1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及种将脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法。
背景技术：2.神经系统变性疾病属于临床中一类进行性中枢神经系统疾病，主要是由于系统性特殊神经细胞亚群发生变性后导致的一类疾病，常见的疾病类型包括帕金森病、遗传性舞蹈病、阿尔茨海默病等，其共同的特征为神经细胞功能缺失或者功能不良，干细胞在这些疾病的治疗方面具有很大的潜力。
3.间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，因此间充质干细胞可作为理想的种子细胞，在一定的诱导条件下，分化成神经细胞。
4.脐带间充质干细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
5.脐血中的干细胞分离后需要使用冻存管进行梯度降温后保存，然而传统梯度降温方法中，需要将冻存管依次放入不同冷媒中进行梯度降温，冻存管在从冷媒中取出转移的过程中，会进入外部环境，极高温差环境下，开关门将暖气和水分带入存样环境中，对超低温环境造成极大影响，导致样品生命周期大大缩短，无法长期保存，影响干细胞冻存效果，导致后续细胞复苏后的细胞活性。
技术实现要素：6.本发明的目的，是为了解决背景技术中的问题，提供一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法。
7.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
8.一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，包括以下步骤：
9.1)脐带间充质干细胞获取制备；
10.2)脐带间充质干细胞冻存：将获取的脐带间充质干细胞置入无损取样冻存管(200)后，放入冻存复苏盒内进行冻存，冻存顺序为，冰水中冻存1-3h，干冰12-24h，最后转移到液氮中冻存存放；
11.3)脐带间充质干细胞复苏、取样检测：使用冻存复苏盒将脐带间充质干细胞复苏后，取出无损取样冻存管，检测细胞活性；
12.4)取细胞活性大于80％的复苏脐带间充质干细胞进行培养，将脐带间充质干细胞用msc培养基培养至铺满培养皿；
13.5)取f3-f5代处于对数生长期的脐带间充质干细胞进行消化处理后，离心，冲洗，得到间充质干细胞；
14.6)使用诱导培养基将步骤2)得到的间充质干细胞诱导为分化干细胞；
15.7)将分化干细胞在第一分化培养基37℃，5％co2培养3-7天，然后转移到第二分化培养基37℃，5％co2继续培养3-7天，最终得到神经干细胞。
16.作为优选，所述步骤1)中脐带间充质干细胞的制备步骤为：
①
将人脐带组织去除血管和表皮，用0.9％生理盐水清洗干净后，剪成5mm
×
5mm大小的组织块接种于100mm培养皿，37℃，5％co2培养；
②
待细胞融合度达到80％-90％传代，用0.05％胰蛋白酶消化后，调整细胞数，按1
×
106ml-1
浓度接种于100mm培养皿，37℃，5％co2继续培养，3天传代一次。
17.作为优选，所述步骤2)中使用0.125％的胰蛋白酶/0.05％的乙二胺四乙酸二钠(edta)消化处理，1200rpm/min，5min离心，去上清，用0.9％生理盐水冲洗1遍。
18.作为优选，所述msc培养基制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加胎牛血清10％，青霉素1％和链霉素1％。
19.作为优选，所述诱导培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加表皮生长因子20ng/ml，碱性成纤维因子20ng/ml，1
×
b27，1
×
n2。
20.作为优选，所述第一分化培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml、神经生长因子10ng/ml和脑源性神经营养因子10ng/ml。
21.作为优选，所述第二分化培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加维a酸10μg/ml、2-巯基乙醇95μg/ml、叶酸70μg/ml、庆大霉素50μg/ml、氟喹诺酮70μg/ml。
22.作为优选，所述干细胞的培养密度为1.8
×
104个细胞/cm2。
23.作为优选，所述冻存复苏盒包括，分隔盒体、转动安置架，所述分隔盒体为中空盒体，包括若干控温区和一个复苏区，所述分隔盒体在所述复苏区顶部设置有开口，所述开口处设置有盒盖；所述转动安置架包括中心立柱和旋转架，所述中心立柱设置在所述分隔盒体中心处；所述控温区两两之间以及所述复苏区和所述控温区之间均设置有转移室，所述复苏区侧壁设置有电加热丝；所述旋转架包括转轴、旋转吊架和冻存盒，所述转轴设置在所述中心立柱内，所述冻存盒通过旋转吊架与所述转轴相连，无损取样冻存管安装在所述冻存盒内；所述中心立柱侧面设置有凸台，所述转移室设置在所述凸台外侧；所述控温区共有三个，分别为冰水区、干冰区和液氮区。
24.作为优选，所述转移室包括第一密封门板和第二密封门板，所述转移室底部设置有排放口，所述第一密封门板和所述第二密封门板铰接在所述分隔盒体的内侧壁处，所述第一密封门板和所述第二密封门板通过设置在所述分隔盒体外的门板转动电机驱动。
25.作为优选，所述控温区连接有控温机构，所述控温机构包括降温媒介仓、输入管路和回收管路，所述输入管路出口设置在所述控温区顶部，所述回收管路入口设置在所述控温区底部。
26.作为优选，所述无损取样冻存管包括冻存管体以及设置在底部外侧的取样管体，
所述冻存管体顶部设置有封盖，所述冻存管体底部设置有单向阀体；所述取样管体顶部设置有密封盖，所述密封盖中间设置有管孔，所述冻存管体通过所述管孔插在所述取样管体内，所述取样管体底部设置有取样出口，所述取样出口外设置有挡盖；所述单向阀体包括自上而下依次设置有直管段、梯形管段和漏孔板，所述梯形管段内设置有球形阀芯，所述直管段的直径小于所述球形阀芯的直径。
27.作为优选，所述冻存管体底部外侧与所述取样管体之间还设置有转动阀门，所述转动阀门包括，滑块、连杆和挡孔板，所述滑块通过所述连杆与所述挡孔板相连。
28.作为优选，，所述冻存管体底部外壁设置有环槽，所述取样管体内壁设置有滑槽，所述滑块两端分别设置在所述环槽和所述滑槽内。
29.作为优选，所述挡孔板与所述漏孔板上的开孔相对应。
30.作为优选，所述封盖处设置有进气口，所述进气口处设置有密封塞。
31.综上所述，本发明的有益效果：
32.1、本发明所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在干细胞冻存过程中，采用了特制的冻存复苏盒，能有效保证细胞复苏后的活性，提高后续的分化效果。
33.2、本发明所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，借助无损取样冻存管，保证了检测样本与冻存管内实际细胞液成分一致，保证了检测的准确性。
附图说明
34.图1是本发明冻存复苏盒的示意图
35.图2是本发明控温区的结构示意图；
36.图3是本发明无损取样冻存管的结构示意图；
37.图4是本发明转动阀门的结构示意图。
具体实施方式
38.以下具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
39.下面结合附图以实施例对本发明进行详细说明。
40.实施例1：
41.一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，包括以下步骤：
42.1)将脐带间充质干细胞用msc培养基培养至铺满培养皿；脐带间充质干细胞的制备步骤为：
①
将人脐带组织去除血管和表皮，用0.9％生理盐水清洗干净后，剪成5mm
×
5mm大小的组织块接种于100mm培养皿，37℃，5％co2培养；
②
待细胞融合度达到80％-90％传代，用0.05％胰蛋白酶消化后，调整细胞数，按1
×
106ml-1
浓度接种于100mm培养皿，37℃，5％co2继续培养，3天传代一次；msc培养基制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加胎牛血清10％，青霉素1％和链霉素1％，；
43.2)脐带间充质干细胞冻存：将获取的脐带间充质干细胞置入无损取样冻存管200
后，放入冻存复苏盒100内进行冻存，冻存顺序为，冰水中冻存1-3h，干冰12-24h，最后转移到液氮中冻存存放；
44.3)脐带间充质干细胞复苏、取样检测：使用冻存复苏盒100将脐带间充质干细胞复苏后，取出无损取样冻存管200，检测细胞活性；
45.4)取细胞活性大于80％的复苏脐带间充质干细胞进行培养，取f3-f5代处于对数生长期的脐带间充质干细胞使用0.125％的胰蛋白酶/0.05％的乙二胺四乙酸二钠(edta)消化处理，1200rpm/min，5min离心，去上清，用0.9％生理盐水冲洗1遍，得到间充质干细胞；
46.5)使用诱导培养基将步骤2)得到的间充质干细胞诱导为分化干细胞，培养密度为1.8
×
104个细胞/cm2；诱导培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加表皮生长因子20ng/ml，碱性成纤维因子20ng/ml，1
×
b27，1
×
n2。
47.6)将分化干细胞在第一分化培养基37℃，5％co2培养3-7天，第一分化培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml、神经生长因子10ng/ml和脑源性神经营养因子10ng/ml；
48.7)转移到第二分化培养基湿度95％，37℃，5％co2继续培养3-7天，第二分化培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加维a酸10μg/ml、2-巯基乙醇95μg/ml、叶酸70μg/ml、庆大霉素50μg/ml、氟喹诺酮70μg/ml，最终得到神经干细胞。
49.上述步骤中，根据图1～图4所示，冻存复苏盒100包括，分隔盒体1、转动安置架2，分隔盒体1为中空盒体，包括若干控温区11和一个复苏区12，分隔盒体1在复苏区12顶部设置有开口，开口处设置有盒盖；转动安置架2包括中心立柱21和旋转架22，中心立柱21设置在分隔盒体1中心处；
50.控温区11两两之间以及复苏区12和控温区11之间均设置有转移室3，复苏区12侧壁设置有电加热丝；旋转架22包括转轴221、旋转吊架222和冻存盒223，转轴221设置在中心立柱21内，冻存盒223通过旋转吊架222与转轴221相连，无损取样冻存管200安装在冻存盒223内，旋转吊架222中部设置有密封条2221；中心立柱21侧面设置有凸台211，转移室3设置在凸台211外侧；控温区11共有三个，分别为冰水区11a、干冰区11b和液氮区11c。
51.转移室3包括第一密封门板31和第二密封门板32，转移室3底部设置有排放口33，第一密封门板31和第二密封门板32铰接在分隔盒体1的内侧壁处，第一密封门板31和第二密封门板32通过设置在分隔盒体1外的门板转动电机34驱动。
52.控温区11连接有控温机构4，控温机构4包括降温媒介仓41、输入管路42和回收管路43，输入管路42出口设置在控温区11顶部，回收管路43入口设置在控温区11底部，回收管路43中设置有分离装置431。
53.根据图3、图4所示，无损取样冻存管200包括冻存管体21以及设置在底部外侧的取样管体22，冻存管体21顶部设置有封盖211，冻存管体21底部设置有单向阀体23；取样管体22顶部设置有密封盖221，密封盖221中间设置有管孔，冻存管体21通过管孔插在取样管体22内，取样管体22底部设置有取样出口222，取样出口222外设置有挡盖223；单向阀体23包括自上而下依次设置有直管段231、梯形管段232和漏孔板233，梯形管段232内设置有球形
阀芯234，直管段231的直径小于球形阀芯234的直径。封盖211处设置有进气口2111，进气口2111处设置有密封塞2112，冻存管体21为透明管体，其侧壁设置有刻度条。
54.冻存管体21底部外侧与取样管体22之间还设置有转动阀门24，转动阀门24包括，滑块241、连杆242和挡孔板243，滑块241通过连杆242与挡孔板243相连，冻存管体21底部外壁设置有环槽212，取样管体22内壁设置有滑槽224，滑块241两端分别设置在环槽212和滑槽224内，挡孔板243与漏孔板233上的开孔相对应。
55.装置的冻存时：
56.1、驱动转轴221将冻存盒223旋转到复苏区12内，打开复苏区12顶部的盒盖，放入冻存管后，盖上盒盖。
57.2、开启控温区11与冰水区11a之间的转移室3的第一密封门板31，将转移室3与复苏区12连通，驱动转轴221将冻存盒223旋转到该转移室3内，关闭第一密封门板31。启动控温机构4在冰水区11a内注满冰水后，打开转移室3的第二密封门板32，将转移室3与冰水区11a连通，随后驱动转轴221将冻存盒223旋转到冰水区11a内进行第一次降温。同时关闭第二密封门板32，通过排放口33将转移室3内的残留冰水排出。
58.3、第一次降温完成后，开启冰水区11a与干冰区11b之间转移室3的第一密封门板31，将冻存盒223转动到转移室3内后，关闭第一密封门板31，干冰区11b内通过控温机构4填充满干冰，通过排放口33将转移室3内的冰水排出后，开启第二密封门板32将冻存盒223转移到干冰区11b进行第二次降温，同时关闭第二密封门板32，通过排放口33将转移室3内的残留干冰排出。
59.4、采用同样的方式将冻存盒223转移到液氮区11c进行第三次降温冻存。
60.装置升温复苏时：
61.1、将冻存盒223转动到复苏区，通过电热丝对复苏区进行加热，直到冻存管恢复常温。
62.装置冻存管进行取样时：
63.1、转动取样管体22，同时带动滑块241将挡孔板243转动一定角度，使得挡孔板243和漏孔板233上的孔位置对齐。2、打开进气口2111，向下拉动取样管体2，在压力作用下，冻存管体21内的细胞液通过单向阀体23从冻存管体21进入到取样管体22内。3、再次转动取样管体22，使挡孔板243和漏孔板233上的孔位错开，即通过挡孔板243将漏孔板233盖住。4、取下挡盖223打开取样出口222，按下冻存管体21，在压力作用下，细胞液从取样管体22内流出。少量从挡孔板243和漏孔板233之间回流的细胞液顶起球形阀芯34后会被堵在单向阀体23内，无法回流到冻存管体21内。
技术特征：1.一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)脐带间充质干细胞获取制备；2)脐带间充质干细胞冻存：将获取的脐带间充质干细胞置入无损取样冻存管(200)后，放入冻存复苏盒(100)内进行冻存，冻存顺序为，冰水中冻存1-3h，干冰12-24h，最后转移到液氮中冻存存放；3)脐带间充质干细胞复苏、取样检测：使用冻存复苏盒(100)将脐带间充质干细胞复苏后，取出无损取样冻存管(200)，检测细胞活性；4)取细胞活性大于80％的复苏脐带间充质干细胞进行培养，将脐带间充质干细胞用msc培养基培养至铺满培养皿；5)取f3-f5代处于对数生长期的脐带间充质干细胞进行消化处理后，离心，冲洗，得到间充质干细胞；6)使用诱导培养基将步骤2)得到的间充质干细胞诱导为分化干细胞；7)将分化干细胞在第一分化培养基37℃，5％co2培养3-7天，然后转移到第二分化培养基37℃，5％co2继续培养3-7天，最终得到神经干细胞。2.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1)中脐带间充质干细胞的制备步骤为：
①
将人脐带组织去除血管和表皮，用0.9％生理盐水清洗干净后，剪成5mm
×
5mm大小的组织块接种于100mm培养皿，37℃，5％co2培养；
②
待细胞融合度达到80％-90％传代，用0.05％胰蛋白酶消化后，调整细胞数，按1
×
106ml-1
浓度接种于100mm培养皿，37℃，5％co2继续培养，3天传代一次。3.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述步骤4)中使用0.125％的胰蛋白酶/0.05％的乙二胺四乙酸二钠(edta)消化处理，1200rpm/min，5min离心，去上清，用0.9％生理盐水冲洗1遍。4.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述msc培养基制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加胎牛血清10％，青霉素1％和链霉素1％。5.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加表皮生长因子20ng/ml，碱性成纤维因子20ng/ml，1
×
b27，1
×
n2。6.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述第一分化培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml、神经生长因子10ng/ml和脑源性神经营养因子10ng/ml。7.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述第二分化培养基的制备方法为：
①
将dmem培养基和f12培养基按照1∶1的比例配成dmem/f12基础培养基；
②
在dmem/f12基础培养基中添加维a酸10μg/ml、2-巯基乙醇95μg/ml、叶酸70μg/ml、庆大霉素50μg/ml、氟喹诺酮70μg/ml。
8.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述干细胞的培养密度为1.8
×
104个细胞/cm2。9.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述冻存复苏盒(100)包括，分隔盒体(1)、转动安置架(2)，所述分隔盒体(1)为中空盒体，包括若干控温区(11)和一个复苏区(12)，所述分隔盒体(1)在所述复苏区(12)顶部设置有开口，所述开口处设置有盒盖；所述转动安置架(2)包括中心立柱(21)和旋转架(22)，所述中心立柱(21)设置在所述分隔盒体(1)中心处；所述控温区(11)两两之间以及所述复苏区(12)和所述控温区(11)之间均设置有转移室(3)，所述复苏区(12)侧壁设置有电加热丝；所述旋转架(22)包括转轴(221)、旋转吊架(222)和冻存盒(223)，所述转轴(221)设置在所述中心立柱(21)内，所述冻存盒(223)通过旋转吊架(222)与所述转轴(221)相连，无损取样冻存管(200)安装在所述冻存盒(223)内；所述中心立柱(21)侧面设置有凸台(211)，所述转移室(3)设置在所述凸台(211)外侧；所述控温区(11)共有三个，分别为冰水区(11a)、干冰区(11b)和液氮区(11c)。10.根据权利要求1所述的一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述无损取样冻存管(200)包括冻存管体(21)以及设置在底部外侧的取样管体(22)，所述冻存管体(21)顶部设置有封盖(211)，所述冻存管体(21)底部设置有单向阀体(23)；所述取样管体(22)顶部设置有密封盖(221)，所述密封盖(221)中间设置有管孔，所述冻存管体(21)通过所述管孔插在所述取样管体(22)内，所述取样管体(22)底部设置有取样出口(222)，所述取样出口(222)外设置有挡盖(223)；所述单向阀体(23)包括自上而下依次设置有直管段(231)、梯形管段(232)和漏孔板(233)，所述梯形管段(232)内设置有球形阀芯(234)，所述直管段(231)的直径小于所述球形阀芯(234)的直径。
技术总结本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用冻存脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，包括以下步骤：1)脐带间充质干细胞获取制备；2)脐带间充质干细胞冻存；3)脐带间充质干细胞复苏、取样检测：使用冻存复苏盒将脐带间充质干细胞复苏后，取出无损取样冻存管，检测细胞活性；4)将脐带间充质干细胞用MSC培养基培养至铺满培养皿；5)取F3-F5代处于对数生长期的脐带间充质干细胞进行消化处理后，离心，冲洗，得到间充质干细胞；3)使用诱导培养基将步骤2)得到的间充质干细胞诱导为分化干细胞；4)将分化干细胞在第一分化培养基37℃，5％CO2培养3-7天，然后转移到第二分化培养基37℃，5％CO2继续培养3-7天，最终得到神经干细胞。胞。胞。
技术研发人员：陆敏 卿泉 邓湘雄
受保护的技术使用者：浙江金时代生物技术有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/7/5
