1.本发明涉及一种将光合微生物进行基因工程修饰，从而通过光合作用直接利用co2高效生产聚乳酸及乳酸共聚物的技术，属于生物技术领域。
背景技术：2.传统塑料主要以石油为原料，通过聚合反应生成高分子状态化合物，在工业生产和日常生活中广泛应用。不过，传统塑料几乎难以降解，其大量使用引发了对生态环境危害极大的“白色污染”以及石油危机。聚乳酸（pla）是一种以可再生资源为原料，通过发酵、糖化、聚合而成的可降解塑料。这种“源于自然，归于自然”的材料可以满足可持续发展的需要，可以取代传统的石油基材料，具有巨大的发展潜力。近年来，pla已经广泛用于包装、医药材料、食品工程和纺织工业等诸多领域。目前商业化的pla生产主要是通过发酵-化学聚合法，由微生物发酵产生乳酸，然后通过化学方法将乳酸聚合为均聚物或共聚物。为了改善pla的脆性，可以通过加入伸长性较好的3-羟基丙酸酯（3hp）等，生产聚3-羟基丙酸乳酸酯（p( 3hp-co-la)）等乳酸共聚物。但是，化学聚合流程长溶剂消耗多，导致产品的收率较低以及污染环境，并且会难以除去链偶联剂，限制了pla及其共聚物的进一步应用。
3.随着合成生物学和代谢工程等生物技术的快速发展，pla全生物法制备也出现了新的契机，可以实现乳酸在胞内的直接聚合。2010年，jung等人利用基因工程大肠杆菌将葡萄糖直接转化pla，合成的pla可达细胞干重的11％（jung, y. k., kim, t. y., park, s. j., lee, s. y. metabolic engineering of escherichia coli for the production of polylactic acid and its copolymers. biotechnol. bioeng. 2010, 105: 161-171）；2016年，choi等人利用改造的大肠杆菌将葡萄糖和木糖转化为聚羟乙酸乳酸酯共聚物，发酵产量达细胞干重的40％（choi, s. y., et al. one-step fermentative production of poly (lactate-co-glycolate) from carbohydrates in escherichia coli. nat. biotechnol. 2016, 34: 435-440）；2019年，hori等人利用改造的大肠杆菌将葡萄糖和木糖转化为聚3-羟基丙酸乳酸酯共聚物，发酵产量达细胞干重的44％（hori, c., et al. high-cell density culture of poly (lactate-co-3-hydroxybutyrate)-producing escherichia coli by using glucose/xylose-switching fed-batch jar fermentation. j. biosci. bioeng. 2019, 127: 721-725）。尽管这些研究在微生物中成功引入了pla或其共聚物的合成途径，但生产过程会排放温室气体，并需要添加大量的碳水化合物或者昂贵的前体物质，生产成本较高，离工业化应用还有很长一段距离。因此，寻求经济可持续的pla及其共聚物的绿色生产方法仍然是一个巨大的挑战。
4.
技术实现要素：5.有鉴于现有技术的上述不足，本发明提供了一种负碳合成聚乳酸及乳酸共聚物的技术，本发明提供的基因工程光合微生物可以直接转化温室气体co2来生产pla及其共聚
物，避免了碳水化合物、昂贵前体物质和诱导剂的使用。
6.本发明采取的技术方案是：一种光合微生物，所述光合微生物中含有若干外源基因，所述外源基因包括丙酰-辅酶a转移酶的编码基因、聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因和d-乳酸脱氢酶的编码基因。
7.进一步的改进，所述丙酰-辅酶a转移酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述d-乳酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
8.进一步的改进，所述外源基因包括还包括丙酮酸脱氢酶的编码基因和乙酰辅酶a合酶的编码基因；所述丙酮酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述乙酰辅酶a合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。
9.进一步的改进，所述外源基因包括还包括β-酮硫解酶的编码基因和乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因；所述β-酮硫解酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:6所示，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。
10.进一步的改进，所述外源基因包括还包括丙酮酸脱氢酶的编码基因和乙酰辅酶a合酶的编码基因；丙酮酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，乙酰辅酶a合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。
11.进一步的改进，所述外源基因包括还包括丙二酰-辅酶a还原酶的编码基因和丙酰辅酶a合成酶基因acs区域的编码基因；丙二酰-辅酶a还原酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:8所示；所述丙酰辅酶a合成酶基因acs区域的编码基因的核苷酸序列如seq id no:9所示。
12.进一步的改进，所述外源基因包括还包括丙酮酸脱氢酶的编码基因和乙酰辅酶a合酶的编码基因；丙酮酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，乙酰辅酶a合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。
13.进一步的改进，所述光合微生物选自选自聚球藻属、集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属、鞭枝藻属、衣藻属、小球藻属和微拟球藻属。
14.进一步的改进，所述野生光合微生物为聚球藻（synechococcus elongatus pcc7942）。
15.上述述的光合微生物用于将co2转化为pla及乳酸共聚物。
16.一种质粒，其特征在于，所述质粒上含有上述外源基因的核苷酸序列或与所述外源基因互补的核苷酸序列；所述质粒上的外源基因串联形成串联结构；串联结构中第一个基因可操作地连接的组成型启动子，或是所述串联结构上每个基因各自独立带有可操作地连接的组成型启动子；所述组成型启动子为psba2启动子。。
17.外源基因通过串联在质粒中导入野生蓝藻的基因组dna。
18.进一步的改进，串联表达的外源基因结构含有一个与串联结构中第一个基因可操作地连接的启动子，或是所述串联结构上每个基因各自独立带有可操作地连接的启动子。
19.进一步的改进，所述启动子为psba2启动子。
20.其中，所述的pct来源于丙酸梭菌；所述的phac来源于假单胞菌；
所述的d-ldh来源于德氏乳杆菌；所述的pdha来源于聚球藻；所述的acs来源于聚球藻；所述的phab来源于钩虫贪铜菌；所述的phaa来源于钩虫贪铜菌；所述的mcr来源于橙色绿屈挠菌；所述的pcsa来源于橙色绿屈挠菌。
21.本发明还提供了本发明所提供的基因工程蓝藻在生产pla及乳酸共聚物中的应用。
22.本发明的有益效果为：本发明对蓝藻进行遗传改造，将pla或其共聚物的合成途径在蓝藻中重构，获得的基因工程菌可以将取之不尽的太阳能和温室气体co2直接转化为pla及乳酸共聚物，避免了碳水和化合物的消耗和昂贵前体的使用。在本发明的具体实施例中，经过培养，基因工程蓝藻可以产生最高264 mg/l的pla，130 mg/l的p(3hb-co-la)，162 mg/l的p(3hp-co-la)。这些物质高性能的生物基可降解材料，具有广泛的工业应用前景。本发明提供应用方法降低了底物成本，还可以吸收温室气体co2，具有重要的现实意义和工业应用价值。
23.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
24.附图说明
25.图1 是本发明实施例 5中外源基因整合示意图。
26.图2 是本发明实施例6、7和8中工程菌株中pla和乳酸共聚物的合成途径示意图。
27.具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.本发明使用的菌株和生长条件如下：克隆宿主dh5α购自invitrogen公司，所有大肠杆菌在含有100 mg/l壮观霉素的lb培养基中，37
ꢀ°
c培养。
30.聚球藻（synechococcus elongatus）pcc7942购自美国模式培养物集存库（american type culture collection）。构建阶段，聚球藻pcc7942在bg11液体培养基中生长，固体培养基中添加1.5%的琼脂粉，培养条件：32
°
c，光强100 μe
·
s-1
·
m-2
，并连续通入1%体积比co2气体。对于转化后的工程菌在生产pla及乳酸共聚物时用5xbg培养基培养，添加20 mg/l壮观霉素，培养条件：32
°
c，连续通入3%体积比co2气体，光强最初80 μe
·
s-1
·
m-2
，1天后150 μe
·
s-1
·
m-2
，2天后提高至400 μe
·
s-1
·
m-2
。
31.其中，所述lb培养基配方是：蛋白胨 10 g/l，酵母膏 5 g/l, nacl 10 g/l, ph 7.0；所述bg11液体培养基配方是：10 ml bg11母液，1 ml柠檬酸铁铵溶液（6 g/l），1 ml na2co3溶液（20 g/l），1 ml k2hpo4溶液（30.5 g/l），水定容至1l；上述bg11母液的配方是：149.6 g nano3，7.5 g mgso4·
7h2o，3.6 g cacl2·
2h2o，0.6 g 柠檬酸，1.12 ml na2edta溶液（ph 8.0，浓度0.25 m），100 ml微量元素溶液，水定容至1l；上述bg11微量元素溶液的配方是：2.86 g h3bo3，1.81 g mncl2·
7h2o，0.22 g znso4·
7h2o，0.39 g na2moo4·
2h2o，0.079 g cuso4·
5h2o，0.049 g co(no3)2·
6h2o，水定容至1l；所述5xbg液体培养基配方是：50 ml bg11母液，1 ml柠檬酸铁铵溶液（60 g/l），2 ml na2co3溶液（100 g/l），1 ml k2hpo4溶液（152.5 g/l），水定容至1l；所有质粒均为psyn_6（购自invitrogen公司）衍生质粒，用于通过同源重组整合到集胞藻pcc7942基因组中表达目的基因。
32.实施例1构建表达质粒psyn-pct-phac-ldh：（1）提取psyn_6质粒：将含有psyn_6质粒的大肠杆菌dh5α按照2%接种量，接种至5 ml 含有100 mg/l壮观霉素的lb液体培养基中，在37 °
c培养箱中培养12 h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司），参照说明书中描述的方法提取质粒。
33.（2）合成丙酰-辅酶a转移酶基因（pct）片段、聚羟基脂肪酸酯合酶基因（phac）片段和d-乳酸脱氢酶基因（ldh）片段：利用在线软件jcat，根据聚球藻pcc7942的密码子偏好性将丙酸梭菌（clostridium propionicum）中pct的编码基因pct进行密码子优化，优化后pct的核苷酸序列如seq id no:1所示；将假单胞菌（pseudomonas sp.）中phac的编码基因phac进行密码子优化，优化后phac的核苷酸序列如seq id no:2所示；将德氏乳杆菌（lactobacillus delbrueckii）中d-ldh的编码基因ldh进行密码子优化，优化后ldh的核苷酸序列如seq id no:3所示。在phac前端加上sd序列5
′‑
aaagaggagaaatactag-3
′
，在ldh前端加上sd序列5
′‑
attaaagaggagaatctaga-3
′
，将这些序列送金唯智公司（genewiz）进行基因合成。
34.（3）扩增pct-phac-ldh基因片段：利用步骤（2）中合成的pct基因作为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行重组pcr扩增。
35.pcr引物：上游引物pct-f：5
′‑
aaggagcgtcagatctcatatgcgcaaggttccgattat-3
′
，下游引物pct-r：5
′‑
catctagtatttctcctctttttaggacttcatttccttcagacc-3
′
。
36.利用步骤（2）中合成的phac基因作为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行重组pcr扩增。
37.pcr引物：上游引物phac-f：5
′‑
taaaaagaggagaaatactagatgtctaacaag-3
′
，下游引物phac-r：5
′‑
cattctagattctcctctttaatttaacgttcgtgcacgtaggtg-3
′
。
38.利用步骤（2）中合成的ldh基因作为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描
述的方法进行重组pcr扩增。
39.pcr引物：上游引物ldh-f：5
′‑
taaattaaagaggagaatctagatgactaaaatt-3
′
，下游引物ldh-r：5
′‑
ccgcggatccgggaattcgaagcttttagccaaccttaaccggagttt-3
′
。
40.将得到的pcr产物用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit，参照说明书中描述的方法对dna片段进行切胶回收。
41.利用上述扩增得到的pct, phac和ldh基因片段作为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行重组pcr扩增。
42.pcr引物：上游引物pct-f：5
′‑
aaggagcgtcagatctcatatgcgcaaggttccgattat-3
′
，下游引物ldh-r：5
′‑
ccgcggatccgggaattcgaagcttttagccaaccttaaccggagttt-3
′
。
43.将得到的pcr产物用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit，参照说明书中描述的方法对dna片段进行切胶回收，获得pct-phac-ldh基因片段。
44.（4）将步骤（1）中提取的psyn_6质粒用neb限制性内切酶ndei和hindiii进行双酶切，将酶切后的质粒用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit参照说明书中描述的方法进行回收。将步骤（3）中得到的pct-phac-ldh基因片段和回收的psyn_6质粒用诺唯赞公司（vazyme）的clonexpress ultra one step cloning kit参照说明书中描述的方法进行无缝克隆，获得重组质粒psyn-pct-phac-ldh。
45.实施例2构建表达质粒psyn-pct-phac-ldh-pdha-acs：（1）扩增丙酮酸脱氢酶基因（pdha）片段和乙酰辅酶a合酶基因（acs）片段：采用常规的方法制备聚球藻pcc7942的基因组dna，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；利用聚球藻pcc7942基因组为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行pcr扩增。
46.pcr引物：pdha基因上游引物pdha-f：5
′‑
gagcgtcagatctcatatggttcaggaacgtacactgc-3
′
，下游引物pdha-r：5
′‑
cattctagattctcctctttaatttagtcttctgcccagatgtagc-3
′
；acs基因上游引物acs-f：5
′‑
taaattaaagaggagaatctagaatgagccagccaacgatcg-3
′
，下游引物acs-r：5
′‑
gggtttgcctggtaccgcggttaagtgccttgacgcagctta-3
′
。
47.将pcr得到的pdha基因片段和acs基因片段用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit，参照说明书中描述的方法对dna片段进行切胶回收。
48.（2）扩增psba2启动子：利用psyn_6质粒为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行pcr扩增。
49.pcr引物：psba2启动子上游引物psba2-f：psba2-f：5
′‑
gttggctaaaagcttcgaattcggctggctatttagcgtcttcta-3
′
，下游引物psba2-r：5
′‑
tacgttcctgaaccatatgagatctgacgctccttcgag-3
′
。
50.将得到的pcr产物用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit，参照说明书中描述的方法对dna片段进行切胶回收。
51.（3）利用步骤（1）扩增得到的pdha基因片段、acs基因片段和步骤（2）扩增得到的psba2启动子作为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行重组pcr扩
cloning kit参照说明书中描述的方法进行无缝克隆，获得重组质粒psyn-pct-phac-ldh-phaab-pdha-acs。
61.实施例4构建表达质粒psyn-pct-phac-ldh-mcr-pcs'和psyn-pct-phac-ldh-mcr-pcs'-pdha-acs：（1）合成丙二酰-辅酶a还原酶和丙酰辅酶a合成酶acs区域（mcr
‑ꢀ
pcs'）片段：利用在线软件jcat，根据聚球藻pcc7942的密码子偏好性将橙色绿屈挠菌（chloroflexus aurantiacus）中mcr的编码基因mcr和pcsa的编码基因pcs'进行密码子优化，优化后mcr的核苷酸序列如seq id no:8所示，优化后pcs'的核苷酸序列如seq id no:9所示。将mcr和pcs'序列相连，并在前端加上psba2序列5
′‑
ttaaggttggctaaaagcttggctggctatttagcgtcttctaatccagtgtagacagtagttttggctccgttgagcactgtagccttgggcgatcgctctaaacattacataaattcacaaaagttttcgttacataaaaatagtgtctacttagctaaaaattaagggttttttacacctttttgacagttaatctcctagcctaaaaagcaagagtttttaactaagactcttgccctttacaacctcgaaggagcgtcagatctcat-3
′
，后端加上5
′‑
gaattcccggatccgcggta-3
′
，送金唯智公司（genewiz）进行基因合成组合序列mcr-pcs'。
62.（2）将实施例1步骤（4）中的重组质粒psyn-pct-phac-ldh用neb限制性内切酶hindiii和ecori进行双酶切，将酶切后的质粒用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit参照说明书中描述的方法进行回收。将步骤（1）中得到的mcr-pcs'基因片段和回收psyn-pct-phac-ldh质粒用诺唯赞公司（vazyme）的clonexpress ultra one step cloning kit参照说明书中描述的方法进行无缝克隆，获得重组质粒psyn-pct-phac-ldh-mcr-pcs'。
63.（3）利用实施例2步骤（3）中的pdha-acs片段为模板，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行pcr扩增。
64.pcr引物：上游引物psba23-f：5
′‑
caagatcgctgagtaagaattcggctggctatttagcgtcttcta-3
′
，下游引物acs-r：5
′‑
gggtttgcctggtaccgcggttaagtgccttgacgcagctta-3
′
。
65.将得到的pcr产物用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit，参照说明书中描述的方法对dna片段进行切胶回收，获得pdha-acs2片段。
66.（4）将步骤（2）中的重组质粒psyn-pct-phac-ldh-phaab用neb限制性内切酶ecori和bamhi进行双酶切，将酶切后的质粒用axygen公司的axyprep dna gel extraction kit参照说明书中描述的方法进行回收。将步骤（3）中得到的pdha-acs2基因片段和回收psyn-pct-phac-ldh-phaab质粒用诺唯赞公司（vazyme）的clonexpress ultra one step cloning kit参照说明书中描述的方法进行无缝克隆，获得重组质粒psyn-pct-phac-ldh-mcr-pcs'-pdha-acs。
67.实施例5蓝藻的转化及基因工程蓝藻的获得：（1）蓝藻菌株转化：取处于对数生长期（od
730
至0.4-0.8）的蓝藻细胞10 ml，5000 转/分钟离心5分钟后收集菌体，用无菌的10 mm nacl洗涤一次，再用5 ml 新鲜的bg11培养基将菌体重悬。取500 ul菌液至ep管中，加入终浓度为100 ng/ml的重组质粒，混匀后，30℃避光培养12-18小
时。将蓝藻细胞与重组质粒dna的混合物涂布于bg11固体培养基（含有20μg/ml壮观霉素），置于32℃、100μe
·
s-1
·
m-2
的光强度下连续光照培养10-14天，至固体培养基上出现单菌落。
68.（2）基因工程蓝藻的获得：从步骤（1）所述转化后的固体培养基上挑取转化子，接入5ml新鲜的bg11液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素），置于32℃、100μe
·
s-1
·
m-2
的光强度下连续光照培养7-10天。采用常规的方法制备基因工程蓝藻的基因组dna，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；利用基因工程蓝藻基因组为模板，以转入重组质粒上外源基因的扩增引物，根据《分子克隆实验指南（第三版）》中描述的方法进行pcr扩增验证。
69.重组质粒psyn-pct-phac-ldh，psyn-pct-phac-ldh-pdha-acs，psyn-pct-phac-ldh-phaab，psyn-pct-phac-ldh-phaab-pdha-acs，psyn-pct-phac-ldh-mcr-pcs'和psyn-pct-phac-ldh-mcr-pcs'-pdha-acs上的外源基因通过同源重组整合至集胞藻pcc7942基因组的中性位点1（nsi）上，如图1所示，分别获得基因工程蓝藻s-pla1，s-pla2，s-pla3，s-pla4，s-pla5和s-pla6。
70.（3）基因工程蓝藻的保存：将步骤（2）获得的基因工程蓝藻接种于含有20μg/ml壮观霉素的bg11液体培养基中，置于32℃、100μe
·
s-1
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m-2
的光强度下连续光照培养7-10天；在无菌操作下，取过夜培养物1ml加入到灭菌的1.5ml离心管中，5000转/分钟离心3min。丢弃上清，用灭菌的15％甘油溶液将菌体沉淀重悬，制备成为甘油保藏管，于-20℃冰箱中可保存半年至一年。每隔半年，取出甘油保藏管中保存的基因工程蓝藻进行活化，并重新保存甘油保藏管。
71.实施例6利用基因工程蓝藻s-pla1或s-pla2生产pla：（1）固体培养：将基因工程蓝藻s-pla1或s-pla2接种到含有20μg/ml壮观霉素的bg11固体培养基上，32℃、100μe
·
s-1
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m-2
的光强度下连续光照培养10-15天。
72.（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株s-pla1或s-pla2，接种到50ml5xbg液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素）中进行菌株活化，30℃、100μe
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s-1
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m-2
的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子。
73.（3）发酵培养：按照1％（体积比）接种量将步骤（2）中得到的种子接种到平板式光照反应器中，用5xbg液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素）中扩大培养，培养条件：32
°
c，连续通入3%体积比co2气体，光强最初80μe
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m-2
，1天后150μe
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m-2
，2天后提高至400μe
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，培养5-8天。
74.（4）样品处理和检测：如图2所示，s-pla1或s-pla2中具有pla的合成路径，可以生产pla。将步骤（3）的培养液8000rpm/min离心10min收集菌体，然后用去离子水洗涤、离心。将得到的沉淀真空冰冻干燥至恒重，测定细胞干重(celldryweight,cdw)，培养体系中的细胞干重达到7.2g/l。取50mg干细胞于酯化管中，加入2ml氯仿和2ml酯化液(2g/l苯甲酸，3%(v/v)浓硫酸的甲醇溶液)，酯化4h。加入1ml去离子水，充分振荡混匀，取氯仿相进行gc-ms分析，利用内标法计算干细胞中聚合物的组成和含量。pla产量最高可达到264mg/l（36.7mg/gdcw），光合生产pla的重均分子量达到50kda以上。
75.实施例7利用基因工程蓝藻s-pla3或s-pla4生产p(3hb-co-la)：（1）固体培养：将基因工程蓝藻s-pla3或s-pla4接种到含有20μg/ml壮观霉素的bg11固体培养基上，32℃、100μe
·
s-1
·
m-2
的光强度下连续光照培养10-15天。
76.（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株s-pla1或s-pla2，接种到50ml5xbg液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素）中进行菌株活化，30℃、100μe
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s-1
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m-2
的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子。
77.（3）发酵培养：按照1％（体积比）接种量将步骤（2）中得到的种子接种到平板式光照反应器中，用5xbg液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素）中扩大培养，培养条件：32
°
c，连续通入3%体积比co2气体，光强最初80μe
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s-1
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m-2
，1天后150μe
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s-1
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m-2
，2天后提高至400μe
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s-1
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m-2
，培养5-8天。
78.（4）样品处理和检测：将步骤（3）的培养液8000rpm/min离心10min收集菌体，然后用去离子水洗涤、离心。将得到的沉淀真空冰冻干燥至恒重，测定细胞干重(celldryweight,cdw)，培养体系中的细胞干重达到6.9g/l。取50mg干细胞于酯化管中，加入2ml氯仿和2ml酯化液(2g/l苯甲酸，3%(v/v)浓硫酸的甲醇溶液)，酯化4h。加入1ml去离子水，充分振荡混匀，取氯仿相进行gc-ms分析，利用内标法计算干细胞中聚合物的组成和含量。p(3hb-co-la)产量最高可达到130mg/l（18.9mg/gdcw），p(3hb-co-la)的重均分子量达到100kda以上，乳酸单体的比例接近40mol%。
79.实施例8利用基因工程蓝藻s-pla5或s-pla6生产p(3hp-co-la)：（1）固体培养：将基因工程蓝藻s-pla3或s-pla4接种到含有20μg/ml壮观霉素的bg11固体培养基上，32℃、100μe
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s-1
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m-2
的光强度下连续光照培养10-15天。
80.（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株s-pla1或s-pla2，接种到50ml5xbg液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素）中进行菌株活化，30℃、100μe
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s-1
·
m-2
的光强度下连续光照培养7-10天，制得种子。
81.（3）发酵培养：按照1％（体积比）接种量将步骤（2）中得到的种子接种到平板式光照反应器中，用5xbg液体培养基（含有20μg/ml壮观霉素）中扩大培养，培养条件：32
°
c，连续通入3%体积比co2气体，光强最初80μe
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s-1
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m-2
，1天后150μe
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s-1
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m-2
，2天后提高至400μe
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s-1
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m-2
，培养5-8天。
82.（4）样品处理和检测：将步骤（3）的培养液8000rpm/min离心10min收集菌体，然后用去离子水洗涤、离心。将得到的沉淀真空冰冻干燥至恒重，测定细胞干重(celldryweight,cdw)，培养体系中的细胞干重达到6.6g/l。取50mg干细胞于酯化管中，加入2ml氯仿和2ml酯化液(2g/l苯甲酸，3%(v/v)浓硫酸的甲醇溶液)，酯化4h。加入1ml去离子水，充分振荡混匀，取氯仿相进行gc-ms分析，利用内标法计算干细胞中聚合物的组成和含量。p(3hp-co-la)产量最高可达到162mg/l（24.5mg/gdcw），p(3hp-co-la)的重均分子量达到70kda以上，乳酸单体的比例接近60mol%。
83.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术
方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
技术特征：1.一种光合微生物，其特征在于，所述光合微生物中含有若干外源基因，所述外源基因包括丙酰-辅酶a转移酶的编码基因、聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因和d-乳酸脱氢酶的编码基因。2.如权利要求1所述的光合微生物，其特征在于，所述丙酰-辅酶a转移酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述d-乳酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。3.如权利要求1所述的光合微生物，其特征在于，所述外源基因包括还包括丙酮酸脱氢酶的编码基因和乙酰辅酶a合酶的编码基因；所述丙酮酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述乙酰辅酶a合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。4.如权利要求1所述的光合微生物，其特征在于，所述外源基因包括还包括β-酮硫解酶的编码基因和乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因；所述β-酮硫解酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:6所示，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。5.如权利要求4所述的光合微生物，其特征在于，所述外源基因包括还包括丙酮酸脱氢酶的编码基因和乙酰辅酶a合酶的编码基因；丙酮酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，乙酰辅酶a合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。6.如权利要求1所述的光合微生物，其特征在于，所述外源基因包括还包括丙二酰-辅酶a还原酶的编码基因和丙酰辅酶a合成酶基因acs区域的编码基因；丙二酰-辅酶a还原酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:8所示；所述丙酰辅酶a合成酶基因acs区域的编码基因的核苷酸序列如seq id no:9所示。7.如权利要求6所述的光合微生物，其特征在于，所述外源基因包括还包括丙酮酸脱氢酶的编码基因和乙酰辅酶a合酶的编码基因；丙酮酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示，乙酰辅酶a合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。8.如权利要求1-7任一所述的光合微生物，其特征在于，所述光合微生物选自选自聚球藻属、集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属、鞭枝藻属、衣藻属、小球藻属和微拟球藻属。9.如权利要求1-7任一所述的光合微生物用于将co2转化为pla及乳酸共聚物。10.一种质粒，其特征在于，所述质粒上含有权利要求1-7任一所述外源基因的核苷酸序列或与所述外源基因互补的核苷酸序列；所述质粒上的外源基因串联形成串联结构；串联结构中第一个基因可操作地连接的组成型启动子，或是所述串联结构上每个基因各自独立带有可操作地连接的组成型启动子；所述组成型启动子为psba2启动子。
技术总结本发明公开了一种光合微生物及其用途和质粒，所述光合微生物中含有若干外源基因，所述外源基因包括丙酰-辅酶A转移酶的编码基因、聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因和d-乳酸脱氢酶的编码基因。本发明提供的基因工程蓝藻可以通过光合作用直接利用温室气体CO2高效生产聚乳酸（PLA）及乳酸共聚物，避免了碳水化合物和昂贵前体的的消耗，以及诱导剂的使用。本发明还提供了该基因工程蓝藻的应用，尤其是在生产PLA及共聚物中的应用，为可降解塑料的生产开辟了新的技术，降低了生产成本，具有重要的应用前景。用前景。用前景。
技术研发人员：邵慧 阎冬 郑集杨
受保护的技术使用者：上海光玥生物科技有限公司
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/5
