一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法
技术领域
1.本发明属于药物质量控制技术领域，特别涉及一种富马酸丙酚替诺福韦中 l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法。
背景技术：2.富马酸丙酚替诺福韦(tenofovir alafenamide fumarate)是抗乙肝病毒药物。在生产的过程中用到l-丙氨酸异丙酯盐酸盐作为起始物料。l-丙氨酸异丙酯响应较低，于210nm处有较大吸收，在末端吸收下易受其他杂质干扰，且l-丙氨酸异丙酯常用色谱条件下峰形较差，无法准确定量积分。因此，为了更好的控制产品质量，我们选择了针对l-丙氨酸异丙酯选择性较高的agilent eclipse xdb-c18 色谱柱进行分离，选择l-丙氨酸异丙酯的较强吸收波长210nm作为检测波长，并采用0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(ph8.0)-乙腈体系作为流动相，以梯度洗脱进行本品的l-丙氨酸异丙酯盐酸盐检测。
3.因此，发明一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法来解决上述问题很有必要。
技术实现要素：4.针对上述问题，本发明提供了一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种富马酸丙酚替诺福韦中 l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，包括以下步骤：
6.s1：配制富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂供试品，所述富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂与溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]配制为供试品溶液；
[0007]
s2：配制l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品溶液，称取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品，与溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]配制成l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品溶液；
[0008]
s3：测定方法，分析柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料，流动相a为0.02mol/l 磷酸二氢钾溶液(ph8.0)，流动相b为乙腈，进行线性洗脱，检测波长为210nm，柱温为30℃，流速1.3ml/ml；
[0009]
s4：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；
[0010]
s5：供试品溶液色谱图中l-丙氨酸异丙酯杂质峰，按外标法以峰面积计算含量。
[0011]
在上述检测方法中，所述富马酸丙酚替诺福韦供试品为富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂。
[0012]
在上述检测方法中，所述线性洗脱的条件为：0min，流动相a％：流动相b％为90:10；23min，流动相a％：流动相b％为20:80；23.1min，流动相a％：流动相b％为90:10；32min，流动相a％：流动相b％为90:10；流速1.3ml/min。
[0013]
通过上述的流动相方法，l-丙氨酸异丙酯杂质峰与其他杂质能够得到有效的分
离，满足质量检测的要求。
[0014]
进一步优选：流动相a为0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(ph8.0)，流动相b为乙腈，检测波长为210nm，柱温为30℃。
[0015]
采用了l-丙氨酸异丙酯吸收较强的210nm作为检测波长，可有效提高l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的检测灵敏度。
[0016]
进一步优选，所述分析柱为agilent eclipse xdb-c18 4.6*250mm 5μm。
[0017]
使用了选择性较高的agilent eclipse xdb-c18色谱柱进行分离，可将l-丙氨酸异丙酯与其他杂质很好分离，避免了干扰。
[0018]
进一步优选，上述杂质为l-丙氨酸异丙酯。
[0019]
进一步优选，供试品溶液色谱图中如有l-丙氨酸异丙酯杂质峰，按外标法以峰面积计算含量，富马酸丙酚替诺福韦原料药供试品溶液色谱图中如有l-丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.10％，富马酸丙酚替诺福韦片剂供试品溶液色谱图中如有l-丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.5％。
[0020]
进一步优选，取富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂适量，加溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]制成每1ml中约含富马酸丙酚替诺福韦20mg的溶液，作为供试品溶液。
[0021]
表1：富马酸丙酚替诺福韦和l-丙氨酸异丙酯盐酸盐信息表
[0022][0023]
(1)本发明富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的hplc测定方法，为满足供试品溶液检测浓度的需要，取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品适量，用溶剂配制成为每1ml中约含l-丙氨酸异丙酯0.02mg的溶液，作为对照品溶液。再分别用溶剂稀释制成一系列不同浓度的溶液，分别进样20μl，使之产生l-丙氨酸异丙酯为基线噪音至少3倍的信号。经试验，最小检测量为80ng(s/n≥3)，若以样品检查时富马酸丙酚替诺福韦的浓度每1ml约含20mg计算，其检出限度为0.02％。
[0024]
(2)本发明富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的hplc测定方法，取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取1ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。当对照品溶液浓度范围在 0.01～0.08mg/ml内时，峰面积与浓度呈良好的线性关
系，其线性方程为： y＝12.612x-0.004，相关系数为0.9999。
[0025]
(3)本发明富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的hplc测定方法，为满足供试品溶液检测浓度的需要，取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品适量，用溶剂配制成为每1ml中约含l-丙氨酸异丙酯0.02mg的溶液，作为对照品溶液。再分别用溶剂稀释制成一系列不同浓度的溶液，分别进样20μl，使之产生l-丙氨酸异丙酯为基线噪音至少10倍的信号，经试验，检测量约为200ng时，其s/n≥10，若以富马酸丙酚替诺福韦检查时的浓度20mg计算，其定量限约为0.05％水平。
[0026]
(4)本发明采用了选择性较高的agilent eclipse xdb-c18色谱柱进行分离，选择灵敏度较高的210nm的检测波长，并采用弱碱性的磷酸盐-乙腈体系使l-丙氨酸异丙酯色谱峰保持良好的峰形，以梯度洗脱进行本品中l-丙氨酸异丙酯的检测。
[0027]
本发明的技术效果和优点：
[0028]
1、本发明通过使用了选择性较高的agilent eclipse xdb-c18色谱柱进行分离，可将l-丙氨酸异丙酯与富马酸丙酚替诺福韦及其杂质很好分离，避免了干扰。当采用其他色谱柱如使用welch xtimate 4.6*250mm 3.5um柱时，l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质包裹无法分离，结果如图5所示。
[0029]
2、本发明通过采用了l-丙氨酸异丙酯较大吸收210nm作为检测波长，可提高l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的检测灵敏度。
[0030]
3、本发明通过采用弱碱性的磷酸盐(ph8.0)-乙腈体系可使l-丙氨酸异丙酯保持良好峰形，并以梯度洗脱程序进行本品的l-丙氨酸异丙酯检测，避免富马酸丙酚替诺福韦及其杂质残留，干扰l-丙氨酸异丙酯检测。当采用10mmol/l 六氟磷酸盐(ph6.5)-乙腈体系进行分离时，l-丙氨酸异丙酯的峰型和灵敏度均较差，典型图谱如图6所示。
[0031]
4、本发明通过采用流动相起始比例[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]作为溶剂溶解样品，可避免溶剂效应，使l-丙氨酸异丙酯保持良好峰形。当采用乙腈作为溶剂时会产生明显的溶剂效应，导致峰型变差，典型图谱如图7所示。
[0032]
5、本发明通过采用流速为1.3ml/min时(耐用性范围为1.2ml/min～1.4ml/min)，使l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离效果较好(rs大于 1.5)。当采用其他耐用性范围外的流速进行检测时分离效果较差(rs小于1.5)，典型图谱如图8所示。流速为1.2ml/min时系统适用性溶液中l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离结果良好，如图9所示。流速为1.3ml/min时系统适用性溶液中 l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离结果良好，如图10所示。流速为1.4ml/min 时系统适用性溶液中l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离结果良好，如图11所示。流速为1.5ml/min时系统适用性溶液中l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离度不符合要求。
[0033]
6、本发明检测方法准确、操作简捷，重现性好，灵敏度和专属性较好，可充分满足本品中l-丙氨酸异丙酯的检测，保证产品质量，在工作中实用性较强。
[0034]
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书和附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0035]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036]
图1示出了本发明实施例的f19004-46-20批(自研制剂)批0天供试品溶液的hplc色谱图；
[0037]
图2示出了本发明实施例的对照品溶液的hplc色谱图；
[0038]
图3示出了本发明实施例的l-丙氨酸异丙酯灵敏度溶液hplc色谱图；
[0039]
图4示出了本发明实施例的l-丙氨酸异丙酯的线性标准曲线图；
[0040]
图5示出了当采用其他色谱柱如使用welchxtimate4.6*250mm3.5um柱时，l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质包裹无法分离；
[0041]
图6示出了当采用10mmol/l六氟磷酸盐(ph6.5)-乙腈体系进行分离时，l-丙氨酸异丙酯的峰型和灵敏度均较差；
[0042]
图7示出了当采用乙腈作为溶剂时会产生明显的溶剂效应，导致峰型变差；
[0043]
图8示出了当采用其他耐用性范围外的流速进行检测时分离效果较差(rs小于1.5)；
[0044]
图9示出了流速为1.2ml/min时系统适用性溶液中l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离结果良好；
[0045]
图10示出了流速为1.3ml/min时系统适用性溶液中l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离结果良好；
[0046]
图11示出了流速为1.4ml/min时系统适用性溶液中l-丙氨酸异丙酯与相邻杂质的分离结果良好。
具体实施方式
[0047]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0048]
实施例1：
[0049]
1、色谱条件与系统适用性实验：
[0050]
1.1、色谱条件的选择：
[0051]
仪器：液相色谱仪：thermofisheru3000，dad或vwd检测器。
[0052]
富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐，在常规反相系统中保留适中，因此选择了封端效果较好的agilenteclipsexdb-c18，250mm
×
4.6mms-5μm色谱柱，采用磷酸盐溶液-乙腈体系作为流动相提高缓冲作用，以0.02mol/l磷酸二氢钾ph8.0溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行方法开发。l-丙氨酸异丙酯在210nm处有较大吸收，以此作为检测波长。柱温为30℃，流速为每分钟1.3ml，进样量为20μl，进样温度为4℃。梯度经过一系列的梯度程序优化：
[0053][0054]
在该色谱条件下，l-丙氨酸异丙酯保留适中，峰型较好，与其他杂质分离均符合要求。
[0055]
1.2、灵敏度测定
[0056]
取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品适量，用溶剂配制成浓度约为0.2mg/ml的溶液，再分别用溶剂稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样20μl，使之产生 l-丙氨酸异丙酯为基线噪音至少3倍的信号。经试验，最小检测量为80ng (s/n≥3)，若以样品检查时的浓度每1ml约含20mg计算，其检出限度为0.02％。结果证明，该方法灵敏度高，可以充分满足l-丙氨酸异丙酯检查的测定要求。
[0057]
1.3、溶液稳定性测定
[0058]
取同一份对照品溶液，于4℃进样盘中放置，于0、4、6、10.5、15、18.5、 21、23.5、26小时分别进样测定，考察l-丙氨酸异丙酯峰面积的变化，结果对照品溶液于4℃条件下放置，26小时内基本稳定。
[0059]
以上实验结果表明，本法操作简便灵敏，专属性和重现性好，可较好的控制富马酸丙酚替诺福韦的质量。
[0060]
2、原料药供试品溶液的制备：
[0061]
取本品约200mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]超声约5分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
[0062]
3、对照品溶液的制备：
[0063]
取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取1ml置10ml 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
[0064]
4、富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的检测
[0065]
精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，供试品中如有l-丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.10％。
[0066]
实施例2：
[0067]
富马酸丙酚替诺福韦原料药中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的测定：
[0068]
取富马酸丙酚替诺福韦原料药约200mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]超声约5分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液；取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取1ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2020版四部通则0512)测定，用十八烷基硅烷
键合硅胶为填充剂(推荐使用：agilent eclipse xdb-c18 4.6*250mm 5μm或效能相当的色谱柱)；以0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(称取磷酸二氢钾约2.72g，加水1000ml 使溶解，用10％氢氧化钾调节ph至8.0，过滤，超声脱气)为流动相a，以乙腈为流动相b，照下表进行线性梯度洗脱；流速为每分钟1.3ml；柱温为30℃；检测波长为210nm，进样温度为4℃。精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，供试品中如有l
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丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.10％。
[0069][0070]
表2富马酸丙酚替诺福韦原料药中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐测定结果
[0071]
[0072][0073]
实施例3：
[0074]
富马酸丙酚替诺福韦片剂中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的测定：
[0075]
取富马酸丙酚替诺福韦片8片，精密称定，置10ml量瓶中，加适量溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]超声约10分钟，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液；取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品约10mg，精密称定，置100ml 量瓶中，加溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈(90:10)]溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2020版四部通则0512)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐使用：agilent eclipse xdb-c18 4.6*250mm 5μm或效能相当的色谱柱)；以0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(称取磷酸二氢钾约 2.72g，加水1000ml使溶解，用10％氢氧化钾调节ph至8.0，过滤，超声脱气) 为流动相a，以乙腈为流动相b，照下表进行线性梯度洗脱；流速为每分钟1.3ml；柱温为30℃；检测波长为210nm，进样温度为4℃。精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，供试品中如有l-丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.5％。
[0076][0077]
表3富马酸丙酚替诺福韦片中l-丙氨酸异丙酯盐酸盐测定结果
[0078]
[0079][0080]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：1.一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，包括，其特征在于：包括以下步骤：s1：配制富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂供试品，所述富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂与溶剂配制为供试品溶液；s2：配制l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品溶液，称取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品，与溶剂配制成l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品溶液；s3：测定方法，分析柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料，流动相a为0.02mol/l磷酸二氢钾溶液（ph8.0），流动相b为乙腈，进行线性洗脱，检测波长为210nm，柱温为30
°
c，流速1.3ml/ml；s4：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；s5：供试品溶液色谱图中l-丙氨酸异丙酯杂质峰，按外标法以峰面积计算含量。2.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，其特征在于：所述步骤s1和s2中的溶剂为磷酸二氢钾溶液和乙腈，配比为90:10。3.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，其特征在于：所述步骤s1中的供试品为富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂。4.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，其特征在于：所述步骤s3中的线性洗脱的条件为：0min，流动相a%：流动相b%为90:10；23min，流动相a%：流动相b%为20:80；23.1min，流动相a%：流动相b%为90:10；32min，流动相a%：流动相b%为90:10；流速1.3ml/min。5.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，其特征在于：所述步骤s3中的分析柱为agilent eclipse xdb-c18 4.6*250mm 5μm。6.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，其特征在于：所述步骤s5中富马酸丙酚替诺福韦原料药供试品溶液色谱图中如有l-丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.10%，富马酸丙酚替诺福韦片剂供试品溶液色谱图中如有l-丙氨酸异丙酯峰，含量应不得大于0.5%。7.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中l-丙氨酸异丙酯的高效液相检测方法，其特征在于：所述步骤s1取富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂适量，加溶剂制成每1ml中约含富马酸丙酚替诺福韦20mg的溶液，作为供试品溶液。
技术总结本发明属于药物质量控制领域，具体涉及一种富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂中L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的高效液相检测方法，所述方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH8.0）为流动相A，乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱；检测波长为210nm；取富马酸丙酚替诺福韦原料药和片剂分别用溶剂[磷酸二氢钾溶液-乙腈（90:10）]配制供试品溶液，过滤进样，取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品与溶剂配制对照品溶液，进样分析，采用外标法进行计算，本检测方法克服了已知杂质的干扰，L-丙氨酸异丙酯峰形较差的缺点，操作简捷，灵敏度高，专属性好，可较好地控制产品质量。量。量。
技术研发人员：李静 陈文芝 孙利亚
受保护的技术使用者：南京百泽医药科技有限公司
技术研发日：2021.12.28
技术公布日：2022/7/4
