1.本发明涉及微生物降解技术领域，具体涉及一种采用白腐真菌降解吡虫啉的方法。
背景技术：2.吡虫啉(imidacloprid，imi)，化学名为1-(6-氯吡啶-3-基甲基)-n-硝基亚咪唑烷-2-基胺，是一种新烟碱类杀虫剂。新烟碱类杀虫剂自上市以来发展迅猛，已经成为全球最常用的一类杀虫剂，在120多个国家被注册和使用，占全球杀虫剂使用量的四分之一，在维持作物产量方面发挥了重要作用。吡虫啉是新烟碱类杀虫剂的首款产品，于1991年上市，由于活性强、抗雨性强且易于种子处理而逐渐成为使用最广泛的新烟碱类杀虫剂之一。然而，新烟碱类化合物的化学性质相对稳定，并且水溶性较高，可以通过多种方式迁移到水生系统中。根据各种研究，吡虫啉在加拿大、美国、西班牙、孟加拉国和中国的地表径流和水生系统中被越来越多地检测到，同时也有多项研究表明吡虫啉会对一些非靶标生物造成严重危害。研究表明吡虫啉对蜜蜂具有高毒性，可引起“蜂群崩溃综合征”，导致蜜蜂失踪以及大量死亡，进而引发了相关国家发生了严重的农作物授粉危机，导致农作物(如大豆、向日葵等)大量减产。也有其他研究显示吡虫啉对于鸟类、水生生物和哺乳动物也会造成直接或间接的危害，随着生物链的累积对人体健康也存在严重威胁。吡虫啉会影响肝脏、甲状腺和身体体重，而暴露在高剂量吡虫啉环境中除了会对心血管和血液系统造成影响外，还会导致身体各重要器官的退行性变化。因此，开展对于吡虫啉所造成环境污染的修复工作是十分有必要的。
3.由吡虫啉带来的环境问题受到人们关注后，现有技术也出现了多种修复技术，包括化学氧化、物理吸附、微生物降解、光催化剂等多种方法。由于大多数农药的量子效率较低，直接光解的效果并不是很理想。而包括高级氧化和臭氧氧化在内的化学氧化法会产生毒性更强的次生产物，也并不适用于吡虫啉污染环境的实际修复应用。在微生物降解方面，由南京师范大学首次报道了细菌stenotrophomonas maltophilia对吡虫啉的强降解能力，并提出该细菌可利用共代谢作用提高吡虫啉的降解能力，虽然利用该细菌降解吡虫啉无二次污染，但细菌只能降解高浓度的有机污染物，并且不能使其完全矿化。
技术实现要素：4.针对上述问题，本发明提供一种采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，以解决低浓度的吡虫啉的高效降解问题。
5.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
6.一种采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，包括以下步骤：
7.(1)传代培养
8.将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；
9.(2)静置培养
10.在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出菌丝片，并接种到液体培养基中，所述液体培养基为土豆葡萄糖液体培养基或kirk液体培养基；
11.所述kirk液体培养基的组成为：按每升计，包括10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、1g tween 80和100mlkirk盐溶液，所述tween 80在振荡培养时加入；
12.所述kirk盐溶液的组成为：按每升计，包括20g kh2po4，5g mgso4·
7h2o，1.3g cacl2·
2h2o，0.01g盐酸硫铵，16.7mlkirk微量元素溶液；
13.所述kirk微量元素溶液的组成为：按每升计，包括9g次氮基三乙酸三钠，3g mgso4·
7h2o，4.2g mnso4·
h2o，6g nacl，0.6g feso4·
7h2o，1.1g coso4·
7h2o，1.1g znso4·
7h2o，0.6g cacl2·
2h2o，0.06g cuso4·
5h2o，0.11galk(so4)2·
12h2o，0.06g h3bo3，0.07gna2moo4·
2h2o；
14.(3)降解培养
15.所述白腐真菌yk-624在所述液体培养基中振荡培养设定的时间后，加入含吡虫啉的溶液并继续培养。
16.优选的，所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂。
17.优选的，所述菌丝片的直径为10mm，所述液体培养基的体积为10ml。
18.优选的，所述土豆葡萄糖液体培养基按质量分数计，包括20％的土豆和2％的葡萄糖。
19.优选的，所述静置培养的时间为3d。
20.优选的，所述降解培养的时间为20d。
21.本发明的有益效果为：
22.1、本发明提供的方法，采用降解能力高于模式菌的白腐真菌yk-624，可在液体培养基有效降解吡虫啉，基于白腐真菌容易获得且生长繁殖速度较快的优势，本发明所述降解方法可以有效降解吡虫啉，在优选的kirk液体培养基中，其降解率高达89.4％，其降解效率及降解率均显著由于现有技术的其他方案。
23.2、本发明提供的白腐真菌并且结合恰当的工艺条件，凭其独特的细胞外解毒机制，使其不但能承受并降解中高浓度的有机污染物，而且还能够降解较低浓度的吡虫啉等有机污染物，并能使其完全矿化；可以被应用到低浓度污染物引发的污水治理、大气污染治理、土壤污染控制等环境领域。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明作进一步描述。
25.实施例1
26.本实施例提供的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，包括以下步骤：
27.(1)传代培养
28.将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂，余量为水；
29.(2)静置培养
30.在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出2块直径为10mm的菌丝片，并接种到装有10ml液体培养基的100ml锥形瓶中，所述液体培养基为kirk液体培养基；
31.所述kirk液体培养基的组成为：按每升计，包括10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、1g tween 80和100mlkirk盐溶液，所述tween 80在振荡培养时加入；
32.所述kirk盐溶液的组成为：按每升计，包括20g kh2po4，5g mgso4·
7h2o，1.3g cacl2·
2h2o，0.01g盐酸硫铵，16.7mlkirk微量元素溶液；
33.所述kirk微量元素溶液的组成为：按每升计，包括9g次氮基三乙酸三钠，3g mgso4·
7h2o，4.2g mnso4·
h2o，6g nacl，0.6g feso4·
7h2o，1.1g coso4·
7h2o，1.1g znso4·
7h2o，0.6gcacl2·
2h2o，0.06g cuso4·
5h2o，0.11galk(so4)2·
12h2o，0.06g h3bo3，0.07gna2moo4·
2h2o；
34.(3)降解培养
35.所述白腐真菌yk-624在所述液体培养基中振荡培养3d后，加入初始浓度为100μm的吡虫啉溶液并继续培养，培养时间20d。
36.本发明采用的白腐真菌phanerochaete sordidayk-624，分离于日本屋久岛腐朽木材上，本发明实施例进一步采用巧妙的工艺步骤，证明了它对解吡虫啉、黄曲霉素等众多有机污染物的降解能力高于模式菌，降解产物的毒性也大大降低，在降解有机污染物中具有广阔的应用前景。
37.本发明实施例采用降解能力高于模式菌的白腐真菌yk-624，可在液体培养基有效降解吡虫啉，基于白腐真菌容易获得且生长繁殖速度快的优势，本发明所述降解方法可以有效降解吡虫啉，且不易产生二次污染，在优选的kirk液体培养基中，其降解率高达89.4％。
38.实施例2
39.本实施例提供的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，包括以下步骤：
40.(1)传代培养
41.将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂，余量为水；
42.(2)静置培养
43.在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出2块直径为10mm的菌丝片，并接种到装有10ml液体培养基的100ml锥形瓶中，所述液体培养基为土豆葡萄糖液体培养基；
44.所述土豆葡萄糖液体培养基按质量分数计，包括20％的土豆和2％的葡萄糖，余量为水；
45.(3)降解培养
46.所述白腐真菌yk-624在所述液体培养基中培养3d后，加入初始浓度为100μm的吡虫啉溶液并继续培养，培养时间20d。
47.实验例
48.分别测定实施例1、实施例2所述方法对吡虫啉的降解率，测定方法如下：
49.降解培养完成后，向锥形瓶中加入20ml丙酮和内标物质，利用均质机将降解体系中的菌体打碎，分离培养液，旋转蒸发浓缩后利用高效液相色谱仪进行定量分析。
50.定量分析结果表明，白腐真菌yk-624在土豆葡萄糖液体培养基中对吡虫啉的降解率为8.2％，在kirk培养基中对吡虫啉的降解率达89.4％。
51.需要特别说明的是，其他实施例中，在本发明记载的组分、配比及工艺参数范围内，具体选择其他的组分、配比或者取值，均可以实现本发明记载的技术效果，故不再一一将其列出。
52.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
技术特征：1.一种采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)传代培养将白腐真菌yk-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；(2)静置培养在传代培养的土豆葡萄糖琼脂培养基中截取出菌丝片，并接种到液体培养基中，所述液体培养基为土豆葡萄糖液体培养基或kirk液体培养基；所述kirk液体培养基的组成为：按每升计，包括10g葡萄糖、0.221g酒石酸铵、1.64g无水乙酸钠、1g tween 80和100mlkirk盐溶液，所述tween 80在振荡培养时加入；所述kirk盐溶液的组成为：按每升计，包括20g kh2po4，5g mgso4·
7h2o，1.3g cacl2·
2h2o，0.01g盐酸硫铵，16.7mlkirk微量元素溶液；所述kirk微量元素溶液的组成为：按每升计，包括9g次氮基三乙酸三钠，3g mgso4·
7h2o，4.2g mnso4·
h2o，6g nacl，0.6g feso4·
7h2o，1.1g coso4·
7h2o，1.1g znso4·
7h2o，0.6g cacl2·
2h2o，0.06g cuso4·
5h2o，0.11galk(so4)2·
12h2o，0.06g h3bo3，0.07gna2moo4·
2h2o；(3)降解培养所述白腐真菌yk-624在所述液体培养基中振荡培养设定的时间后，加入含吡虫啉的溶液并继续培养。2.根据权利要求1所述的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其特征在于，所述土豆葡萄糖琼脂培养基按质量分数计，包括20％的土豆、2％的葡萄糖和2％的琼脂。3.根据权利要求1所述的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其特征在于，所述菌丝片的直径为10mm，所述液体培养基的体积为10ml。4.根据权利要求1所述的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其特征在于，所述土豆葡萄糖液体培养基按质量分数计，包括20％的土豆和2％的葡萄糖。5.根据权利要求1所述的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其特征在于，所述静置培养的时间为3d。6.根据权利要求1所述的采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其特征在于，所述降解培养的时间为20d。
技术总结本发明属于微生物降解技术领域，公开了一种采用白腐真菌降解吡虫啉的方法，其包括以下步骤：(1)将白腐真菌YK-624接种培养在土豆葡萄糖琼脂培养基中进行传代扩大培养；(2)在传代培养的培养基中截取出菌丝片，并接种到液体培养基中静置培养；(3)所述白腐真菌YK-624在所述液体培养基中培养设定的时间后，加入含吡虫啉的溶液并继续培养。本发明采用降解能力高于模式菌的白腐真菌YK-624，可在液体培养基有效降解吡虫啉，基于白腐真菌容易获得且生长繁殖速度快的优势，本发明所述降解方法可以有效降解吡虫啉，且不易产生二次污染，在优选的Kirk液体培养基中，其降解率高达89.4％。其降解率高达89.4％。
技术研发人员：王剑桥 张雪 刘依林
受保护的技术使用者：广州大学
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/7/5
