的相互作用发生在对流通孔中，而不是在树脂孔内的停滞流体中。因此，膜和单块色谱具有在高流速和低压降下运作的潜力。
2、但如上述，基于膜或单块的色谱，以及由于缺乏孔扩散和较高流速的其它色谱，可显示出不同的色谱行为以及因此不同的分离特性。
3、已经发现，使用基于膜或单块的色谱基质进行核酸纯化时，结合使用选自氧化胺基团的两性离子洗涤剂，可以显著提高内毒素清除率，而不会影响核酸产率和宿主细胞蛋白质的去除。所选类型的洗涤剂与某些高生产率色谱膜或单块材料组合证明了特别有效。为所提出的解决方案提供的实施例表明，与基于珠基材料和常用的替代洗涤剂(例如tritontm x100)的现有方法相比，在强化大规模质粒制造方面具有独特的潜力。
4、因此，本发明涉及用于从核酸中耗尽或去除内毒素的方法，其包括：
5、a)提供包含所述核酸和内毒素的样品，
6、b)将步骤a)的样品在包含阴离子交换基团的膜或单块上进行色谱分离，
7、其中使样品与选自氧化胺的两性离子洗涤剂接触。
8、在优选的实施方案中，步骤b)包括
9、i)将包含所述核酸和内毒素的样品加载到包含阴离子交换基团的膜或者单块上，
10、ii)用洗涤缓冲液洗涤膜或单块，
11、iii)用洗脱缓冲液洗脱结合到膜或单块的核酸。
12、在一个实施方案中，通过在步骤ii)中用包含所述两性离子洗涤剂的洗涤缓冲液洗涤膜或单块，使核酸与两性离子洗涤剂接触。
13、在优选的实施方案中，两性离子洗涤剂是氧化胺。
14、在非常优选的实施方案中，它是n,n-二甲基十四烷基胺n-氧化物。
15、在优选的实施方案中，核酸包括质粒dna或由质粒dna组成。
16、在优选的实施方案中，使核酸与包含0.01-10％(w/v)的两性离子洗涤剂的溶液接触。
17、在优选的实施方案中，阴离子交换捕获材料是膜。在非常优选的实施方案中，所述膜是水凝胶膜。
18、在优选的实施方案中，步骤ii)包括两个或更多个洗涤步骤，其中一个洗涤步骤用包含乙醇的洗涤缓冲液完成。
19、在一个实施方案中，本发明的方法提供与其它方面相同但使用x100作为唯一的洗涤剂的方法相比，同样有效或更有效地耗尽内毒素的核酸。
20、定义
21、在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些可以变化。必须注意的是，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指称，除非上下文另外清楚规定。因此，例如，提及“一个/一种配体”包括多个/多种配体，以及提及“一个/一种抗体”包括多个/多种抗体等等。
22、除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。下述术语是为了如本文所述的本发明的目的而定义的。
23、可以根据本发明的方法通过耗尽或去除内毒素来纯化的核酸，也称为靶核酸，包括dna、rna和嵌合dna/rna分子，并且可以来自包括真核和原核细胞的任何生物来源，或者可以是合成的。可被纯化的核酸包括染色体dna片段、核糖体rna、mrna、snrna、trna、质粒dna、病毒rna或dna、合成寡核苷酸、核酶等等。特别感兴趣的是编码治疗性基因的质粒dna。“治疗性基因”旨在包括可在合适的宿主细胞中表达以补足宿主细胞中的缺陷性或低表达基因的功能性基因或基因片段，以及当表达时抑制或阻遏基因在宿主细胞中的功能的基因或基因片段，其包括例如反义序列、核酶、反式显性抑制剂等等。
24、因此，例如，病毒dna或rna可以从原核或真核病毒中纯化，其中病毒颗粒按照常规技术从允许病毒感染的培养物或细胞中，例如从细菌、昆虫、酵母、植物或哺乳动物细胞培养物中初始纯化。
25、术语“质粒dna”是指任何不同细胞来源的核酸实体，其不是宿主细胞的最初基因组的一部分或片段。如本文所用，术语“质粒”可指由dna或dna衍生物构成的环状或线性分子。术语“质粒dna”可以指单链或双链分子。质粒dna包括天然存在的质粒，以及编码感兴趣的基因的重组质粒，所述感兴趣的基因包括例如标记基因或治疗性基因。
26、典型地，质粒是具有对应于2.6x106-13.2x106道尔顿的分子量的4-20kb长度的基因组外(epigenomic)环状dna分子，其通常能够在生产细胞中自主复制。即使在它们的紧凑形式(超螺旋)中，质粒dna分子的尺寸通常也有几百nm。
27、如本文所用，并且除非另外说明，否则术语“样品”是指含有核酸的任何组合物或混合物。样品可以来源于生物或其它来源。生物来源包括真核和原核来源，例如植物和动物细胞、组织和器官。样品还可以包括被发现与靶分子混合的稀释剂、缓冲剂、洗涤剂和污染物类、碎片等等。样品可以是“部分纯化的”(即已经进行一个或多个纯化步骤，例如过滤步骤)，或者可以从产生核酸的宿主细胞或生物体中直接获得(例如，样品可以包括收获的细胞培养液)。
28、如本文所用的术语“杂质”或“污染物”是指可存在于样品中的任何外来或不良分子，其包括一种或多种宿主细胞蛋白质、内毒素、脂质和一种或多种添加物，所述样品含有要使用本发明的方法与一种或多种外来或不良分子分离的核酸。用本发明的方法耗尽或去除的一种污染物是内毒素。
29、如本文中可互换使用的术语“纯化”、“分离(separating)”或“分离(isolating)”是指增加来自包含靶核酸和一种或多种杂质的组合物或样品的靶核酸的纯度。典型地，通过从组合物中(完全或部分)去除至少内毒素来增加靶核酸的纯度。
30、术语“色谱”是指将感兴趣的分析物(例如靶核酸)与样品中存在的其它分子分离的任何种类的技术。通常，靶核酸与其它分子由于在移动相的影响下，混合物的单个分子与色谱基质结合和/或迁移穿过色谱基质的速率的差异而分离。
31、术语“批次”是指一定量的质粒或核酸材料，其旨在具有在规定的限度内的均匀特性和质量，并在具有确定的起点和终点的同一生产周期内根据单一生产订单进行生产。在连续过程的情况下，通常根据时间和/或体积策略定义批次。
32、术语“基质”或“色谱基质”在本文中可互换使用，并且指的是在色谱分离的过程中样品迁移穿过的固定相。典型地，基质包含基材和与基材共价结合的配体。本发明的基质包含膜、基于珠的树脂或单块或者由膜、基于珠的树脂或单块组成，优选基材是膜或单块，最优选为膜。
33、“配体”是作为色谱基质的一部分的官能团，典型地它附接于基质的基材上，并且决定基质的结合特性和相互作用特性。“配体”的实例包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(上述的组合)。一种配体具有超过一种结合/相互作用特性也是可能的。本发明的基质至少包含阴离子交换基团。这些可以是例如强阴离子交换基团，例如三甲基氯化铵，或弱阴离子交换基团，例如n,n二乙基氨基或deae。基质可以另外包括额外的其它类型的配体，使得基质是混合模式基质。这种配体可以例如具有疏水相互作用基团，例如苯基、丁基、丙基、己基。
34、配体可以通过任何类型的共价连接附接于基质的基材上。共价连接可以例如通过使官能团直接与基材上的合适残基键合来执行，所述残基例如oh、nh2、羧基、酚、酸酐、醛、环氧化物或硫醇等。还可经由合适的接头来附接配体。还可通过聚合包含配体和可聚合部分的单体来生成基质。通过合适的单体的聚合作用生成的基质的实例是通过聚合合适的苯乙烯或丙烯酰单体而生成的基于聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺或聚丙烯酰胺的基质。
35、在另一个实施方案中，固定相可以通过将配体接枝到基材上或由基材接枝配体来生成。对于来自具有受控自由基聚合作用的方法的接枝，例如原子转移自由基聚合作用(atrp)的方法是合适的。来自例如用离子、亲水或疏水基团官能化的丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等的聚合反应的非常优选的一步接枝，可以在含羟基的载体上由铈(iv)引发，而不需要载体被活化。
36、当色谱基质用于色谱分离时，它典型地在分离设备(也称为壳体)中使用，所述分离设备作为容纳基质的工具。
37、在一个实施方案中，所述设备包含具有入口和出口以及入口和出口之间的流体路径的壳体。在优选的实施方案中，所述设备是色谱柱。色谱柱是本领域技术人员已知的。它们典型地包含填充有固定相的圆柱形管或筒，以及过滤器和/或用于将固定相固定在管或筒中的工具，以及任选地用于将溶剂递送到管或筒和从管或筒递送溶剂的连接体。色谱柱的尺寸取决于诸如分析性或制备性等应用而变化。在一个实施方案中，柱或一般而言，分离设备是一次性使用设备。
38、因此，本文使用术语“阴离子交换基质”来指携带至少阴离子交换基团的色谱基质。这意味着它典型地具有一种或多种类型的配体，其在使用的色谱条件下带正电，例如季氨基团。
39、“缓冲液”是通过它的酸-碱共轭组分的作用来抵抗ph的变化的溶液。在buffers.aguide for the preparation and use of buffers in biological systems,gueffroy,d.编辑calbiochem corporation(1975)中，描述了根据例如缓冲液所需的ph可以使用的各种缓冲液。缓冲液的非限制性实例包括mes、mops、mopso、tris、hepes、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲液，以及这些的组合。
40、根据本发明，术语“缓冲液”或“溶剂”用于任何液体组合物，所述液体组合物用于加载、洗涤、洗脱、重新平衡、剥离和/或消毒色谱基质。
41、当以结合和洗脱模式“加载”色谱柱时，将包含靶分子和一种或多种杂质的样品或组合物加载到色谱柱上。在制备性色谱中，优选地将样品直接加载而不添加加载缓冲液。如果使用加载缓冲液，则缓冲液具有使得靶核酸结合固定相，同时理想地诸如内毒素等所有杂质不结合柱并流动穿过柱的组成、电导率和/或ph。典型地如果使用，加载缓冲液具有与用于制备柱以供加载的平衡缓冲液相同或相似的组成。
42、加载在柱上的样品的最终组合物被称为进料。进料可以包含样品和加载缓冲液，但优选地它仅为样品。
43、“洗涤(wash)”或“洗涤(washing)”色谱基质意为使适当的液体例如缓冲液，穿过基质或从基质上通过。典型地，洗涤用于在洗脱靶分子之前以结合/洗脱模式从基质中去除弱结合的污染物。另外地，洗涤步骤可用于降低残余洗涤剂的水平，提高病毒清除率和/或改变在洗脱期间的电导率遗留。
44、从基质中“洗脱”分子(例如靶核酸)意为从其中移出分子。洗脱可以通过改变溶液条件，使得不同于加载和/或洗涤缓冲液的缓冲液与感兴趣的分子竞争基质上的配体位点，或改变靶分子在固定相和流动相之间的平衡，使得有利于靶分子优先存在于洗脱缓冲液中而发生。
45、非限制性实例是通过改变离子交换材料周围的缓冲液的离子强度，使得缓冲液与分子竞争离子交换材料上的带电荷位点，从离子交换树脂上洗脱分子。
46、作为色谱基质的膜可以通过以下事实与基于颗粒的色谱区别开：诸如靶核酸或污染物等溶质与基质之间的相互作用不发生在颗粒的死端孔中，而是主要在膜的通孔中。示例性类型的膜是平片系统、膜的堆叠、掺入纤维素的微孔聚合物片、基于聚苯乙烯或二氧化硅的膜以及径向流筒、中空纤维模块和水凝胶膜。优选水凝胶膜。这种膜包含膜载体和在所述载体的孔内形成的水凝胶。膜载体为水凝胶提供机械强度。水凝胶决定了最终产品的特性，例如孔径和结合化学。
47、膜载体可以由诸如聚合物膜、基于陶瓷的膜和编织或非编织纤维材料等任何多孔膜组成。用于膜载体的合适的聚合物材料是纤维素或纤维素衍生物以及其它优选惰性聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸丁二酯或聚偏二氟乙烯。
48、水凝胶可以通过一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂和/或一种或多种可交联聚合物的原位反应，以形成具有优选大孔的交联凝胶而形成。合适的可聚合单体包括含有乙烯基或丙烯酰基的单体。优选的是包含另外的官能团的单体，所述官能团直接形成基质的配体或适于附接配体。合适的交联剂是含有至少两个乙烯基或丙烯酰基的化合物。关于合适的膜载体、单体、交联剂等以及合适的产生条件的进一步细节可以在wo04073843和wo2010/027955中找到。特别优选由惰性、柔性纤维网载体制成的膜，所述纤维网载体包含在纤维网载体内和其周围组装的具有季铵基团(强阴离子交换基团)的多孔聚丙烯酰胺水凝胶，所述膜例如q色谱膜，merck kgaa，德国。
49、取决于所使用的膜设备，各自的方法通过不同操作原理进行，所述操作原理例如死端操作、错流操作和径向流操作系统。优选死端操作。
50、用于本发明的方法中的合适的膜的实例是：
51、-具有基于聚醚砜(pes)的载体和交联聚合物涂层的膜，所述交联聚合物涂层用季铵基团(强阴离子交换基团)官能化，所述膜例如q，pall。
52、-由稳定的加强的纤维素制成的膜，所述纤维素用季铵基团(强阴离子交换基团)或用deae基团(二乙基氨基乙基，弱离子交换基团)官能化，所述膜例如膜，sartorius。
53、-由稳定的加强的纤维素制成的膜，其包含具有季铵基团(强阴离子交换基团)的水凝胶，所述膜例如由用季铵基团(强阴离子交换基团)官能化的稳定的加强的纤维素制成的jumbo膜，例如jumbo膜，sartorius。
54、-由细纤维非编织支架制成的膜，其包含具有季铵基团(强阴离子交换基团)的水凝胶，所述膜例如3mtmemphazetmaex hybrid purifier，3m。
55、-由惰性、柔性纤维网载体制成的膜，所述载体包含在纤维网载体内和周围的具有季铵基团(强阴离子交换基团)的多孔聚丙烯酰胺水凝胶，所述膜例如q色谱膜，merck kgaa，德国。
56、单块或者单块吸附剂，与膜相似，具有通孔，例如相互连接的通道，使得液体可以从单块的一侧，穿过单块，流到单块的另一侧。
57、由于流动相流动穿过这些通孔，待分离的分子通过对流而不是通过扩散来输送。由于它们的结构，单块吸附剂显示出不依赖流速的分离效率和动态容量。
58、单块典型地由反应物溶液原位形成并且可以具有任何形状或有限的几何形状，典型地具有无熔料构造，其保证了操作的便利性。优选地，单块材料具有二元多孔结构，即中孔和大孔。微米尺寸的大孔是通孔，并确保应用中的快速动态输送和低反压；中孔，优选位于通孔的壁中，有助于得到足够的表面积以及因此高加载容量。
59、单块可以由有机、无机或有机/无机杂合材料制成。优选基于有机聚合物的单块。
60、有机聚合物单块的合成典型地通过提供具有定制官能团的可调多孔结构的一步聚合作用来完成。通常，由合适比例的单体、交联剂、致孔溶剂和引发剂组成的聚合前混合物在合适的容器中聚合，所述容器也称为模具，其决定单块的形式。聚合作用典型地通过在引发剂的存在下加热，使用uv辐射、微波或γ射线辐射引发。在适当的温度下反应持续规定的时间后，所得材料典型地用溶剂洗涤以去除未反应的组分和致孔溶剂。
61、合适的有机聚合物是聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚氨酯等，例如聚(甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯)、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯)或聚(丙烯酰胺-乙烯基吡啶-n,n'-亚甲基双丙烯酰胺)。
62、无机单块可以由二氧化硅或其它无机氧化物制成。优选地，它们由二氧化硅制成。二氧化硅单块通常经由具有相分离的溶胶-凝胶方法来制备。这主要包括二氧化硅前体的水解、缩合和缩聚。典型地，在致孔剂(例如聚(乙二醇)(peg))的存在下四乙氧基硅烷(teos)或正硅酸四甲酯(tmos)分布于合适的溶剂中，接下来依次加入催化剂、酸或碱，或二元催化剂、酸和碱。反应持续规定的时间后，用溶剂洗涤得到的凝胶样产物，以去除未反应的前体、致孔剂和催化剂，接下来进行适当的后处理，典型地进行热处理。
63、单块也可通过3d打印制成。
64、可以用合适的官能团，优选至少离子交换基团，来修饰单块，以产生与包含靶分子的样品的靶向相互作用，并且因此产生靶向分离。
65、典型地，单块包含在诸如柱等壳体中。
66、意图用于液相色谱的基于颗粒的树脂通常包含在称为柱的管状圆筒中填充在一起以形成床的颗粒。填充床在颗粒之间显示出明显的空间，即所谓的空隙体积，它主要定义了填充床的液体流体渗透性和流体动力学特性。
67、所述颗粒通常由球形、珠状或颗粒状的交联聚合物基质组成，具有相对均匀的尺寸，以改善填充床的色谱和流体动力学特性。它们可以具有致密的结构，具有离散或非常小的孔隙，但通常表现出多孔多通道或网状结构，形成内部孔隙体积和颗粒内部的额外表面区域。颗粒表面区域可以通过使用用于主链聚合物结构的官能单体，将官能团直接或通过配体或短聚合物结构(接枝)偶联到颗粒表面，用适用于色谱应用的各种官能团来修饰。
68、两性离子洗涤剂是两性表面活性剂，具有非极性尾部和带有阴离子和阳离子带电原子基团的亲水头部。两性离子洗涤剂的净电荷和其它物理化学性质(粘度、溶解度、临界胶束形成)随着溶液ph的调节而变化。对于ph为等电点的溶液，表面活性剂分子上的负电荷与同一分子上的正电荷完全平衡，使洗涤剂分子的净电荷为零。
69、氧化胺被指定为两性离子洗涤剂。
70、氧化胺是具有式r1r2r3no的化合物，其中r1、r2和r3各自彼此独立地是任选取代的c1-c30烃链。
71、特别优选使用的氧化胺是r1是c10-c18烷基，并且r2和r3各自独立为c1-c4烷基的氧化胺，特别是c12-c16烷基二甲基氧化胺。
72、特别适合的氧化胺是n,n-二甲基十四烷基胺n-氧化物(tdao)，也称为肉豆蔻基二甲基胺-n-氧化物，cas号3332-27-2。
1.一种用于从核酸中耗尽或去除内毒素的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过用包含两性离子洗涤剂的洗涤缓冲液洗涤所述膜或单块，使所述核酸与所述两性离子洗涤剂接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述包含两性离子洗涤剂的洗涤缓冲液包含0.01％-10％(w/v)的所述两性离子洗涤剂。
5.根据权利要求1-4中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在本发明的方法中使用的两性离子洗涤剂是c12-c16烷基二甲基氧化胺。
6.根据权利要求1-5中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在本发明的方法中使用的氧化胺是n,n-二甲基十四烷基胺n-氧化物。
7.根据权利要求1-6中的一项或多项所述的方法，其特征在于，所述核酸包含质粒dna或由质粒dna组成。
8.根据权利要求1-7中的一项或多项所述的方法，其特征在于，使所述核酸与包含0.01-10％(w/v)的所述两性离子洗涤剂的溶液接触。
9.根据权利要求1-8中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中使用膜，优选水凝胶膜。
10.根据权利要求1-9中的一项或多项所述的方法，其特征在于，步骤ii)包括两个或更多个洗涤步骤，其中一个洗涤步骤用包含乙醇的洗涤缓冲液完成。
11.根据权利要求1-10中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中进行色谱分离的样品的体积为5-5000升，其具有范围为0.02-1.0mg/ml的质粒dna浓度。
12.根据权利要求1-10中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中进行色谱分离的核酸的质量对于一个批次在0.1gm至5kg的范围内。
13.根据权利要求1-12中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中每ml体积的包含阴离子交换基团的膜或单块加载1-20mg核酸。
14.根据权利要求1-13中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中以每分钟1-10个膜或单块体积的流速进行色谱分离。
