检测hiv-1整合酶基因突变的引物组及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种检测hiv-1病毒整合酶基因突变的引物组及其应用。
背景技术：2.人类免疫缺陷病毒(hiv-1)又称艾滋病病毒，是导致人罹患艾滋病的病原体。在感染人体后，人类免疫缺陷病毒会选择性的攻击人体免疫系统中最重要的cd4 t淋巴细胞，并大量破坏该细胞，最终会严重破坏人体正常的免疫功能。在hiv-1感染的晚期，艾滋病病毒感染会引起各种机会性感染和肿瘤的发生，这些并发症会对人的健康生活带来影响，甚至可能会威胁生命。联合国艾滋病规划署(unaids)2021年发布的数据，2020年，全球约有3770万现存艾滋病病毒感染者，其中约1020万人未接受治疗，约150万人为当年新感染者，当年约有68万人死于艾滋病。根据中国国家卫生健康委的数据显示，截至2021年10月底，我国报告的现存艾滋病感染者104.5万例，总体疫情仍处于低流行水平，但由于传播影响因素更加复杂，防治形势依然严峻，已成为严重威胁我国公众健康的重要公共卫生问题。
3.在病毒感染后采取抗病毒治疗可以降低hiv-1感染的发病率和病死率、减少非艾滋病相关疾病的发病率和病死率，使患者获得正常的期望寿命，提高生活质量，最大程度地抑制病毒复制，使病毒载量降低至检测下限并减少病毒变异，重建或者改善免疫功能，减少异常的免疫激活，减少hiv-1的传播，预防母婴传播。
4.国内的抗反转录病毒治疗药物有五大类，分别为核苷类反转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitors,nrtis)、非核苷类反转录酶抑制剂(non-nrtis,nnrtis)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors,pis)、整合酶链转移抑制剂(integrase strand transfer inhibitors,instis)、膜融合抑制剂(fusion inhibitors,fis)。依据2021年版《中国艾滋病诊疗指南》，目前推荐的一线治疗方案为两种nrtis类骨干药物联合第三类药物治疗，第三类药物可以为nnrtis或者增强型pis(含利托那韦或考比司他)或者instis，有条件的患者可以选用复方单片制剂。
5.目前美国fda批准了两项hiv-1耐药检测方法，雅培viroseq
tm
基因型耐药检测系统和卫拉诊断(vela diagnositics)的基因检测hiv-1基因分型检测。中国批准了两项基因型耐药检测方法，雅培viroseq
tm
基因型耐药检测系统(注册证编号：国械注进20173405224)和达安基因(hiv-1)耐药基因型检测(注册证编号：国械注准20153401697)。在取得注册认证的这几个产品当中，雅培和达安基因的产品检测基本原理类似，用于定性检测临床血浆样本中的人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)基因组蛋白酶(pr)区和逆转录酶(rt)区的耐药突变。卫拉诊断的基因型耐药检测同时检测蛋白酶、逆转录酶和整合酶(in)区域的耐药突变。中国国内尚未有检测整合酶耐药突变的体外诊断检测产品。
6.自2009年开始，国家药品监督管理局陆续审评通过了拉替拉韦、多替拉韦、绥美凯、捷扶康、必妥维等整合酶药物或者含有整合酶的复合制剂。虽然我国还没有大规模使用这类药物，但在《中国艾滋病诊疗指南》(2021版)中已经被列为一线抗病毒治疗药物，且有
艾考恩丙替片(商品名：捷复康)拉米夫定多替拉韦片(商品名：多伟托)、比克恩丙诺片(商品名：必妥维)已通过医保谈判后被纳入医保，了解整合酶的突变情况对于指导临床用药有重要的影响，因此需要有相应的突变检测方法来满足整合酶基因检测的临床需求。
技术实现要素：7.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的发明人通过在多年积累中国hiv-1基因组数据库中选择pol区整合酶区域的保守位点，设计保守区简并引物，对hiv-1感染者血浆中病毒rna进行扩增，然后通过一代基因测序的方法得到病毒整合酶区域的基因序列，将基因序列与stanford数据库中的标准病毒株进行比较，得出病毒整合酶区域突变的情况，分析出病毒是否耐药的结果，并进而获得了本发明。
8.本发明第一个方面提供了一种检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，所述引物组包括第一组引物组合和第二组引物组合；
9.所述第一组引物组合包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物：
10.所述第一轮扩增引物包括：
11.正向引物1：5
′‑
ggratyattcargcacaaccag-3
′
(序列表中的序列1)；
12.正向引物2：5
′‑
gcattaggratyattcargcac-3
′
(序列表中的序列2)；
13.反向引物：5
′‑
tgggatrtgtacttcygarctta-3
′
(序列表中的序列3)；
14.所述第二轮扩增引物包括：
15.正向引物：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
16.反向引物：5
′‑
catcctgtctacytgccacac-3
′
(序列表中的序列5)；
17.所述测序引物包括：
18.正向引物1：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
19.反向引物1：5
′‑
catcctgtctacytgccacac-3
′
(序列表中的序列5)；正向引物2：5
′‑
ggvattccctacaatccccaaag-3
′
(序列表中的序列6)；
20.反向引物2：5
′‑
gaatactgccatttgtactgctg-3
′
(序列表中的序列7)；
21.所述第二组引物组合包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物：
22.所述第一轮扩增引物包括：
23.正向引物1：5
′‑
ggratyattcargcacaaccag-3
′
(序列表中的序列1)；
24.正向引物2：5
′‑
gcattaggratyattcargcac-3
′
(序列表中的序列2)；
25.反向引物：5
′‑
ctgctatgtygrcacccaattctg-3
′
(序列表中的序列8)；
26.所述第二轮扩增引物包括：
27.正向引物：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
28.反向引物：5
′‑
gagactccmtgrcccaawtgcc-3
′
(序列表中的序列9)；
29.所述测序引物包括：
30.正向引物1：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
31.反向引物1：5
′‑
gagactccmtgrcccaawtgcc-3
′
(序列表中的序列10)；
32.正向引物2：5
′‑
ggvattccctacaatccccaaag-3
′
(序列表中的序列6)；
33.反向引物2：5
′‑
gaatactgccatttgtactgctg-3
′
(序列表中的序列7)。
34.本发明第二个方面提供了一种检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒，所述试剂盒
包括本发明第一个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组中的第一组引物组合和/或第二组引物组合。
35.优选地，所述第一组引物组合中的引物的摩尔数均相同；所述第二组引物组合中的引物的摩尔数均相同。
36.优选地，所述试剂盒中还含有rt-pcr扩增试剂、pcr扩增试剂中的至少一种。
37.本发明第三个方面提供了根据本发明第一个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，或根据本发明第二个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒在制备检测hiv-1整合酶基因突变的制剂中的应用。
38.本发明第四个方面提供了根据本发明第一个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，或根据本发明第二个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒，或根据本发明第三个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的制剂在检测或辅助检测hiv-1整合酶基因突变中的应用。
39.本发明第五个方面提供了一种检测hiv-1整合酶基因突变的方法，所述方法包括：
40.采用根据本发明第一个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，或根据本发明第二个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒，或根据本发明第三个方面提供的检测hiv-1整合酶基因突变的制剂中的第一组引物组合和/或第二组引物组合，以从待测样本中提取出的rna为模板，依次进行逆转录及第一轮pcr扩增、第二轮pcr扩增，得到pcr扩增产物；
41.对所述pcr扩增产物进行测序，获得所述pcr扩增产物的测序结果；
42.将所述pcr扩增产物的测序结果与斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，获得hiv-1整合酶基因突变位点信息。
43.本发明提供的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组可用于检测病毒载量大于1000拷贝/ml的样本，同时还涵盖了斯坦福耐药数据库中整合酶相关耐药位点。采用本发明提供的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组对hiv-1整合酶基因突变进行检测，扩增出的产物覆盖整合酶1-279片段或全长，包含stanford hiv db数据库中的所有整合酶耐药相关基因突变位点，可高效扩增1000拷贝每毫升的样本，并保证中国国内hiv-1流行株的检测，从而为hiv-1整合酶耐药检测试剂的国产化，以及分子流行病学调查提供有效、经济的解决方案，检测到整合酶基因突变的准确性高、扩增灵敏度好、精确性高、可重复性高，并且成本较低，非常适合推广使用，对于艾滋病的防治具有重要的意义。
附图说明
44.图1示出了采用本发明提供的引物组和方法检测的整合酶基因的位置。
45.图2为实施例3中使用第一组引物组合后第二轮pcr扩增产物的电泳鉴定结果。
46.图3为实施例4中准确性检测时，基于整合酶序列的neighbor-joining系统进化树的示意图；图中，序列编号“_”后ih表示使用本发明的方法产生的序列，vs表示viroseq in试剂盒产生的序列。
47.图4为实施例4中精确性评价检测时，基于整合酶序列的neighbor-joining系统进化树的示意图；图中，序列编号“_”后数字为平行检测产生的序列标记。
48.图5为实施例4中可重复性评价检测时，基于整合酶序列的neighbor-joining系统
进化树的示意图；图中，序列编号开头的数字为重复检测次数。
具体实施方式
49.为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
50.下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。
51.实施例1
52.本实施例用来说明引物的设计和优化。
53.在hiv数据库(database)下载hiv-1全长序列，以b.fr.83.hxb(k03455)序列为准选取整合酶区前后部分，选择保守区域设计引物，使用quickalign软件，对照中国的5种主要流行亚型b、crf01_ae、crf07_bc、crf_08bc、crf55_01b，分析引物的特异性，再使用primer 5软件对引物进行二聚体及发卡结构分析，计算其gc含量、退火温度，并进行实验检测，选取最佳的引物组合。所选取的引物组合同时兼顾c亚型及部分a亚型。
54.本发明中检测的整合酶基因的位置位于hiv-1基因组的4230-5068(以hxb2为准)pol基因区域末段，如图1所示。
55.所采用的引物包括如下两组，可以根据需要任选一组使用，优选采用第一组引物组合，进一步优选同时采用第一组引物组合和第二组引物组合。
56.下述引物序列中，字母“a”代表“腺嘌呤”，字母“t”代表“胸腺嘧啶”，字母c代表“胞嘧啶”，字母g代表“鸟嘌呤”；字母r\y\k\m\v均代表混合碱基，其中：字母“r”代表“a+g”，字母“y”代表“c+t”，字母“k”代表“g+t”；字母“m”代表“a+c”，字母“v”代表“a+g+c”，字母“w”代表“a+t”。本发明中，如无特殊说明，在核酸序列中所使用的字母均为上述含义。名词“混合碱基”，是指该位置处具有相应的两种或三种碱基，例如，某个位置是混合碱基“y”，即是指这个序列的混合碱基“y”所处的位置是c和t均有，且摩尔比例一般为1:1，在合成引物时同时加入这两种dntp，两种dntp的掺入几率一般均为50％。
57.第一组引物组合对于所有亚型的样本均能扩增，第二组引物组合针对部分crf07_bc亚型不保守(也即，针对部分crf07_bc亚型的扩增效率不够好)。第二组引物组合扩增的为整合酶全长区域；第一组引物组合扩增出的片段与第二组引物组合扩增出的片段相比，在整合酶的3’端少28个碱基，但是根据斯坦福耐药数据库来讲，这几个碱基不在耐药突变位点的范围，不影响耐药检测。
58.第一组引物组合：
59.包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物，参考的hiv-1基因组序列为hxb2，ncbi序列号k03455.1，具体组成如下：
60.第一轮扩增引物：
61.正向引物1(inf12-1，对应hxb2基因组位置4059
→
4080外侧正向)：
[0062]5′‑
ggratyattcargcacaaccag-3
′
(序列表中的序列1)；
[0063]
正向引物2(inf12-2，对应hxb2基因组位置4053
→
4074外侧正向)：
[0064]5′‑
gcattaggratyattcargcac-3
′
(序列表中的序列2)；
[0065]
反向引物(inr15-1，对应hxb2基因组位置5192
←
5214外侧反向)：
[0066]5′‑
tgggatrtgtacttcygarctta-3
′
(序列表中的序列3)。
[0067]
第二轮扩增引物：
[0068]
正向引物(inf09，对应hxb2基因组位置4141
→
4164内侧正向)：
[0069]5′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
[0070]
反向引物(inr18，对应hxb2基因组位置5068
←
5088内侧反向)：
[0071]5′‑
catcctgtctacytgccacac-3
′
(序列表中的序列5)。
[0072]
测序引物：
[0073]
正向引物1(inf09，对应hxb2基因组位置4141
→
4164正向测序)：
[0074]5′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
[0075]
反向引物1(inr18，对应hxb2基因组位置5068
←
5088反向测序)：
[0076]5′‑
catcctgtctacytgccacac-3
′
(序列表中的序列5)；
[0077]
正向引物2(kvl082，对应hxb2基因组位置4647
→
4669正向测序)：
[0078]5′‑
ggvattccctacaatccccaaag-3
′
(序列表中的序列6)；
[0079]
反向引物2(kvl083，对应hxb2基因组位置4750
←
4772反向测序)：
[0080]5′‑
gaatactgccatttgtactgctg-3
′
(序列表中的序列7)。
[0081]
第二组引物组合：
[0082]
与第一组引物组合类似，也包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物，具体如下：
[0083]
第一轮扩增引物：
[0084]
正向引物1(inf12-1，对应hxb2基因组位置4059
→
4080外侧正向)：
[0085]5′‑
ggratyattcargcacaaccag-3
′
(序列表中的序列1)；
[0086]
正向引物2(inf12-2，对应hxb2基因组位置4053
→
4074外侧正向)：
[0087]5′‑
gcattaggratyattcargcac-3
′
(序列表中的序列2)；
[0088]
反向引物(inr08，对应hxb2基因组位置5775
←
5798外侧反向)：
[0089]5′‑
ctgctatgtygrcacccaattctg-3
′
(序列表中的序列8)。
[0090]
第二轮扩增引物：
[0091]
正向引物(inf09，对应hxb2基因组位置4141
→
4164内侧正向)：
[0092]5′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
[0093]
反向引物(inr06，对应hxb2基因组位置5276
←
5297内侧反向)：
[0094]5′‑
gagactccmtgrcccaawtgcc-3
′
(序列表中的序列9)。
[0095]
测序引物：
[0096]
正向引物1(inf09，对应hxb2基因组位置4141
→
4164正向测序)：
[0097]5′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
(序列表中的序列4)；
[0098]
反向引物1(inr06，对应hxb2基因组位置5276
←
5297反向测序)：
[0099]5′‑
gagactccmtgrcccaawtgcc-3
′
(序列表中的序列10)；
[0100]
正向引物2(kvl082，对应hxb2基因组位置4647-4669正向测序)：
[0101]5′‑
ggvattccctacaatccccaaag-3
′
(序列表中的序列6)；
[0102]
反向引物2(kvl083，对应hxb2基因组位置4750-4772反向测序)：
[0103]5′‑
gaatactgccatttgtactgctg-3
′
(序列表中的序列7)。
[0104]
实施例2
[0105]
本实施例用来说明rna样本的提取。
[0106]
本实施例中用来提取rna的材料来源为待检测hiv-1病人的血清或者血浆(下面统称为“样品材料”)。
[0107]
提取rna之前，提前将样品材料从-80℃冰箱中取出，恢复至室温(15-25℃)，解冻待用。
[0108]
提取rna采用qiagen viral rna mini kit病毒rna提取试剂盒来进行，操作之前将试剂盒中的ave缓冲液恢复至室温，以备后续步骤使用。提取rna的具体操作步骤如下：
[0109]
1、取1.5ml avl缓冲液加入一管冻干的carrier rna中，待溶解完全后，转入avl缓冲液瓶中(一管carrier rna对应一管avl 31ml)，分装到1.5ml eppendorf管中，每管560μl，4℃保存。avl/carrier rna缓冲液4℃保存时会有沉淀，使用前需37℃预热溶解沉淀。注：不要将avl/carrierrna缓冲液加热超过6次，每次孵育不要超过5分钟。
[0110]
aw1和aw2缓冲液按照说明书上的量加入96-100％的乙醇，乙醇应无rna酶(无水乙醇)。
[0111]
所有离心步骤均在室温进行。注意：使用无dnase和rnase的tip头。
[0112]
2、将560μl准备好的含有carrier rna的avl缓冲液加入1.5ml离心管。
[0113]
3、将140μl血浆加入盛有avl/carrier rna缓冲液的离心管，振荡混匀15秒。
[0114]
4、室温(15-25℃)孵育10分钟。
[0115]
5、将1.5ml离心管短暂离心，消除管盖内的液滴。
[0116]
6、加入560μl乙醇(96-100％)，振荡混匀15秒。振荡混匀后将离心管短暂离心，消除管盖内的液滴。
[0117]
7、将630μl步骤6中的溶液小心转入qiaamp rna提取柱(放置于2ml收集管中)，注意不要碰湿柱子边缘。盖上盖子，6000g(小离心机约8000转)离心1分钟，将柱子移入一新的2ml收集管(提供)，丢弃剩有滤液的收集管。
[0118]
8、小心打开柱子的盖子，重复步骤7。
[0119]
9、小心打开柱子的盖子，加入500μl aw1液，盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟，将柱子放入一新的2ml收集管，丢弃剩有滤液的收集管。
[0120]
10、小心打开柱子的盖子，加入500μl aw2液，盖上盖子，全速20000g(14000rmp)离心3分钟。
[0121]
11、将柱子放入一新的1.5ml离心管(自备)，丢弃剩有滤液的收集管。小心打开柱子的盖子，加入60μl已恢复室温的ave缓冲液，盖上盖子，室温孵育5分钟后，6000g(8000rmp)离心1分钟。
[0122]
12、离心得到的洗脱液，即为rna样本。注意：rna样本易降解，需马上进行后续的rt-pcr反应，如不能立即进行rt-pcr，可以放-20℃保存(一个月)，长期保存可以放-80℃(半年)。
[0123]
实施例3
[0124]
本实施例用来说明rt-pcr扩增、测序和分析。
[0125]
1、逆转录及第一轮pcr
[0126]
本步骤采用promega公司货号为a1702 accessquick
tm rt-pcr system的试剂盒来进行。
[0127]
反应体系(总体积25μl)如下：
[0128][0129][0130]
其中，pcr mix中含有tfl dna聚合酶，dntps，硫酸镁和反应缓冲液。正向引物1、正向引物2、反向引物为选自实施例1中列出的两组引物组合中的第一轮扩增引物中的任意一组(即：正向引物1为序列表中的序列1、正向引物2为序列表中的序列2、反向引物为序列表中的序列3；或者正向引物1为序列表中的序列10、正向引物2为序列表中的序列11、反向引物为序列表中的序列12)；各个引物的终浓度均为20μmol/l。
[0131]
配制上述pcr反应体系在冰上操作，加入模板rna(模板rna即为按照实施例2中的方法提取得到的rna样本)后振荡混匀，短暂离心，然后按照如下的pcr反应程序进行扩增：
[0132]
50℃45分钟；
[0133]
95℃2分钟；
[0134]
95℃20秒，50℃30秒，72℃2分30秒，进行3个循环；
[0135]
95℃15秒，50℃20秒，72℃2分钟，进行35个循环；
[0136]
72℃10分钟；
[0137]
4℃保存。
[0138]
2、第二轮pcr
[0139]
本步骤采用tiangen公司货号为kt201的试剂盒来进行。
[0140]
反应体系(总体积50μl)如下：
[0141][0142]
[0143]
其中，pcr mix预混试剂中含有2倍终浓度taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液、pcr反应的增强剂和优化剂以及稳定剂。模板为上述第一轮pcr反应所得的反应产物。正向引物、反向引物为选自实施例1中列出的两组引物组合中的、与第一轮扩增引物相应的第二轮扩增引物组合中的一组(即：第一轮pcr使用序列表中的序列1、序列2、序列3时，第二轮pcr采用的引物为序列表中的序列4、序列5；第一轮pcr使用序列表中的序列10、序列11、序列12时，第二轮pcr采用的引物为序列表中的序列13、序列14)；引物的终浓度均为20μmol/l。
[0144]
配制上述pcr反应体系在冰上操作，加入模板后振荡混匀，短暂离心，然后按照如下的pcr反应程序进行扩增：
[0145]
95℃4分钟；
[0146]
95℃20秒，55℃30秒，72℃2分30秒，进行3个循环；
[0147]
95℃15秒，55℃20秒，72℃2分钟，进行35个循环；
[0148]
72℃10分钟；
[0149]
4℃保存。
[0150]
3、第二轮pcr扩增产物的电泳鉴定
[0151]
(1)、于三角烧瓶中称取1.5g琼脂糖，加入150ml 1
×
tae溶液，配成1％的胶溶液，置于微波炉中，中火加热3分钟，冷却到60℃左右时加入5μl的gold view染料混匀。
[0152]
(2)、洗净的电泳板和梳子擦干，倒入溶胶液，使胶的厚度达到0.5cm左右。室温下放置至少40分钟以上，使胶彻底凝固。
[0153]
(3)、待胶凝好后缓慢拔出梳子，放入电泳槽，倒入1
×
tae，使液面高出胶平面1mm左右。
[0154]
(4)、取第二轮pcr产物5μl缓慢加入电泳孔中。(若反应体系中不含loading buffer则于玻璃纸上滴点10
×
上样缓冲液，每滴约1μl，取第二轮pcr扩增产物5μl与10
×
上样缓冲液液滴混匀后缓慢加入电泳孔中。)同时在电泳孔中加入5μl分子量为2000的marker，判断pcr扩增产物的正确位置。
[0155]
(5)、电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40分钟左右观察结果。
[0156]
(6)、将电泳后的胶从胶板上取下，置于凝胶成像仪上观察电泳胶中期望的pcr产物条带并拍照。
[0157]
图2中示出了使用第一组引物组合的结果。图2中，gen201911.01a、gen201911.02a、gen201911.03a、gen201911.04a、gen201911.05a为来自美国vqa(病毒学质量保证)实验室的耐药质控项目的标准样品；zk6、zk31、zk54为临床样本，具体如表4所示。
[0158]
(7)、切取位于948bp附近的阳性样本的凝胶条带，并进行纯化回收dna片段，以用于后续测序。同时，-20℃保存第一轮pcr产物以备必要时进行再次扩增。
[0159]
4、测序和序列分析
[0160]
采用sanger测序方法对上述回收获得的dna片段进行测序。
[0161]
测序所采用的引物为选自实施例1中列出的两组引物组合中的、与第一轮扩增引物、以及第二轮扩增引物相应的测序引物(即：第一轮pcr使用序列表中的序列1、序列2、序列3，第二轮pcr采用的引物为序列表中的序列4、序列5时，测序引物采用序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9；第一轮pcr使用序列表中的序列10、序列11、序列12，第二轮pcr采用的
引物为序列表中的序列13、序列14时，测序引物采用序列表中的序列15、序列16、序列17、序列18)。
[0162]
5、序列分析
[0163]
通过与斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，获得hiv-1整合酶基因突变位点信息。
[0164]
实施例4
[0165]
本实施例用来说明本发明提供的检测hiv-1病毒整合酶基因突变检测方法的准确性、扩增灵敏度、精确性、可重复性。
[0166]
本实施例中，采用的引物为上述实施例1中的两组，首先采用第一组引物组合进行检测，然后再采用第二组引物进行检测，采纳两组引物结果一致的为最终的检测结果，提高了检测结果的可靠性。
[0167]
(一)检测准确性
[0168]
通过比较本发明的检测方法与金标准方法产生的核苷酸序列和耐药性突变结果比对来衡量准确性。采用viroseq
tm hiv-1整合酶基因耐药检测试剂盒(viroseq
tm in试剂盒)为金标准方法，该试剂盒由美国雅培公司生产，尽管该in试剂盒仅用于研究用途(ruo)，未经fda批准或ce-ivd认证，但它是目前市场上较公认的商品化试剂盒，因此常在方法比对中作为“金标准”使用。
[0169]
通过标准：对于90％及以上的样本，两种方法获得的序列一致性在98％及以上。
[0170]
说明：不一致(即，差异)包括：部分不一致(兼容性)和完全不一致(非兼容性)；兼容性差异时，一条序列为混合碱基，而另一条序列中相对应的碱基为混合碱基中的一个碱基，如一条为r，另一条为a；非兼容性差异时，两条序列相对应的碱基完全不同，如一条为a，另一条为t。
[0171]
1、样本来源
[0172]
共有26份样本被纳入准确性评价的比较，包括：
[0173]
(1)临床样本：将11例来自中国患者血浆的样本作为临床样本，病毒载量在6000到650000拷贝/毫升之间。
[0174]
(2)分析样本：将15例来自美国nih的vqa病毒质量控制项目的样本称为分析样本，病毒载量在5766到26833拷贝/毫升之间。
[0175]
这些样本覆盖9个亚型：a1(1)、b(10)、c(2)、crf01_ae(5)、crf02_ag(1)、crf07_bc(1)、crf08_bc(4)、crf55_01b(1)、f1(1)。样本情况如表1所示。
[0176]
表1用于准确性评价的样本情况
[0177][0178]
2、序列一致性比较
[0179]
将本发明的检测方法与使用viroseq
tm in试剂盒产生的序列通过neighbor-joining进化树分析发现，同一样本产生的序列均聚在一起，基因距离《0.015，结果如图3所示。
[0180]
将序列进行两两配对比较，结果显示所有样本的序列一致性在98.6％以上，其中不一致碱基数在0-11之间，只有一个样本存在1个完全不一致的碱基(表2)，这说明采用本发明提供的方法可以获得很高的检测准确性。
[0181]
表2本发明的检测方法和viroseq
tm in试剂盒平行检测序列的配对比较
[0182][0183][0184]
(二)扩增灵敏度
[0185]
扩增敏感性为pcr扩增成功率，即在一定病毒载量范围、覆盖我国主要流行亚型的样本中扩增的成功率，样本包括临床(未稀释)样本和分析(稀释)样本，其中载量在1000-5000拷贝/毫升的样本数在10个以上。
[0186]
通过标准：90％载量在1000-5000拷贝/毫升的样本扩增成功，95％载量》5000拷贝/毫升的样本扩增成功。
[0187]
1、样本组成
[0188]
43份临床样本：病毒载量范围为1098-543115拷贝/毫升，涵盖六种hiv-1亚型，包括b'(3)、crf01_ae(16)、crf07_bc(17)、crf08_bc(1)、crf55_01b(1)、crf59_01b(1)和urf(4)。
[0189]
3份临床样本：病毒载量范围在58-3830拷贝/毫升之间，亚型分别为b'，crf01_ae和crf07_bc。
[0190]
14个分析样本：用hiv阴性血浆稀释至病毒载量在1000-5000拷贝每毫升，获得14个分析样本。
[0191]
2、扩增结果
[0192]
在病毒载量为51-1000拷贝/ml的样本中有8个(72％，8/11)扩增成功，病毒载量为1001-5000拷贝/ml的样本中有16个(94％，16/17)扩增成功，所有病毒载量超过5000拷贝/ml的样本均成功扩增(表3)，这说明采用本发明提供的方法可以获得很高的扩增灵敏度。
[0193]
表3用于扩增灵敏度评价的样本的病毒载量范围和扩增情况
[0194][0195]
(三)精确性评价
[0196]
精确性通过批内检测的结果比较来评价。选取4个临床样本，在同一批次对每个样本从病毒rna提取到测序进行5个平行检测，利用mega x构建neighbor-joining进化树，使用who hivdr qc在线软件(https://recall.bccfe.ca/who_qc/)进行两两比较，计算核苷酸序列相似性。
[0197]
通过标准：90％的两两比对序列一致性在98％以上，部分不一致也算为不一致。
[0198]
1、样本情况
[0199]
4个临床样本的病毒载量在8800-28100之间，亚型包括：b’(1)、crf01_ae(2)和crf07_bc(1)，均没有耐药突变，见表4。
[0200]
表4.用于精确性评价的样本的基本情况和总体评价情况
[0201][0202]
2、进化树分析显示，同一样本的序列均位于同一枝上，且基因距离较近，结果如图4所示。
[0203]
3、一致性比较
[0204]
单个样本的序列间碱基差异总数在0-40个之间，平均一致性在99.52％-100％之间(表5)。两两配对比较显示，两条序列间的差异在0-7个碱基之间，均为混合碱基引起，没
有完全不一致的碱基(表5)，这说明采用本发明提供的方法可以获得很高的一致性。
[0205]
表5平行检测样本序列两两比较的情况
[0206][0207]
(四)可重复性评价
[0208]
可重复性通过批间检测的结果比较来评价。选取4个临床样本，两名操作员使用不同批次的病毒rna提取试剂(均为购自qiagen的病毒rna提取试剂盒)，至少每隔一个月进行一次检测，每个样本进行5个批次的检测(表6)。
[0209]
如前所述，利用mega x构建neighbor-joining进化树，使用who hivdr qc在线软件(https://recall.bccfe.ca/who_qc/)进行两两比较，计算核苷酸序列相似性。
[0210]
通过标准：90％的两两比对序列一致性在98％以上，部分不一致也算为不一致。
[0211]
表6可重复性评价的试剂、检测时间和操作人员情况
[0212][0213]
1、样本情况，与精确性评价使用的样本一致(表7)。
[0214]
表7可重复性评估的样本的基本情况和总体评价情况
[0215][0216]
2、进化树分析显示，同一样本的序列均位于同一枝上，且基因距离较近，结果如图5所示。
[0217]
3、一致性比较
[0218]
每个样本共进行10次两两配对比较，碱基差异总数在6-40个之间，平均差异率在0.1-0.9％之间(表7)。两两配对比较显示，两条序列间的差异在0-10个碱基之间，均为混合碱基引起，没有完全不匹配的差异(表8)，这说明本发明提供的方法具有很高的可重复性。
[0219]
表8重复检测样本序列两两比较的情况
[0220][0221]
综上可见，采用本发明提供的检测hiv-1病毒整合酶基因突变检测方法，在准确性、扩增灵敏度、精确性、可重复性方面均符合who推荐的标准，完全可以适用于我国流行的hiv-1病毒株针对整合酶的耐药性检测。
[0222]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一组引物组合和第二组引物组合；所述第一组引物组合包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物：所述第一轮扩增引物包括：正向引物1：5
′‑
ggratyattcargcacaaccag-3
′
，即序列表中的序列1；正向引物2：5
′‑
gcattaggratyattcargcac-3
′
，即序列表中的序列2；反向引物：5
′‑
tgggatrtgtacttcygarctta-3
′
，即序列表中的序列3；所述第二轮扩增引物包括：正向引物：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
，即序列表中的序列4；反向引物：5
′‑
catcctgtctacytgccacac-3
′
，即序列表中的序列5；所述测序引物包括：正向引物1：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
，即序列表中的序列4；反向引物1：5
′‑
catcctgtctacytgccacac-3
′
，即序列表中的序列5；正向引物2：5
′‑
ggvattccctacaatccccaaag-3
′
，即序列表中的序列6；反向引物2：5
′‑
gaatactgccatttgtactgctg-3
′
，即序列表中的序列7；所述第二组引物组合包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物：所述第一轮扩增引物包括：正向引物1：5
′‑
ggratyattcargcacaaccag-3
′
，即序列表中的序列1；正向引物2：5
′‑
gcattaggratyattcargcac-3
′
，即序列表中的序列2；反向引物：5
′‑
ctgctatgtygrcacccaattctg-3
′
，即序列表中的序列8；所述第二轮扩增引物包括：正向引物：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
，即序列表中的序列4；反向引物：5
′‑
gagactccmtgrcccaawtgcc-3
′
，即序列表中的序列9；所述测序引物包括：正向引物1：5
′‑
tctayctgkcatgggtrccagcac-3
′
，即序列表中的序列4；反向引物1：5
′‑
gagactccmtgrcccaawtgcc-3
′
，即序列表中的序列10；正向引物2：5
′‑
ggvattccctacaatccccaaag-3
′
，即序列表中的序列6；反向引物2：5
′‑
gaatactgccatttgtactgctg-3
′
，即序列表中的序列7。2.一种检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组中的第一组引物组合和/或第二组引物组合。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组引物组合中的引物的摩尔数均相同；所述第二组引物组合中的引物的摩尔数均相同。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有rt-pcr扩增试剂、pcr扩增试剂中的至少一种。5.权利要求1所述的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，或权利要求2-4中任一项所述的检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒在制备检测hiv-1整合酶基因突变的制剂中的应用。6.权利要求1所述的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，或权利要求2-4中任一项所述的检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒，或权利要求5所述的检测hiv-1整合酶基因突变
的制剂在检测或辅助检测hiv-1整合酶基因突变中的应用。7.一种检测hiv-1整合酶基因突变的方法，所述方法包括：采用权利要求1所述的检测hiv-1整合酶基因突变的引物组，或权利要求2-4中任一项所述的检测hiv-1整合酶基因突变的试剂盒，或权利要求5所述的检测hiv-1整合酶基因突变的制剂中的第一组引物组合和/或第二组引物组合，以从待测样本中提取出的rna为模板，依次进行逆转录及第一轮pcr扩增、第二轮pcr扩增，得到pcr扩增产物；对所述pcr扩增产物进行测序，获得所述pcr扩增产物的测序结果；将所述pcr扩增产物的测序结果与斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，获得hiv-1整合酶基因突变位点信息。
技术总结本发明属于生物技术领域，提供了一种检测HIV-1整合酶基因突变的引物组，包括第一组引物组合和第二组引物组合；第一组引物组合和第二组引物组合均包括第一轮扩增引物、第二轮扩增引物和测序引物。本发明还提供了上述检测HIV-1整合酶基因突变的引物组在检测HIV-1整合酶基因突变中的应用。本发明提供的检测HIV-1整合酶基因突变的引物组可用于检测病毒载量大于1000拷贝/mL的样本，同时还涵盖了斯坦福耐药数据库中整合酶相关耐药位点，检测到整合酶基因突变的准确性高、扩增灵敏度好、精确性高、可重复性高，并且成本较低，非常适合推广使用，对于艾滋病的防治具有重要的意义。对于艾滋病的防治具有重要的意义。对于艾滋病的防治具有重要的意义。
技术研发人员：廖玲洁 邢辉 冯毅 宋畅 马鹏飞 杨晓震 郜培杰 史亚伦 邵一鸣
受保护的技术使用者：北京安普生化科技有限公司
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/7/4
