1.本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种防治棉花枯萎病的生防菌株，以及生防菌剂和田间应用试验。
背景技术：2.棉花枯萎病是棉花生产中危害最严重的病害之一，曾被称为棉花的“癌症”之一。棉花枯萎病对棉株生育影响很大，在苗期即可发生，严重时大量死苗，造成田间植株数大量减少。特别是在定苗以后，大量棉株发病，叶片发黄、干枯脱落、直至萎蔫枯死，导致结铃数量较少，铃重减轻，同样造成棉花减产，棉花品质降低。尖孢镰刀菌萎蔫专化型真菌(fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)是棉花枯萎病的病原菌，它在自然条件下很容易存活，能够产生分生孢子，主要通过土壤、种子和肥料进行传播。棉花枯萎病是典型的维管束病害，棉花在整个生长发育期均可染病。棉花枯萎病有很多种类型的发病症状，苗期有青枯型、红叶型、黄化型、皱缩型、黄色网纹型等；蕾期有皱缩型、光秆型、枯斑型、半边黄化型、顶枯型等。棉花枯萎病的防治是提高棉花产量的重要途径之一。
3.棉花枯萎病的初侵染来源主要来自带菌的棉籽、棉籽壳、病残体和病田土壤。该病害是典型积年流行病，受到气候条件、耕作制度、栽培管理及土壤中线虫等因素影响。目前防治棉花枯萎病的农业方法主要有：种植抗病品种、适时播种、轮作换茬、增施有机肥和清除病株。但受到地区环境和种植习惯的影响，轮作种植很难进行大面积的推广，且枯萎病菌生命力较强能在土壤中存活很长时间，短期轮作达不到明显的防治效果，长期轮作又很难开展。深翻土壤和合理密植等田间管理方法均无法彻底杀灭病原菌，对棉花枯萎病的防治达不到理想的效果。
4.目前防治棉花枯萎病应用较多的方法是化学药剂：
①
种子处理：25％多菌灵浸泡种子，2％戊唑醇可分散粉剂拌种播种。
②
土壤处理：可在整地时，每亩撒施50％福美双可湿性粉剂和50％多菌灵可湿性粉剂。
③
药剂防治：病害发生初期是防治的关键时期，常见的杀菌农药有多菌灵、甲基托布津、56％醚菌酯百菌清、80％恶霜福美双可湿性粉剂、80％乙蒜素三唑酮乳油、棉花三清等。化学药剂用于零星病区的病株和局部土壤处理效果较显著，但是，长期使用单一性作用机制的化学药剂会使作物产生抗药性，防治无效。化学药剂的毒性较强且绝大多数药剂都易挥发，农药会经过人体呼吸道直接进入施药人体内，引起急性中毒。且绝大多数化学药剂残留严重，留在作物上，进入食物链后，会在各级消费者体内积累，严重危害人和动物的健康。
5.因此寻找一种经济、有效的防治棉花枯萎病的生物菌剂成为保障棉花安全绿色生产的迫切任务。生物防治因其对环境友好和生防菌具有很好的抗性，而越来越受到重视。植物根际促生菌(pgpr)的概念提出以来，更多的研究表明pgpr除了具有固氮、溶磷、解钾和产生植物生长调节剂等直接促生作用外，还具有拮抗病原菌和诱导系统抗性等间接促生作用。近几年来随着生物技术的不断发展，针对性的筛选高效拮抗微生物，提高抑菌的效果，
成为研究的热点。
6.cn112175888a公开了一种贝莱斯芽孢杆菌hsg1949，并公开了其在防治花生果腐病、花生白绢病菌、棉花黄萎病菌、棉花立枯病菌或棉花枯萎病菌中的应用。cn112458012a公开了一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)tk2019微生物菌剂，并公开了其在在制备防治棉花黄萎病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、红枣黑斑病药物中的应用。但是仍然存在筛选更多能够高效防治棉花枯萎病等作物病害的需求。
技术实现要素：7.本发明为了解决现有棉花枯萎病的防治所存在的上述技术问题，提供了一种贝莱斯芽孢杆菌及其微生物菌剂、菌剂发酵制备方法和应用，它具有较好的防治效果和不会对棉花产生质量安全问题。
8.本发明一方面提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)rjw-5-5，其分类命名为：bacillus velezensis；保藏登记号为cgmcc no.22939；保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2021年07月22日。
9.本发明提供的菌株是从棉花枯萎病发病严重地区中健康棉花植株的根际土壤中筛选出来的。采用梯度稀释分离法获得对根际营养竞争能力强的根际微生物菌株，划线纯化后，再采用平板对峙法再次筛选拮抗菌，获得具有高效拮抗作用的菌株，观察抑菌圈的大小，通过比较抑菌圈的大小，选择抑菌圈较大的菌株。采用显微镜进行观察并经形态学、生理生化特性、分子生物学和16s rrna基因鉴定，确定所述拮抗菌的分类地位，为贝莱斯芽孢杆菌。
10.本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5是需氧型、能运动的革兰氏阳性菌，在lb培养基上菌落形态为椭圆形或圆形，颜色为乳白色，质地粘稠，边缘粗糙，在电镜下观察为杆状。该菌的主要生物功能有：改变其周围菌群环境和种类，与病原菌竞争植物周围的位点，并且分泌多种抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到改良土壤和生防的目的，具有防病和促生作用。
11.本发明另一方面提供一种微生物菌剂，其中所述微生物菌剂中含有本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5。
12.优选的，所述微生物菌剂是可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中所述贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5的活菌数为5x10
9 cfu/g-5x10
10 cfu/g。
13.本发明另一方面涉及所述的微生物菌剂的制备方法，其包括以下步骤，
14.(1)将贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5菌株接种到lb固体培养基上进行活化；
15.(2)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到lb液体培养基中得到培养液，并放到恒温摇床上振荡，温度35-37℃、转速150-220r/min振荡15-20小时，即制得种子液；
16.(3)制备固体发酵培养物：将步骤(2)获得的种子液以1:8-12(体积 /质量)的比例混合固体发酵培养基，进行固体发酵培养；发酵培养条件为：培养温度35-37℃、培养时间55-75h、初始ph值6.0，即制得固体发酵培养物；
17.(4)可湿性粉剂制备：将步骤(3)获得的固体发酵培养物与任选的载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、保护剂混合，随后烘干制成可湿性粉剂。
18.在本发明所述的微生物菌剂的制备方法中，其中：
19.步骤(1)中所述lb固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g， nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，ph 7.5；
20.步骤(2)中所述lb液体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g， nacl 5g，水1000ml，ph 7.5；
21.步骤(2)中，优选所述温度优选36℃、转速优选200r/min振荡18 小时；
22.步骤(3)中所述固体培养基配方为：100g豆饼粉，320g玉米粉，100 g淀粉酶，50g na2hpo4，10g nacl，75g蔗糖，1g mgso4，0.5g mnso4。取500ml锥形瓶加150g培养料。
23.步骤(3)中，发酵培养条件优选为：培养温度36℃、培养时间65h、初始ph值6.0。
24.步骤(4)可湿性粉剂制备的具体步骤为：在步骤(3)获得的固体发酵培养物中加入其重量的5-8％、优选6.5％的硅藻土，制成母粉；然后加入润湿剂聚乙二醇、分散剂木质素磺酸钠、稳定剂cmc-na、保护剂糊精以及余量的硅藻土，烘干制成可湿性粉剂；
25.所述可湿性粉剂中各原料成分的重量百分含量为：固体发酵培养物 30-50％、润湿剂5-8％、分散剂3-6％、稳定剂1-3％、保护剂2-5％，硅藻土余量。优选为，固体发酵培养物35％、润湿剂7％、分散剂5％、稳定剂2％、保护剂3％，硅藻土余量。
26.本发明另一方面涉及所述的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5作为棉花枯萎病病害拮抗菌的应用。
27.优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5菌剂为可湿性粉剂，应用方式为叶面喷雾，喷雾最佳时间为棉花叶片出现零星病斑时开始，用水稀释500 倍，用量100g/667m2。
28.本发明的生防菌剂中含有抑制棉花枯萎病病原菌生长的专一性菌株 rjw-5-5，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防制剂在温室盆栽条件下对棉花枯萎病的防效达到了82.79％，田间条件对棉花枯萎病的防效达到了80.44％，显著优于对照。
29.本发明所涉及的贝莱斯芽孢杆菌菌株rjw-5-5，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治棉花枯萎病的生防菌剂。
30.本发明制备的菌剂是一种绿色环保无污染的生防菌剂，可提高植物的抗病特性，对人畜无害、不污染环境，可以减少甚至不用其他相应化学农药，不仅节省农民开支，还能促进棉花生长提高棉花品质。
附图说明
31.为了加深对本发明的理解，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明。
32.图1是贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5在lb培养基上的菌落形态图；
33.图2是贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5扫描电镜图；
34.图3是贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5 16s rrna系统发育树；
具体实施方式
35.本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：供试病原菌分离自延安地区发病区域中种植的棉花枯萎病发病植株内；拮抗菌分离自发病区域中种植的健康未发病植株根际土壤，样品采集后尽快送至实验室立即进行分离；培养基采用马铃薯葡萄糖培养基
pda和lb培养基； spx-250b-d型生化培养箱；ldzx-50kbs高压蒸汽灭菌锅；sw-cj-2fd 型超净工作台；e360k离心机；恒温摇床hzq-x300。
36.本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)rjw-5-5，保藏登记号为cgmccno.22939，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年07月22日。
37.实施例1：贝莱斯芽孢杆菌菌株rjw-5-5的分离与筛选：
38.(1)拮抗菌分离：称取棉花根际土壤1g，倒入装有100ml灭菌水的锥形瓶中，220r/min振荡30min，65℃水浴40min，进行梯度稀释，涂布分离培养。
39.(2)拮抗菌纯化：根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至lb固体斜面试管上，采用斜面划线法分离纯化，置于培养箱中培养3d待目标菌长为菌株，纯化的菌株经革兰氏染色和芽孢染色，显示为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状、产芽孢。lb固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g，nacl 5 g，琼脂18g，水1000ml，ph 7.5。
40.(3)拮抗菌筛选：将4℃保存的棉花枯萎病病原接种于pda培养基上活化，用打孔器打菌饼，置于pda平板正中间，十字交叉法接已分离纯化的菌株于等距的四端，31℃培养2d，测定抑菌圈直径和抑菌带(从活性菌菌落的边缘到抑菌圈的外缘)的大小。pda培养基的配方为：土豆150g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml，ph值7.5。
41.分离筛选获得本发明所提供的菌株，实验室编号为rjw-5-5。
42.实施例2：贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5的鉴定：
43.对实施例1所得的菌株的鉴定过程为：
44.(1)形态特征：rjw-5-5在lb培养基上的菌落形态为椭圆形或圆形，颜色为乳白色，质地粘稠，边缘粗糙，革兰氏染色呈阳性(图1)。在电镜下观察菌体为杆状(图2)。
45.(2)生理生化实验：通过对贝莱斯芽孢杆菌进行生理生化特性试验并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》(buchanan&gibbons，1984) 和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定为芽孢杆菌属。
46.(3)分子生物学：对菌株rjw-5-5的16s rrna基因进行pcr扩增，由上海生工对纯化后的产物进行测序，贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5 16s rrna 基因序列见序列表。将测得的序列在ncbi网站上blast比对，进行同源性分析，下载同源模式序列，并建立系统发育树，将菌株rjw-5-5鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(图3)。
47.实施例3：本发明的贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂的发酵制备
48.具体包括以下几个步骤：
49.步骤一、菌种固体平板培养：将贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5菌种接入lb 固体培养基，放入31℃恒温箱内培养48h，活化菌株。lb固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g，nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，ph 7.5。
50.步骤二、种子液扩大培养：在无菌操作台上用接种环将步骤一活化的贝莱斯芽孢杆菌菌株接种到盛有100ml lb液体培养基的锥形瓶中，放到恒温摇床上振荡，以36℃、200r/min振荡18h，即制得种子液，然后进行发酵培养。lb液体培养基的配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g，nacl 5g，水1000ml，ph 7.5；
51.步骤三、固体菌粉发酵制备：将步骤二获得的种子液以1:10(体积/质量)的比例混合固体发酵培养基，进行固体发酵培养；发酵培养条件为：培养温度36℃、培养时间65h、初
始ph值6.0，即制得固体发酵培养物；所述固体发酵培养基的配方为：100g豆饼粉，320g玉米粉，100g淀粉酶， 50g na2hpo4，10g nacl，75g蔗糖，1g mgso4，0.5g mnso4。取500ml 锥形瓶加150g培养料。
52.步骤四、可湿性粉剂的制备：将步骤三获得的固体发酵培养物与其重量6.5％的硅藻土混合，制成母粉；然后加入润湿剂聚乙二醇、分散剂木质素磺酸钠、稳定剂cmc-na、保护剂糊精以及余量的硅藻土，烘干制成可湿性粉剂；其中，各原料重量百分含量控制为：固体发酵培养物35％、润湿剂7％、分散剂5％、稳定剂2％、保护剂3％，硅藻土余量。所述可湿性粉剂中贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5的活菌数为3.6x10
10 cfu/g。
53.实施例4：本发明的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5可湿性粉剂对棉花枯萎病的温室防效测定：
54.试验点：西北农林科技大学植物保护学院温室；
55.试验品种“10900”棉株
56.试验处理：本试验设计3个处理：
57.(1)将实施例3制得贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂(1：500比例)混合后进行喷雾，用量100g/667
㎡
；
58.(2)使用防治棉花枯萎病的化学药剂80％乙蒜素乳油，按照说明书进行等量喷施；
59.(3)使用等量清水喷施。设置三个处理，每个处理进行3次重复，共有9个随机区组排列的小区，并设有保护行。
60.选取长势一致的棉花苗在两叶一心期接种棉花枯萎病菌，待棉花叶片出现零星病斑时开始喷药。间隔10d喷药一次，共喷药3次，第二次喷雾后7d进行第一次调查，第三次喷药后7d调查一次，共调查2次，观察并记录发病情况，计算病情指数及防治效果。试验结果见表1。
61.棉花枯萎病严重度分级标准：每小区采用5点取样方法，每点固定调查5株，每株全叶调查，记录调查总株数及各级病株数。
62.棉花枯萎病病情分级标准：
63.0级:棉株健康，无病叶，生长正常；
64.1级:棉株1-2片子叶变黄萎蔫；
65.2级:棉株2片子叶和1片真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；
66.3级:棉株2片子叶及2片及以上真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状或青枯状，棉株矮化或萎蔫；
67.4级:棉株所有叶片发病，棉株枯死。
68.病情指数及相对防效按下述公式计算:
69.病情指数＝∑(病级株数
×
该病级数)/(总植株数
×
最高病级数)
×
100
70.防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100％
71.表1温室中贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5可湿性粉剂对棉花枯萎病的防治效果
[0072][0073]
从表1可以看出使用本发明制备的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5可湿性粉剂对棉花枯萎病的温室防效可达82.79％，相比较市售的化学药剂80％乙蒜素乳油的防效72.31％更加有效。
[0074]
实施例5:本发明的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5可湿性粉剂对棉花枯萎病的田间防效测定：
[0075]
试验用地：杨凌棉花地，试验地面积667m2，土质为轻壤土，有机质含量为1.69％，ph值7.2。
[0076]
试验处理：本试验设贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5可湿性粉剂500倍液、化学药剂80％乙蒜素乳油、清水等3个处理。每个处理3个重复，共9个小区，各小区随机排列，每个小区60m2，小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。
[0077]
试验方法：所有试验小区栽培条件及管理措施一致，亩用药液30kg (单次喷雾)，使用16型喷雾器将上述3个处理在待棉花叶片出现零星病斑时开始进行第一次喷雾处理，喷洒要均匀，间隔10d进行第二次喷雾，再间隔10d进行第三次喷雾。每处理重复3组。第二次喷雾后7d进行第一次调查，第三次喷药后7d进行第二次调查，共调查2次，每小区采用5 点取样法，每点固定调查5株，每株全叶调查，记录调查总株数及各级病株数，并计算病情指数及防治效果。试验结果见表2。
[0078]
表2田间贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5可湿性粉剂对棉花枯萎病的防治效果
[0079][0080]
由表2数据可知，生防菌剂对棉花枯萎病的田间防效达到了80.44％，显著高于化学药剂的防效73.74％。
[0081]
以上内容仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种防治棉花枯萎病的生防菌株，其特征在于，所述生防菌株命名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)rjw-5-5，；保藏登记号为cgmcc no.22939；保藏时间为2021年07月22日；保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5。3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂是可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中所述贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5的活菌数为5x10
9 cfu/g-5x10
10 cfu/g。4.一种权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)将贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5菌株接种到lb固体培养基上进行活化；(2)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到lb液体培养基中得到培养液，并放到恒温摇床上振荡，温度35-37℃、转速150-220r/min振荡15-20小时，即制得种子液；(3)制备固体发酵培养物：将步骤(2)获得的种子液以1:8-12(体积/质量)的比例混合固体发酵培养基，进行固体发酵培养；发酵培养条件为：培养温度35-37℃、培养时间55-75h、初始ph值6.0，即制得固体发酵培养物；(4)可湿性粉剂制备：将步骤(3)获得的固体发酵培养物与任选的载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、保护剂混合，随后烘干制成可湿性粉剂。5.根据权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述lb固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g，nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，ph 7.5；步骤(2)中所述lb液体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨12g，nacl 5g，水1000ml，ph 7.5；步骤(3)中所述固体培养基配方为：100g豆饼粉，320g玉米粉，100g淀粉酶，50g na2hpo4，10g nacl，75g蔗糖，1g mgso4，0.5g mnso4。6.根据权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述温度优选36℃、转速优选200r/min振荡18小时；步骤(3)中，发酵培养条件为：培养温度36℃、培养时间65h、初始ph值6.0。7.根据权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)可湿性粉剂制备的具体步骤为：在步骤(3)获得的固体发酵培养物中加入其重量的5-8％的硅藻土，制成母粉；然后加入润湿剂聚乙二醇、分散剂木质素磺酸钠、稳定剂cmc-na、保护剂糊精以及余量的硅藻土，烘干制成可湿性粉剂；所述可湿性粉剂中各原料成分的重量百分含量为：固体发酵培养物30-50％、润湿剂5-8％、分散剂3-6％、稳定剂1-3％、保护剂2-5％，硅藻土余量。8.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5作为棉花枯萎病病害拮抗菌的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌rjw-5-5制成可湿性粉剂，应用方式为叶面喷雾，喷雾最佳时间为棉花叶片出现零星病斑时开始进行第一次喷雾处理，用水稀释500倍，用量100g/667m2。
技术总结本发明涉及一种用于棉花枯萎病防治的贝莱斯芽孢杆菌菌株RJW-5-5，其属于芽孢杆菌属，其命名为Bacillus velezensis RJW-5-5；保藏登记号为CGMCC No.22939；保藏时间为2021年07月22日；保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株的菌落形态为椭圆形或圆形，颜色为乳白色，质地粘稠，边缘粗糙。本发明涉及的生防菌株生产工艺简单、培养时间较短，并且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治棉花枯萎病的生防菌剂。通过试验证明，本发明提供的生物菌剂具有很好的防治效果，温室防效可达到82.79％，田间防效可达到80.44％，显著高于对照，进一步提高棉花品质和产量。棉花品质和产量。棉花品质和产量。
技术研发人员：李景壮 姜河 李敏 段新新
受保护的技术使用者：陕西嘉益蓝德生物工程有限公司
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/4
