基于双色共定位的mda-mb-231细胞外泌体检测方法和应用
技术领域
1.本发明涉及免疫检测与荧光成像的领域，特别涉及一种基于双色共定位的外泌体检测方法和应用。
背景技术：2.有关癌症的检测方法，目前，临床常用的影像技术包括mri、超声、ct、活检等。但存在检查费用较高，辐射对身体有害等缺点，同时在早期无明显症状时，患者一般不会选择做这些检查，这就从某种程度导致了癌症早期治疗的缺失。与超声、mri、ct相比，荧光成像灵敏度高，选择性好。物质在吸收一定波长的激发光后由基态跃迁到激发态，后通过光化学过程返回基态时发射出比激发光波长长的光，即为荧光。荧光成像的发展依赖于成像探针的发展，迄今为止，已经开发了多种荧光探针，例如荧光蛋白、量子点和有机荧光染料。荧光免疫检测固然实用性和易用性较好，但是由于非特异性吸附，常常存在假阳性现象，对实验结果造成较大的影响。
3.全内反射荧光显微镜(tirf)技术采用的原理是当激发光在发生全反射时，仅能形成倏逝波点亮界面另一侧100-200nm深度内的荧光探针分子。因为倏逝波的能量随着离界面的距离的增大而呈指数下降，所以荧光信号被严格限定于全反射界面(一般是承载样品的玻片与样品之间的界面)附近。此荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度好的特点，可以用于检测含量较低的生物活性物质,例如蛋白质、激素等。
4.外泌体是一类直径在40-160nm之间的细胞外囊泡，其内容物包括dna和rna、脂质、代谢产物、胞质蛋白等，广泛存在于各种体液中，如血液、眼泪、尿液、唾液、脑脊液、母乳等。所有真核生物和原核生物在生理和病理状态下均可分泌外泌体以发挥细胞间通讯的作用，其内容反映了来自其亲本细胞的癌症微环境的重要信息，虽然外泌体的生物活性尚未完全了解，但越来越多的证据表明，外泌体通过调节肿瘤微环境参与肿瘤的迁移和侵袭，是肿瘤发展、进展和耐药的重要因素，作为液体活检的一部分，外泌体在癌症诊断和疗效监测方面具有巨大的潜力。
5.程序性死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1,pd-l1)作为适应性免疫系统中的一个关键的抑制性信号，在抗肿瘤、抗感染、器官存活等疾病治疗和器官移植领域具有重要意义。pd-l1表达水平与转移和癌症分期密切相关，目前pd-l1的疾病诊断和预后功能已在大量癌症患者及相关外泌体中得到验证。但由于其表达存在时间和空间异质性，并且其检测需要侵入性手段来获取肿瘤组织，造成了临床应用上的困难。
6.对外泌体进行定量分析，可以作为早期诊断、复发监测、耐药监测、患者病情检测的重要参考依据。使用双色共定位技术，可以很好地避免探针非特异性吸附所造成的假阳性结果，具有经济快速、灵敏度高等优点，能为深入研究肿瘤微环境中细胞间的微观免疫反应机制提供更直接的证据。
技术实现要素：7.本发明为了提升传统的癌症早期检测存在的精度和鲁棒性问题，提供了一种可特异性捕获mda-mb-231外泌体进行双色荧光共定位成像的方法，可用于定量检测所获外泌体样本以及减少识别探针的非特异性吸附所造成的假阳性结果。本发明还提供了双色荧光共定位成像的方法在免疫检测上的应用。
8.一种可特异性捕获mda-mb-231外泌体进行双色荧光共定位成像的方法，其特征在于，具体步骤如下：将经过差速离心获得的mda-mb-231外泌体固定在八孔板上，使用cm-dii标记外泌体膜，同时使用fam荧光基团的pd-l1核酸适配体特异性捕获外泌体，进行cm-dii和fam双色荧光共定位外泌体检测，只有两种荧光重合的位置才是外泌体，不重合的位置为非特异性结合位点。
9.作为本发明的一种改进，为避免tirf空间分辨率的限制，需制备单分散的外泌体样品，以便在单粒子水平进行荧光共定位分析，具体步骤如下：
10.(1)取一八孔板，将pei加入八孔板中，反应后用pbs冲洗，洗去多余的pei；
11.(2)将提取的外泌体溶液适当稀释，加入到步骤(1)得到的底部带正电聚合物的八孔板中，反应后通过静电吸附的原理将外泌体固定到八孔板上，之后用pbs冲洗；
12.(3)将bsa加入到步骤(2)所得的八孔板上，进行多余电荷封闭，反应后用pbs冲洗；
13.(4)将cm-dii细胞膜荧光探针加入到步骤(3)得到的八孔板中，反应后用pbs冲洗，即可得到膜染色的外泌体；
14.(5)将靶向pd-l1抗原的核酸适配体探针fam-pd-l1滴加在步骤(4)得到的八孔板上，反应后用pbs冲洗干净，即得到带有两种不同荧光分子的pd-l1高表达的外泌体的样本，用于双色共定位成像。
15.作为本发明的一种改进，步骤(1)中pei的质量浓度为1％。
16.作为本发明的一种改进，步骤(2)中的外泌体使用超高速冷冻型离心机对mda-mb-231肿瘤细胞的培养液进行提取得到的，外泌体提纯后分散在pbs中。
17.作为本发明的一种改进，步骤(3)中，bsa的质量浓度为1％(w/v)。
18.作为本发明的一种改进，步骤(4)中，核酸适配体探针fam-pd-l1的浓度为1nm。
19.根据权利要求上述的制备方法制得的可特异性捕获mda-mb-231外泌体进行双色荧光共定位成像的方法在免疫检测上的应用，具体步骤如下：
20.将制得的样品放于单分子定位显微镜下进行tirf荧光成像，收集495-575nm和570-650nm之间的荧光信号进行双色荧光共定位分析，同时能够检测到cm-dii和fam荧光信号的点才是有效的mda-mb-231外泌体。
21.作为本发明的一种改进，tirf荧光成像中激发光波长分别为488nm和561nm。
22.本发明所制备的外泌体检测方法可用于基于tirf技术的超分辨光学成像中，cm-dii和fam-pd-l1核酸适配体探针上的cm-dii和fam染料作为荧光基团，可用于tirf成像；他们的激发谱与发射谱彼此区分，可用于双通道同时成像。同时核酸适配体具有较强的靶向特性，可以高选择性得捕获pd-l1蛋白高表达的外泌体。利用tirf技术进行了双色荧光共定位的成像，可以在单粒子水平上对荧光共定位进行分析。
23.由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
24.本发明采用的荧光探针带有fam和cm-dii荧光基团，能进行较长时间的tirf荧光
显微成像。结合tirf双色荧光共定位技术，可以实现单粒子水平上的免疫检测的研究。同时双色荧光共定位技术为免疫检测提供了较好的准确性，及较高的灵敏度和鲁棒性。
附图说明
25.图1为tirf荧光共定位成像图(左：fam-pd-l1，中：cm-dii，右：双通道荧光合并)；
26.图2为一种可特异性捕获mda-mb-231外泌体进行双色荧光共定位成像的方法结构示意图。
具体实施方式
27.本实施例提供一种可特异性捕获mda-mb-231外泌体进行双色荧光共定位成像方法，具体步骤如下：将经过差速离心获得的mda-mb-231外泌体固定在八孔板上，用封闭液进行封闭，使用cm-dii标记外泌体膜，同时使用修饰fam荧光基团的pd-l1核酸适配体特异性捕获外泌体，进行cm-dii和fam双色荧光共定位外泌体检测，只有两种荧光重合的位置才是外泌体，不重合的位置为非特异性结合位点。
28.下面对本实施例作进一步的说明。
29.一、原料来源
30.1、pbs缓冲液为ph＝7.4，浓度为10mm的pbs缓冲液；
31.2、fam-pd-l1核酸适配体由生工生物工程(上海)公司合成；
32.3、bsa购自sigma公司；
33.4、cm-dii细胞膜探针购自翌圣生物科技(上海)公司。
34.5、其余材料均为市售所得。
35.二、双色荧光共定位外泌体样本的制备
36.实施例：
37.取一八孔板，将200μl稀释100倍的pei加入到八孔板中，pei是带正电的聚合物，反应15分钟后使用pbs冲洗三次，以洗去多余的pei。之后加入适当稀释后的外泌体溶液或者空白对照用的pbs溶液，所使用的外泌体溶液带负电，常温反应30分钟，pbs冲洗。即可得到通过静电吸附固定到八孔板上的外泌体样品。
38.将上述处理过的八孔板进行多余电荷封闭处理，加入1％的bsa常温封闭1小时，以减少探针和外泌体的非特异性吸附，pbs冲洗干净。然后将10μg/ml的cm-dii溶于400μl的pbs中，滴加到八孔板上，反应15分钟，pbs冲洗掉过量膜染料。即可得到膜染色的外泌体样品。
39.最后加入适量浓度为1nm的fam-pd-l1核酸适配体探针，37℃反应1h，pbs冲洗干净即可得到可用于双色荧光共定位的外泌体样本。
40.三、tirf成像
41.实施例：
42.上述双色共定位免疫检测平台在tirf荧光成像中的应用为：激发光波长分别为488nm和561nm，收集495-575nm和570-650nm之间的荧光信号进行双色荧光共定位分析。
技术特征：1.一种基于双色共定位的mda-mb-231细胞外泌体检测方法，其特征在于，具体步骤如下：将经过差速离心获得的mda-mb-231外泌体固定在八孔板上，使用cm-dii标记外泌体膜，同时使用fam荧光基团的pd-l1核酸适配体特异性捕获外泌体，进行cm-dii和fam双色荧光共定位外泌体检测，只有两种荧光重合的位置才是外泌体，不重合的位置为非特异性结合位点。2.权利要求1所述双色共定位的mda-mb-231细胞外泌体的制备方法，其特征在于，为避免tirf空间分辨率的限制，需制备单分散的外泌体样品，以便在单粒子水平进行荧光共定位分析，具体步骤如下：(1)取一八孔板，将pei加入八孔板中，反应后用pbs冲洗，洗去多余的pei；(2)将提取的外泌体溶液适当稀释，加入到步骤(1)得到的底部带正电聚合物的八孔板中，反应后通过静电吸附的原理将外泌体固定到八孔板上，之后用pbs冲洗；(3)将bsa加入到步骤(2)所得的八孔板上，进行多余电荷封闭，反应后用pbs冲洗；(4)将cm-dii细胞膜荧光探针加入到步骤(3)得到的八孔板中，反应后用pbs冲洗，即可得到膜染色的外泌体；(5)将靶向pd-l1抗原的核酸适配体探针fam-pd-l1滴加在步骤(4)得到的八孔板上，反应后用pbs冲洗干净，即得到带有两种不同荧光分子的pd-l1高表达的外泌体的样本，用于双色共定位成像。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中pei的质量浓度为1％。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的外泌体使用超高速冷冻型离心机对mda-mb-231肿瘤细胞的培养液进行提取得到的，外泌体提纯后分散在pbs中。5.根据权利要求2所述的制备方法基于双色共定位的mda-mb-231细胞外泌体检测方法，其特征在于：步骤(3)中，bsa的质量浓度为1％(w/v)。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，核酸适配体探针fam-pd-l1的浓度为1nm。7.基于权利要求2-6任一所述的制备方法制得的双色共定位的mda-mb-231细胞外泌体进行双色荧光共定位成像的方法在免疫检测上的应用，其特征在于，具体步骤如下：将制得的样品放于单分子定位显微镜下进行tirf荧光成像，收集495-575nm和570-650nm之间的荧光信号进行双色荧光共定位分析，同时能够检测到cm-dii和fam荧光信号的点才是有效的mda-mb-231外泌体。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，tirf荧光成像中激发光波长分别为488nm和561nm。
技术总结本发明公开了一种基于双色共定位的MDA-MB-231外泌体检测方法和应用，该检测方法通过细胞膜探针CM-DiI标记MDA-MB-231细胞外泌体；同时使用带有另一种荧光基团FAM的PD-L1核酸适配体探针，该探针能够特异性捕获PD-L1高表达的MDA-MB-231细胞分泌的外泌体；通过全内反射(TIRF)成像技术，即可对捕获的外泌体进行荧光成像；结合双色荧光共定位技术，可以在单粒子水平上判断假阳性事件，提高外泌体荧光免疫检测技术的准确性。检测技术的准确性。检测技术的准确性。
技术研发人员：宗慎飞 黄乐涵 孙腾霄 宗启航 石晓琦
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/7/5
