1.本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种微球冷冻切片及其制备方法和应用；尤其涉及一种使用冷冻包埋剂包埋载有牛血清白蛋白(bsa)的聚乳酸聚乙醇酸(plga)微球冷冻切片。
背景技术：2.聚乳酸聚乙醇酸(plga)微球由于具有安全无毒、可生物降解等优点，在药物缓控释领域得到了广泛的研究与应用。释药行为是评价微球制剂的重要指标之一，而微球的内部结构、药物分布等与其释药行为有密切的联系；因此，研究微球内部结构有助于探究其释药机理。
3.孔隙率是描述微球内部结构的一个重要参数，文献中常通过使用图像处理软件计算微球截面的扫描电镜图中孔洞总面积在整个截面面积中所占的比例来获得。微球截面的平整程度及孔洞的完整程度对孔隙率的计算影响极大。
4.然而，目前许多文献给出的扫描电镜图片中的微球截面存在平整度欠缺、孔洞变形等问题，不适宜用于孔隙率的计算；因此，摸索出一种微球截面平整、孔洞结构清晰完整的切片方法是非常有意义的。
技术实现要素：5.基于现有技术存在的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种聚乳酸聚乙醇酸微球冷冻切片的制备方法；本发明的第二目的在于提供该制备方法制备得到的微球冷冻切片；本发明的第三目的在于提供该微球冷冻切片在图像处理软件计算微球孔隙率中的应用。
6.本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
7.一方面，本发明提供一种微球冷冻切片的制备方法，其包括以下步骤：
8.将牛血清蛋白与致孔剂溶于泊咯沙姆188溶液中，得到内水相；
9.将内水相加入到含有聚乳酸聚乙醇酸的油相中搅拌形成初乳液；
10.将初乳液加入到外水相中搅拌形成复乳液，待复乳液固化后，离心收集并冷冻干燥得到微球；
11.将微球混悬于明胶-甘油包埋剂中浸泡处理，接着冷冻使包埋剂凝固，得到包埋块；
12.采用冷冻切片机对包埋块进行切片，得到微球冷冻切片。
13.本发明中，包埋剂在冷冻切片中主要对样品起支撑的作用，当包埋剂完全渗透进入微球内部，充满微球的孔洞时，切片过程中的微球的孔洞才不易发生形变，所以将微球在包埋剂中浸泡一定的时间是获得质量良好切片的必要条件；明胶所占比例越低，混合包埋剂的黏度也越低，渗透进入微球内部所需的时间就越短，形成的凝胶强度越弱，融变时限越短，展片时难度也越大。因此，本发明创造性地先将微球在明胶比例较低的包埋剂中浸泡一段时间，待包埋剂渗透进入微球内部之后再将微球转移至明胶比例较高的包埋剂中，这样
处理可以在缩短浸泡时间的同时降低展片难度。
14.上述的制备方法中，优选地，所述致孔剂包括氯化钠。
15.上述的制备方法中，优选地，所述含有聚乳酸聚乙醇酸的油相为聚乳酸聚乙醇酸的二氯甲烷溶液。
16.上述的制备方法中，优选地，所述外水相为聚乙烯醇溶液。
17.上述的制备方法中，优选地，所述明胶-甘油包埋剂的制备方法包括：
18.分别称取适量的明胶粉末及甘油，混合后于水浴加热并缓慢搅拌使其完全溶解，配制成明胶-甘油包埋剂。
19.上述的制备方法中，优选地，所述水浴加热的温度为37℃。
20.上述的制备方法中，优选地，所述明胶-甘油包埋剂包括质量浓度为10％明胶+5％甘油的混合水溶液、20％明胶+5％甘油的混合水溶液或30％明胶+5％甘油的混合水溶液。
21.本发明所采用的明胶-甘油混合冷冻包埋剂的原料简单易得，配制方法简单，且形成的凝胶在室温下能保持固态，与市售oct冷冻包埋剂比较，具有价格低廉、不易碎片卷片等优点。
22.上述的制备方法中，优选地，进行包埋微球时，所述微球与所述明胶-甘油包埋剂的用量比为10mg：1.5ml。
23.上述的制备方法中，优选地，进行冷冻凝固的温度为-20℃。
24.上述的制备方法中，优选地，浸泡处理的时间为5h。
25.上述的制备方法中，优选地，采用冷冻切片机对包埋块进行切片的温度为-40℃。
26.上述的制备方法中，优选地，对包埋块进行冷冻切片前还包括对包埋块进行预处理的步骤，具备包括：
27.将包埋块放置在涂有少量oct冷冻包埋剂的组织托上，放入冷冻切片机内的冷冻台上，至oct冷冻包埋剂发白及包埋块变硬；
28.接着将上述固定有包埋块的组织托放入液氮中急速冷冻5min。
29.本发明中，切片前将包埋块浸入液氮速冻处理可以使微球的质地变得硬脆，从而更易获得截面平整、孔洞结构完整清晰的微球切片；但要注意避免过冻，将包埋块浸入液氮中5min后即可取出，时间太长会导致包埋块脆裂，或与组织托分离；取出后不宜立即切片，因液氮温度太低使包埋块硬度过高，易损坏刀口，且切片容易碎裂，需放在冷冻台上稍等片刻后再进行切片。
30.另一方面，本发明还提供上述的制备方法制备得到的微球冷冻切片；该微球冷冻切片的厚度为10μm。
31.再一方面，本发明还提供上述的微球冷冻切片在图像处理软件计算微球孔隙率中的应用。
32.本发明的有益效果：
33.(1)本发明的方法中所用的明胶-甘油混合冷冻包埋剂的原料简单易得，配制方法简单，且形成的凝胶在室温下能保持固态，与市售oct冷冻包埋剂比较，具有价格低廉、不易碎片卷片等优点。
34.(2)本发明创造性地先将微球在明胶比例较低的包埋剂中浸泡一段时间，待包埋剂渗透进入微球内部之后再将微球转移至明胶比例较高的包埋剂中，这样处理可以在缩短
浸泡时间的同时降低展片难度。
35.(3)本发明的方法具有简单快速、无需整修包埋块、耗材价格低廉、不易碎片、展片容易等特点，且制备所得的微球截面平整、孔洞结构清晰，适宜用于扫描电镜的观察，能够用于图像处理软件计算微球孔隙率；本发明的微球冷冻切片也为其他材料制备的微球及聚合物多孔支架等的切片技术提供了参考。
附图说明：
36.为了更清楚的说明本发明实施例或现有的技术中的技术方案，下面将对实施例或者现有技术描述中有关于本发明需要图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1为本发明实施例1制备的微球冷冻切片与对比例1制备的微球冷冻切片的扫描电镜对比图(图1a为oct包埋；图1b为oct包埋后清洗；图1c为20％明胶+5％甘油的混合水溶液包埋)。
38.图2为本发明实施例1制备的微球冷冻切片与对比例2制备的微球冷冻切片的扫描电镜对比图(图2a为对比例2不经液氮急速冷冻处理；图2b为实施例1经液氮急速冷冻处理)。
39.图3为本发明实施例1制备的微球冷冻切片与对比例3、对比例4和对比例5制备的微球冷冻切片的扫描电镜对比图(图3a为浸泡0h；图3b为浸泡1h；图3c为浸泡3h；图3d为浸泡5h；线圈中为孔洞发生形变的部分)。
40.图4为本发明实施例1制备的微球冷冻切片与对比例6、对比例7、对比例8、对比例9和对比例10制备的微球冷冻切片的扫描电镜对比图(图4a1为10％明胶+5％甘油浸泡3h、图4a2为10％明胶+5％甘油浸泡5h、图4b1为20％明胶+5％甘油浸泡3h、图4b2为20％明胶+5％甘油浸泡5h；图4c1为30％明胶+5％甘油浸泡3h、图4c2为30％明胶+5％甘油浸泡5h)。
具体实施方式
41.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本发明各权利要求所要求保护的技术方案。本发明下述实施例中所采用的原料若无特殊说明，均为常规市售获得，所采用的实验操作若无特殊说明，均为本领域常规操作。
42.实施例1：
43.本实施例提供一种聚乳酸聚乙醇酸微球冷冻切片及其制备方法，该微球冷冻切片的制备方法包括以下步骤：
44.(1)微球的制备：
45.将牛血清蛋白与氯化钠溶于一定浓度的泊咯沙姆188溶液中，得到内水相。将内水相加入到聚乳酸聚乙醇酸的二氯甲烷溶液中，低温条件下高速搅拌，形成初乳液。将初乳加入到聚乙烯醇溶液中搅拌10min，形成复乳液。将复乳转移至装有聚乙烯醇溶液的大烧杯中
缓慢搅拌使微球固化，离心收集，用水洗涤3次后冷冻干燥，制备得到微球。
46.(2)明胶-甘油包埋剂的制备：
47.分别称取适量的明胶粉末及甘油，混合后于37℃水浴加热并缓慢搅拌使其完全溶解，配制成质量浓度为20％明胶+5％甘油的混合水溶液，作为冷冻包埋剂。
48.(3)冷冻包埋剂包埋微球：
49.称取干燥的微球10mg，置于1.5ml的尖底离心管中，然后加入37℃呈液态的明胶-甘油包埋剂0.5ml，使微球混悬于其中，并于37℃浸泡5h后，迅速转移至-20℃的冰箱中使包埋剂凝固。
50.(4)包埋块的固定及切片前处理：
51.将包埋块从离心管中取出，放置在涂有少量oct的组织托上，放入冷冻切片机内的冷冻台上，至oct发白及包埋块变硬。在考察速冻处理的影响因素时，将上述固定有包埋块的组织托放入液氮中急速冷冻5min，取出，再进行切片操作。
52.(5)微球冷冻切片的制备：
53.使用冷冻切片机进行切片，切片温度为-40℃，获得切片厚度为10μm的微球冷冻切片。
54.对比例1：
55.本对比例采用实施例1中所采用的冷冻包埋剂，分别与oct包埋剂进行对比实验，考察冷冻包埋剂的种类对微球切片质量的影响。
56.选取该种包埋剂及oct分别对微球进行包埋，浸泡时间为0h，按照实施例1的方法对包埋块进行固定，冷冻切片。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图1a、图1b和图1c所示。
57.结果表明：与20％明胶+5％甘油的混合水溶液相比，oct制作的切片更容易出现碎裂，展片时更容易卷片；由于oct在室温下会融化，将切片直接展片至电镜载样台时，截面中的部分孔洞会被融化的包埋剂覆盖，影响sem下的观测效果(见图1a)；为避免oct包埋剂对切片的污染，将刚制得的切片收集，水洗除去包埋剂，干燥后转移至电镜载样台，观察发现有部分微球切片发生卷曲变形(见图1b)；而20％明胶+5％甘油的混合水溶液在室温下能保持固态，可使微球截面正面朝上贴附在电镜载样台上(见图1c)。
58.对比例2：
59.本对比例提供一种不采用液氮急速冷冻制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(4)包埋块的固定及切片前处理中，不采用液氮急速冷冻的步骤。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图2a和图2b所示。
60.结果表明：对比例2中不经液氮急速冷冻直接切片所得的微球截面不平整，大部分孔洞严重变形(见图2a)；而实施例1中采用液氮急速冷冻处理后再进行切片所得的微球截面孔洞的形变程度明显降低(见图2b)。
61.对比例3：
62.本对比例考察浸泡时间对微球切片质量的影响，提供一种不同浸泡时间制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(3)冷冻包埋剂包埋微球中，微球浸泡于包埋剂中的浸泡时间为0h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图3a所示。
63.对比例4：
64.本对比例考察浸泡时间对微球切片质量的影响，提供一种不同浸泡时间制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(3)冷冻包埋剂包埋微球中，微球浸泡于包埋剂中的浸泡时间为1h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图3b所示。
65.对比例5：
66.本对比例考察浸泡时间对微球切片质量的影响，提供一种不同浸泡时间制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(3)冷冻包埋剂包埋微球中，微球浸泡于包埋剂中的浸泡时间为3h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图3c所示。
67.此外，实施例1的浸泡时间为5h，其扫描电镜图如图3d所示。
68.结果表明：对比例3的0h组(即将微球与包埋剂混匀后立即-20℃冷冻使包埋剂凝固)，微球内部大量孔洞会出现形变(见图3a)；对比例4浸泡1h组，微球中部的孔洞发生形变，周边部分孔洞较为平整(见图3b)；对比例5浸泡3h组，孔洞发生形变的面积进一步减小(见图3c)；实施例1延长浸泡时间至5h，孔洞均能保持圆整，基本无形变，切片质量明显提高(见图3d)。
69.对比例6：
70.本对比例提供一种不同明胶-甘油比例的冷冻包埋剂制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(2)明胶-甘油包埋剂的制备中，配制成质量浓度为20％明胶+5％甘油的混合水溶液，浸泡时间为3h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图4a1所示。
71.对比例7：
72.本对比例提供一种不同明胶-甘油比例的冷冻包埋剂制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(2)明胶-甘油包埋剂的制备中，配制成质量浓度为20％明胶+5％甘油的混合水溶液，浸泡时间为5h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图4a2所示。
73.对比例8：
74.本对比例提供一种不同明胶-甘油比例的冷冻包埋剂制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(2)明胶-甘油包埋剂的制备中，配制成质量浓度为20％明胶+5％甘油的混合水溶液，浸泡时间为3h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图4b1所示；实施例1的为图4b2所示。
75.对比例9：
76.本对比例提供一种不同明胶-甘油比例的冷冻包埋剂制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(2)明胶-甘油包埋剂的制备中，配制成质量浓度为30％明胶+5％甘油的混合水溶液，浸泡时间为3h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图4c1所示。
77.对比例10：
78.本对比例提供一种不同明胶-甘油比例的冷冻包埋剂制备的微球冷冻切片。其制备过程同实施例1，区别在于：在步骤(2)明胶-甘油包埋剂的制备中，配制成质量浓度为
30％明胶+5％甘油的混合水溶液，浸泡时间为5h。采用扫描电子显微镜对切片进行纤维观察，实验结果如图4c2所示。
79.结果表明：当浸泡时间为3h时，明胶-甘油包埋剂中明胶的比例越小，微球切片中孔洞形变的面积越小(见图4的a1、b1、c1)；延长浸泡时间至5h时，10％明胶+5％甘油和20％明胶+5％甘油制备的切片中微球孔洞基本无形变，30％明胶+5％甘油制备的切片中微球孔洞仍有小部分发生形变(见图4的a2、b2、c2)。同时，冷冻切片的过程中发现：10％明胶+5％甘油比其他2种明胶-甘油冷冻包埋剂制备的切片的凝胶强度小，展片难度更大；当包埋剂完全渗透进入微球内部时，切片过程中微球的孔洞才不易发生形变，使用20％明胶+5％甘油作为冷冻包埋剂，可以兼顾缩短浸泡时间及降低展片难度两方面的要求。
80.最后，需要说明的是，本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
技术特征：1.一种微球冷冻切片的制备方法，其包括以下步骤：将牛血清蛋白与致孔剂溶于泊咯沙姆188溶液中，得到内水相；将内水相加入到含有聚乳酸聚乙醇酸的油相中搅拌形成初乳液；将初乳液加入到外水相中搅拌形成复乳液，待复乳液固化后，离心收集并冷冻干燥得到微球；将微球混悬于明胶-甘油包埋剂中浸泡处理，接着冷冻使包埋剂凝固，得到包埋块；采用冷冻切片机对包埋块进行切片，得到微球冷冻切片。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述致孔剂包括氯化钠。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述含有聚乳酸聚乙醇酸的油相为聚乳酸聚乙醇酸的二氯甲烷溶液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述外水相为聚乙烯醇溶液。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述明胶-甘油包埋剂的制备方法包括：分别称取适量的明胶粉末及甘油，混合后于水浴加热并缓慢搅拌使其完全溶解，配制成明胶-甘油包埋剂；优选地，所述水浴加热的温度为37℃。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述明胶-甘油包埋剂包括质量浓度为10％明胶+5％甘油的混合水溶液、20％明胶+5％甘油的混合水溶液或30％明胶+5％甘油的混合水溶液；优选地，进行包埋微球时，所述微球与所述明胶-甘油包埋剂的用量比为10mg：1.5ml；优选地，进行冷冻凝固的温度为-20℃；优选地，浸泡处理的时间为5h。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：采用冷冻切片机对包埋块进行切片的温度为-40℃。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：对包埋块进行冷冻切片前还包括对包埋块进行预处理的步骤，具备包括：将包埋块放置在涂有少量oct冷冻包埋剂的组织托上，放入冷冻切片机内的冷冻台上，至oct冷冻包埋剂发白及包埋块变硬；接着将上述固定有包埋块的组织托放入液氮中急速冷冻5min。9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的微球冷冻切片；优选地，所述微球冷冻切片的厚度为10μm。10.权利要求9所述的微球冷冻切片在图像处理软件计算微球孔隙率中的应用。
技术总结本发明提供一种微球冷冻切片及其制备方法和应用。该微球冷冻切片的制备方法包括：将牛血清蛋白与致孔剂溶于泊咯沙姆188溶液中得到内水相；将其加入到含有聚乳酸聚乙醇酸的油相中搅拌形成初乳液；然后加入到外水相中搅拌形成复乳液，固化后离心收集并冷冻干燥得到微球；然后混悬于明胶-甘油包埋剂中浸泡处理，冷冻凝固得到包埋块；将其切片得到微球冷冻切片。本发明方法具有简单快速、无需整修包埋块、耗材价格低廉、不易碎片、展片容易等特点，且制备所得的微球截面平整、孔洞结构清晰，适宜用于扫描电镜的观察，能够用于图像处理软件计算微球孔隙率；本发明的微球冷冻切片也为其他材料制备的微球及聚合物多孔支架等的切片技术提供了参考。提供了参考。提供了参考。
技术研发人员：王守立 彭金玉 吴月
受保护的技术使用者：苏州堪赛尔医学检验有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2022/7/4
