star及其调控基因的用途
技术领域
1.本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及star及其调控基因的 用途。
背景技术：2.卵巢发育情况复杂，其中某一阶段出现问题就可能引发相关疾病的产生，影 响生育与繁殖，且现阶段发生卵巢相关疾病的概率变大，探究影响卵巢卵泡生长 发育等方面的机制也是非常重要的。已有研究表明许多非编码rna如mirna 参与调控卵巢发育过程，影响动物的繁殖能力并与卵巢组织相关疾病有很大关系， 例如，mirna-124被证实参与卵巢分化，在雌性动物性腺中低的sox9水平与 性腺分化成卵巢有关，在性腺分化过程中mirna-124上调表达，靶sox9基因 表达下调。
3.非编码rna在开始被发现的一段时间内一直被认为是“转录噪音”，近年关 于非编码rna的研究逐渐增多，其功能也越来越多的被发现，例如lncrna、 microrna、trna、snorna等。已有研究发现lncrna虽然不具有编码蛋白质 的性质，但是能在转录和转录后水平影响基因发挥功能，其作为一类新的重要调 节因子广泛参与各种生理和病理过程。对卵母细胞分化和成熟、卵巢内各种细胞 发育、以及激素分泌和卵巢功能的发挥具有重要的调控作用。此外还与多囊卵巢 综合征(pcos)等卵巢发育相关疾病的产生和治疗有关，因此lncrna表达失 调常常导致多种疾病。
4.本技术选取中国本土湖羊品种为实验对象，采用rna-seq技术对卵巢组织中 的lncrna进行测序分析，比较1、3、8三个月龄的湖羊卵巢组织中lncrna的 差异表达情况，利用生物信息学方法筛选出各阶段差异表达的lncrna及其调控 基因，从而筛选出调控卵巢组织发育的lncrna及其调控基因，探索lncrna影 响卵巢发育的调控机制，为提高卵巢发育水平、增强繁殖能力和繁殖速度提供有 力依据。
技术实现要素：5.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供star在制备检测 卵巢发育水平试剂中的应用。
6.优选的，通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测star基因的表 达水平。
7.优选的，核酸扩增技术采用一对特异性引物扩增star基因；核酸杂交包括 与star基因的核酸序列杂交的探针。
8.优选的，通过免疫方法检测star基因表达产物的表达水平。
9.优选的，通过elisa检测试剂盒和/或胶体金检测试剂盒检测star基因达产 物的表达水平。
10.优选的，卵巢为羊卵巢。
11.一种与羊卵巢发育相关的lncrna，所述lncrna为mstrg.9543，序列与 seq id no.1具有90％以上序列同源性。
12.优选的，mstrg.9543序列与seq id no.1具有95％以上序列同源性；更 优选的，长链非编码rna序列为seq id no.1。
13.mstrg.9543用于制备检测卵巢发育水平试剂中的应用。
14.优选的，通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测mstrg.9543基 因的表达水平。
15.优选的，核酸扩增技术采用一对特异性引物扩增mstrg.9543基因；核酸杂 交包括与star基因的核酸序列杂交的探针。
16.一种检测羊卵巢发育的试剂，试剂包含用于核酸扩增的引物对，检测 mstrg.9543基因的表达水平。
17.优选的，用于核酸扩增的引物对序列为seq id no.2和seq id no.3。
18.优选的，试剂检测的样本为组织。
附图说明
19.图1为总rna琼脂糖凝胶电泳结果；
20.图2为卵巢组织差异表达mrna kegg pathway富集分析(h1vs h3)图；
21.图3为卵巢组织差异表达mrna kegg pathway富集分析(h3vs h8)图
22.图4为1月龄vs3月龄卵巢组织差异表达lncrna和mrna共表达网络图，三角形 节点代表lncrna，圆形节点代表mrna；
23.图5为3月龄vs8月龄卵巢组织差异表达lncrna和mrna共表达网络图，三角形 节点代表lncrna，圆形节点代表mrna；
24.图6为差异表达基因qrt-pcr验证结果图。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和 宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范 围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
26.实施例1样品的采集剂rna提取
27.1.1样品的采集
28.将三个月龄的羊屠宰后，将两侧的卵巢组织摘除，剪成小块组织样后迅速放 入冻存管中并投入液氮中保存，组织样温度维持低温后放入-80℃冰箱中保存， 整个过程保持无菌环境，所有器具消毒处理。试验设置为3组，采集1、3、8三 个月龄的湖羊卵巢组织，进行1月龄湖羊卵巢组织与3月龄湖羊卵巢组织(h1vsh3)、1月龄湖羊卵巢组织与8月龄湖羊卵巢组织(h3vs h8)差异的lncrna 和mrna的鉴定，每个组安排3个生物学重复。
29.1.2样本rna的提取和质量检测
30.每个样品分别取出等量的卵巢组织用来提取rna，保证无菌环境，并将得到 的所有rna在-80℃低温保存。
31.提取rna后，用nanodrop 2000紫外分光光度计对所提rna的纯度和浓度 进行检
测，在1.5％琼脂糖凝胶上监测rna降解和污染，尤其是dna污染，测 定rna的完整性。使用bioanalyzer 2100检测样品rna的质量情况，测定rin 值。建库测序的要求是rna总量不少于2ug，od260nm和od280nm两者比值 在1.9-2.1的范围内、rin》＝7且28s/18s》＝0.7，浓度≥100ng/μl，以确保使用 合格的样品进行转录组测序，同时满足以上条件的样品可以进行下一步实验。
32.结果如图1表示，可以看出28s和18s条带清晰可见，各个样品结果中rin ≥7、28s/18s≥1且od260/280两者比值在1.9-2.1的范围内，表明rna较完整， 污染较少，样品合格，符合测序要求。
33.实施例2测序及数据分析
34.构建cdna文库：建立9个cdna文库，分别为h1o1、h1o2、h1o3(1 月龄湖羊卵巢组织cdna文库)，h3o2、h3o3、h3o4(3月龄湖羊卵巢组织cdna 文库)，h8o1、h8o2、h8o3(8月龄湖羊卵巢组织cdna文库)。
35.文库质检合格后，可以进行上机测序。利用illuminahiseq平台进行对检测 合格的cdna文库进行测序，对下机之后的原始数据(raw data)进行分析。
36.预测lncrna：预测lncrna首先需要完成基本筛选，再检测是否具有潜在 编码能力，经过这两部分筛选后得到的是lncrna。首先筛选包含intergeniclncrna，intronic lncrna,sense-lncrna和anti-sense lncrna等不同类型的转录 本。预测得到的四种lncrna，鉴定得到37309个lncrna，通过与已知lncrna 数据库(lncrnadb，noncode等)比对，鉴定到样本中的已知lncrna 33924个， 其中lncrna数量最多，达23072条，占总lncrna数量的62.82％，3239个 antisense-lncrna，9139个intronic-lncrna和1859个sense-lncrna。
37.表达水平分析及差异表达基因筛选：对样品中的mapped reads的数目和转 录本长度进行归一化，采用fpkm法(fragments per kilobase of transcript permillion fragments mapped)作为衡量mrna和lncrna表达水平的指标，在差异 基因筛选过程中(h1vs h3、h3vs h8)，将fold change≥2且fdr《0.01作 为筛选标准。
38.1月龄湖羊卵巢基本未发育，3月龄湖羊卵巢未发育成熟，通过对两个阶段 (h1vs h3)的卵巢组织进行比较分析，将log2|fold change|≥2且fdr≤0.01 作为筛选标准。结果在1月龄和3月龄湖羊卵巢组织中共，筛选出6716个差异 表达的mrnas(3377个上调，3339个下调)和1972个差异lncrnas(1093个 上调，879个下调)。通过对3月(卵巢未发育成熟)、8月(卵巢发育成熟)龄 两个阶段的卵巢组织(h3vs h8)中表达的mrna和lncrna进行比对分析，经 过差异分析筛选出2903个差异表达mrnas(1736个上调，1167个下调)和636 个差异lncrnas(256个上调，380个下调)。
39.go注释(gene ontology)包括生物过程(bp)、分子功能(mf)和细胞成 分(cc)三个方面，可以描述基因或基因产物功能的特定方面。
40.通过对1月龄和3月龄湖羊卵巢组织差异mrna进行go富集，以p≤0.05 筛选显著富集的通路，并使用r语言画图，发现在生物学过程方面差异基因主 要富集在黄体酮代谢过程(progesterone metabolic process)、卵巢卵泡发育(ovarianfollicle development)、类固醇激素介导的信号通路(steroid hormone mediatedsignaling pathway)、生殖细胞发育(germ cell development)、调节类固醇激素的 生物合成过程(regulation of steroid hormone biosynthetic process)、对促性腺激素 反应
(response to gonadotropin)等条目；在分子功能方面，主要富集在生长因子 结合(growth factor binding)、胰岛素样生长因子受体结合(insulin-like growthfactor receptor binding)、雌激素受体结合(estrogen receptor binding)、细胞周期 蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(cyclin-dependent protein serine/threoninekinase activity)等条目；在细胞组分方面，主要富集在小核糖体亚基(smallribosomal subunit)、电压门控钙通道复合物(voltage-gated calcium channelcomplex)、线粒体膜部分(mitochondrial membrane part)等条目。
41.通过对3、8月龄差异表达的mrna进行go注释，发现在生物学过程方面， 差异基因主要富集在雌激素代谢过程(estrogen metabolic process)、卵巢卵泡排 卵(ovulation from ovarian follicle)、减数分裂i(meiosis i)、卵母细胞发育(oocytedevelopment)、卵子发生(oogenesis)、调节胰岛素样生长因子受体信号通路 (regulation of insulin-like growth factor receptor signaling pathway)、转化生长因 子β生产(transforming growth factor beta production)、排卵周期过程(ovulationcycle process)等条目；在分子功能方面，主要富集在转化生长因子β结合 (transforming growth factor beta binding)、胰岛素样生长因子结合(insulin-likegrowth factor binding)、雌二醇17-β-脱氢酶活性(estradiol 17-beta-dehydrogenaseactivity)、钙依赖性atp酶活性(calcium-dependent atpase activity)等条目；在 细胞组分方面，主要富集在高尔基体相关的囊泡膜(golgi-associated vesiclemembrane)、层粘连蛋白复合物(laminin complex)等条目。
42.kegg是通过生物信号途径对完全测序的基因组进行生物学解释的综合数 据库资源。对差异表达mrna进行通路分析，结果富集在卵巢类固醇生成 (ovarian steroidogenesis)、tgf-β信号通路、雌激素信号通路(estrogen signalingpathway)、mapk信号通路(mapk signaling pathway)、nf-κb信号通路 (nf-kappa b signaling pathway)等通路中，每个通路对应的差异基因数目如图 所示。
43.kegg通路富集分析表明，1、3月龄湖羊卵巢组织中差异表达mrna参与 到多个与卵巢卵泡发育相关的通路中，富集在这些通路中的mrna可能参与调 控湖羊两个阶段之间卵巢各部分的发育，以及影响性成熟等一系列现象的出现， 对于本研究中挖掘相关mrna的功能具有重要的指导意义，结果见图2。
44.对3、8月龄湖羊卵巢中差异表达的mrna进行kegg富集分析，如图3所 示，差异表达基因富集在细胞周期(cell cycle)、卵巢类固醇生成(ovariansteroidogenesis)、p53信号通路(p53signaling pathway)、孕酮介导的卵母细胞成 熟(progesterone-mediated oocyte maturation)、vegf信号通路(vegf signalingpathway)等信号通路，其中富集在卵巢类固醇生成通路的显著性值 q-value＝0.0092，且有11个基因富集在此通路中。孕酮介导的卵母细胞成熟通路 的q-value＝0.019，14个基因富集在此通路。通过kegg分析，发现差异mrna 富集在多个与卵母细胞成熟、类固醇激素生成等通路中。
45.组间差异表达lncrna靶基因预测：lncrna靶基因预测共有两种方式，一 种是基于位置关系的cis靶基因预测，另一种是基于表达量关系的trans靶基因预 测。lncrna能够调控其邻近基因的表达，主要根据lncrna和基因的位置预测， 在lncrna基因组位置上下游100kb范围内的mrna预测为cis作用靶基因即顺 式调控靶基因。通过分析lncrna和mrna的
表达量是否具有相关性来确定 lncrna靶向的远距离蛋白编码基因，即trans反式作用靶基因。采用pearson相 关系数法分析样本间lncrna与mrna的相关性，以相关性绝对值|pcc|≥0.9 和显著性p≤0.01为阈值筛选反式作用靶基因。
46.将差异mrna进行功能注释后，筛选出与卵巢发育相关通路的go条目，这 些条目中对应的差异mrna即可能参与卵巢生长过程的调节，也是研究卵巢发 育的关键基因。将差异表达lncrna的靶基因进行功能注释，并筛选差异lncrna 对应的差异靶基因，两者均差异表达。结合差异mrna和差异lncrna靶基因 功能注释结果，经过筛选发现几个与卵巢发育密切相关的基因差异表达，1月龄 和3月龄差异表达的基因参与camp信号通路、卵巢类固醇生成通路、tgf-β 信号通路、pi3k-akt信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟等通路和卵泡发育过 程，并筛选到有几个lncrna通过cis和trans调控作用靶向其中的一些基因，结 果如图4所示。3月龄和8月龄差异表达基因参与减数分裂i、卵母细胞发育、 卵子发生、胰岛素样生长因子结合等过程和胰岛素样生长因子受体信号通路、 jak-stat信号通路等途径，并筛选到几个lncrna通过cis和trans调控作用靶向 其中的一些基因，结果如图5所示。mstrg.9543及其调控的基因star成为我 们的候选基因，二者既参与了卵巢的生长过程(1月到3月)，又参与了卵巢的 成熟过程(3月到8月)。
47.实施例3qrt-pcr检测验证
48.3.1测序结果的可靠性验证
49.本实验在两个比较组(h1vs h3、h3vs h8)之间随机选择差异表达的lncrna 和mrna进行pcr检测，每个基因3个重复，验证每个lncrna和mrna的表 达趋势，主要方法如下：
50.反转录
51.将低温保存的rna样品取出，解冻后在pcr管中配置反转录体系。在体系中加 入以下试剂：
52.rna样品
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5μg
[0053]4×
gdna wiper mix
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
[0054]
nuclease-free h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5.5μl
[0055]
在42℃条件下反应2min，再加入5
×
hiscript ii q rt supermix iia，2μl，以上 共10μl。设置反应条件为25℃10min，50℃30min，85℃5min，全部完成后低 温-20℃保存备用。
[0056]
pcr反应设置
[0057]
pcr反应体系如下表，按步骤加入如下组分进行反应
[0058][0059]
表1 pcr体系中组分和体积
[0060][0061]
pcr数据分析及结果
[0062]
利用2
‑△△
ct
法计算所有基因在各个样本间的相对表达量，数据表示为平均数
ꢀ±
标准差(mean
±
sd)，p《0.05表示该基因在两组间差异显著。结果表明，star、 cyp11a1、fshr在3月龄卵巢中显著上调表达，mstrg.283534.2显著下调； 在8月龄卵巢组织中，fst、inhba、inha、mstrg.123289.5显著下调，star、 mstrg.77987.3在显著上调，说明与测序结果一致，测序结果可靠。
[0063]
表2. 1月龄和3月龄湖羊卵巢差异表达基因验证结果
[0064][0065]
表3 3月龄和8月龄湖羊卵巢差异表达基因验证结果
[0066]
[0067][0068]
3.2候选基因的验证
[0069]
本实验收集18只1月龄、18只3月龄、18只8月龄的湖羊，在两个比较组 (h1vs h3、h3vs h8)之间对差异表达的lncrna和mrna进行pcr检测， 每个基因3个重复，验证mstrg.9543及其调控的基因star差异表达情况， 实验步骤同3.1。
[0070]
pcr数据分析及结果，利用2
‑△△
ct
法计算mstrg.9543及基因star在各个 样本间的相对表达量，数据表示为平均数
±
标准差(mean
±
sd)，p《0.05表示该 基因在两组间差异显著。结果表明，相对于1月龄组，star在3月龄组卵巢中 显著上调表达，mstrg.9543显著上调表达。并且，相对于3月龄组，mstrg.9543 及基因star在8月龄卵巢组织中表现相同的趋势。
[0071][0072][0073]
star是急性调节阶段中不可缺少的成分，其介导细胞中胆固醇从线粒体的 外膜到内膜的转移，形成第一种类固醇，在性激素合成过程中发挥重要调节作用， 表明差异lncrna可能通过影响star介导卵巢激素合成。与1、3月龄相同， star基因在3、8月龄卵巢之间差异表达，表明star在整个卵巢发育中发挥 持续的调节作用，并受到lncrna的调节，对卵巢发育具有重要的作用。
