1.本发明涉及分析化学领域，尤其涉及利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法。
背景技术：2.利奈唑胺是一种新型噁唑烷酮类化学合成抗菌药物，主要作用于细菌蛋白翻译合成的起始阶段，通过与细菌50s亚基的23s核糖体rna上的位点结合，组织功能性70s始动复合物形成，从而阻止细菌蛋白质合成，发挥抑菌作用。利奈唑胺与其它抗菌药物无交叉耐药性，并对耐万古霉素肠球菌(vre)，耐甲氧西林葡萄球菌(mrsa)，获得性肺炎及皮肤软组织感染等有较强抗菌活性，主要用于治疗革兰阳性(g
+
)球菌引起的感染，包括由mrsa引起的疑似或确诊院内获得性肺炎(hap)、社区获得性肺炎(cap)、复杂性皮肤或皮肤软组织感染(ssti)以及耐万古霉素肠球菌(vre)感染等。
3.现有工艺生成的利奈唑胺原料药中可能会产生残留四种痕量的卤代烷烃类基因毒性杂质：环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷，其中1，3-二氯丙烯为顺反异构体，存在形式为顺式-1,3-二氯丙烯和反式-1,3-二氯丙烯。
4.常规气相色谱或液相色谱检测方法的灵敏度不能满足利奈唑胺原料药中上述卤代烷烃类基因毒性杂质的检测要求。目前，尚未发现能够满足该要求的检测方法报道。
技术实现要素：5.针对目前没有利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，本发明提供一种利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，从而为监控利奈唑胺的质量稳定性和临床用药安全性提供了保证和依据。
6.为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
7.利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，具体包括以下操作：用有机溶剂配制待测溶液，采用顶空进样-气相色谱-质谱联用法进行潜在基因毒性杂质的检测，所述潜在基因毒性杂质包括环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷；
8.所述顶空进样的条件包括：加热温度为103～107℃，加热平衡时间为28～32min；
9.所述气相色谱法的色谱条件包括：气相色谱的升温程序为：起始温度38～42℃，维持5min，以19～21℃/min的速率升温至215～225℃；
10.所述质谱的条件包括：采用三重四级杆串联质谱仪检测，四级杆温度150℃；采用ei离子源，离子源温度200～300℃。
11.优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
12.本发明提供的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，具有以下优势：
13.对于利奈唑胺中潜在的基因毒性杂质环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷，本发明利用顶空进样避免了利奈唑胺挥发进入色谱系统后污染进样系统及色谱柱等关键部件，并且提供的顶空进样-气相色谱-质谱联用的检测方法，通过参数条件的限定，具有灵敏度高，准确可靠，线性关系良好的优势，同时具有良好的精密度和
耐用性，适用于利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测，可作为其质量监控的依据。
14.优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：后运行温度为250℃，维持5min；传输线温度为280℃。
15.优选地，所述待测溶液包括对照品溶液，所述对照品溶液中所述环氧氯丙烷的浓度为50.00～1000.00ng/ml；所述对照品溶液中所述1,3-二氯丙烯的浓度为20.00～400.00ng/ml；所述对照品溶液中所述1,1,2-三氯丙烷的浓度为20.00～450.00ng/ml；所述对照品溶液中所述1,2,3-三氯丙烷的浓度为30.00～600.00ng/ml。
16.优选地，所述顶空进样条件还包括：取样针温度为110℃，顶空进样的传输线温度为120℃，进样时间为0.25min。
17.优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样方式为分流进样，分流比为5：1。
18.优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：毛细管色谱柱的柱长为60m，内径为250μm，固定相涂层液膜厚度为1.4μm。
19.优选地，所述毛细管色谱柱的固定相为6％氰丙基/苯基和94％聚二甲基硅氧烷。
20.优选地，所述毛细管色谱柱的型号为安捷伦vf-624ms。
21.上述优选地毛细管色谱柱分离度佳，能够很好地实现利奈唑胺中潜在的基因毒性杂质环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷的分离，而且分离得到的色谱峰窄，峰形对称。
22.优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：采用氦气为载气，所述载气的流速为0.9～1.1ml/min。
23.优选地，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样口温度为275～285℃。
24.优选地，所述质谱条件还包括：离子检测方式为多反应监测模式。
25.优选地，所述质谱条件还包括：
26.环氧氯丙烷的定量离子为57＞31，定量离子碰撞能为7ev，定性离子为49＞47，定性离子碰撞能为28ev；
27.1，3-二氯丙烯的定量离子为75＞39，定量离子碰撞能为11ev，定性离子为77＞39，定性离子碰撞能为12ev；
28.1，1，2-三氯丙烷的定量离子为63＞27，定量离子碰撞能为13ev，定性离子为65＞27，定性离子碰撞能为14ev；
29.1，2，3-三氯丙烷的定量离子为75＞39，定量离子碰撞能为15ev，定性离子为110＞75，定性离子碰撞能为5ev。
30.优选地，所述质谱条件还包括：电离能量为70ev。
附图说明
31.图1为实施例1提供的空白溶剂(二甲基亚砜)的色谱图；
32.图2为实施例1提供的对照品溶液的色谱图；
33.图3为实施例1提供的供试品溶液的色谱图；
34.图4为实施例1提供的供试品与对照品的混合溶液的色谱图。
具体实施方式
35.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.实施例1：
37.利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，具体包括以下步骤：
38.1.1溶液配制
39.精密称取供试品1g置于顶空瓶，加入5ml二甲基亚砜溶液后立即加盖密封，作为供试品溶液；
40.分别精密适量环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷，用二甲基亚砜分别溶解并稀释、混合制成每1ml中约含环氧氯丙烷50.00μg、1,3-二氯丙烯20.00μg、1,1,2-三氯丙烷20.00μg和1,2,3-三氯丙烷30.00的混合溶液，作为对照品贮备液；
41.分别精密适量环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷，用二甲基亚砜分别溶解并稀释、混合制成每1ml中约含环氧氯丙烷500ng、1,3-二氯丙烯200ng、1,1,2-三氯丙烷200ng和1,2,3-三氯丙烷300ng的混合溶液，取5ml置于顶空瓶，立即加盖密封，作为对照品溶液；
42.精密称取供试品1g，置于顶空瓶，加入对照品溶液5ml，立即加盖密封，作为供试品与对照品的混合溶液。
43.1.2利奈唑胺中潜在基因毒性杂质检测方法
44.用顶空进样-气相色谱-质谱联用法对上述溶液进行检测，其中，顶空进样的条件为：加热炉温度：105℃；加热平衡时间：30min；hs取样针温度：110℃；hs传输线温度：120℃；进样时间：0.25min。
45.色谱条件为：色谱柱型号：安捷伦vf-624ms；色谱柱规格：60m*250μm*1.4μm；进样口温度：280℃；载气：氦气(纯度为99.999％)，流速为1ml/min；分流比：5:1；升温程序：起始温度40℃，维持5min，以10℃/min的速率升温至220℃；后运行温度为250℃，维持5min；传输线温度：280℃。
46.质谱条件为：采用三重四级杆串联质谱仪检测，四级杆温度150℃；采用ei离子源，离子源温度250℃；电离能量为70ev；离子检测方式为多反应监测(mrm)模式；环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷的质谱参数见表1。
47.表1
48.49.1.3将上述利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测条件进行方法学验证：
50.(1)专属性考察
51.取空白溶剂二甲基亚砜、对照品溶液、供试品溶液和供试品与对照品的混合溶液按照1.2中的检测条件进行检测，检测结果见表2，色谱图见附图1～4，空白溶剂色谱图见附图1，对照品溶液的色谱图见附图2，供试品溶液的色谱图见附图3，供试品与对照品的混合溶液见附图4，其中，1，3-二氯丙烯为顺反异构体，存在形式为顺式-1,3-二氯丙烯(1,3-d1)和反式-1,3-二氯丙烯(1,3-d2)两种。
52.表2专属性测试结果
[0053][0054]
从上述结果和附图可知，空白溶剂及供试品溶液对各杂质检测无干扰，表明本发明提供的顶空进样-气相色谱-质谱联用法专属性良好。
[0055]
(2)检测限和定量限考察
[0056]
分别精密称取利奈唑胺中潜在基因毒性杂质环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷的对照品适量，然后分别用二甲基亚砜逐级定量稀释，并按照1.2中的检测条件进行检测，按信噪比约为10:1时的分析物浓度设为定量限浓度，在此浓度下连续进样6针；按信噪比约为3:1时的分析物浓度设为检测限浓度，具体检测结果见下表3和4，其中1，3-二氯丙烯的浓度、相当于样品含量均为顺式-1,3-二氯丙烯和反式-1,3-二氯丙烯之和。
[0057]
表3定量限和检测限试验结果
[0058][0059][0060]
从表中数据可知本发明提供的检测方法检测利奈唑胺中潜在基因毒性杂质环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷的检测限和定量限低，说明本发
明检测方法对以上四种潜在基因毒性杂质的检测具有高灵敏度的特点，符合成品中基因毒素的检测要求。
[0061]
表4定量限重复性试验结果
[0062][0063]
从表中数据可知本发明提供的气相色谱-质谱联用法检测的上述四种潜在基因毒性杂质的相对标准偏差(rsd)范围为3.46～8.03％之间，显示定量限具有良好的重复性。
[0064]
(3)线性考察
[0065]
取对照品贮备液，用二甲基亚砜稀释，在约50.00～1000.00ng/ml的浓度范围内配制九个浓度级别的线性溶液，分别精密量取上述线性溶液5ml，立即加盖密封，按照1.2中的检测条件进行检测，测定峰面积，以线性溶液中各组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线并建立线性方程。
[0066]
表5-1环氧氯丙烷线性试验结果
[0067][0068]
表5-2 1,3-二氯丙烯线性试验结果
[0069][0070]
表5-3 1,1,2-三氯丙烷线性试验结果
[0071][0072]
表5-4 1,2,3-三氯丙烷线性试验结果
[0073][0074]
从表中数据可知本发明提供的检测方法线性范围较宽，以上四种利奈唑胺中潜在基因毒性杂质在浓度约为50.00～1000.00ng/ml的范围内线性关系良好。
[0075]
(4)重复性考察
[0076]
按照1.1中的配制方法配制供试品溶液，平行制备6份，按照1.2中的检测方法进行检测，具体检测结果见下表。
[0077]
表6重复性试验结果
[0078][0079]
检测结果显示，重复测定6份供试品溶液，环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷均未检出，本方法重复性良好。
[0080]
(5)准确度考察
[0081]
精密量取对照品贮备液0.5ml，置于50ml容量瓶中，加入二甲基亚砜溶液稀释至刻度线，摇匀，取5ml至顶空瓶，立即加盖密封，即得限度浓度对照品溶液。
[0082]
精密量取对照品贮备液0.2ml、0.4ml和0.5ml，分别置于50ml容量瓶中，加入二甲基亚砜溶液定容至刻度，摇匀，即得回收率溶液，每个浓度平行制备三份。
[0083]
精密称取供试品九份，每份1.0000g，置于顶空瓶中，分别加入5.0ml上述回收率溶液，立即加盖密封，即得对照品和供试品的混合溶液。
[0084]
按照1.2中的检测条件进行检测，根据回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量
×
100％计算回收率，回收率结果见下表。
[0085]
表7-1环氧丙烷回收率检测结果
[0086][0087][0088]
表7-2 1,3-二氯丙烯回收率检测结果
[0089][0090]
表7-3 1,1,2-三氯丙烷回收率检测结果
[0091][0092][0093]
表7-4 1,2,3-三氯丙烷回收率检测结果
[0094][0095]
从表中数据可知本发明提供的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质检测方法在的回收率为98.35％～101.50％之间，rds小于3％，表明本发明的检测方法准确度良好。
[0096]
(6)精密度考察
[0097]
取上述对照品溶液，并按照1.2中的检测条件进行检测，平行测定6次，计算检测含
量，测试结果如下表所示。
[0098]
表8精密度测试结果
[0099][0100][0101]
从表中数据可知，对照品溶液连续检测6次，各杂质的峰面积相对标准偏差(rsd)为0.85％～1.63％，表明本方法的精密性良好。
[0102]
(7)耐用性考察
[0103]
取对照品溶液，然后分别微调1.2检测方法中的起始温度、升温速率、柱流量、进样口温度、hs加热炉温及加热平衡时间进行检测，其他检测条件不变，耐用性结果见下表。
[0104]
表9耐用性试验结果
[0105]
[0106][0107]
从上述表中数据可知，通过微调起始温度、升温速率、柱流量、进样口温度、hs加热炉温及保温时间以上因素对各杂质检测无影响，表明本方法的耐用性良好。
[0108]
(8)中间精密度考察
[0109]
按照1.1中的配制方法配制供试品溶液，平行制备6份，按照1.2中的检测方法进行检测，且6份供试品的检测日期不同，操作者也不同，具体检测结果见下表。
[0110]
表10中间精密度试验结果
[0111][0112]
从表中可知，上述6份供试品溶液均未检出，与重复性结果一致，表明本方法的中间精密度良好。
[0113]
(9)稳定性考察
[0114]
取对照品溶液和供试品溶液，将对照溶液和供试品溶液在室温下静置，每隔0h、2h、4h、6h、8h、12h、48h按照1.2中的检测方法进行检测，结果见下表。
[0115]
表11对照品溶液稳定性试验结果
[0116][0117]
表12供试品溶液稳定性试验结果
[0118][0119]
从表中可知，供试品溶液在室温条件下，放置48小时，各杂质均未检出，对照品溶液在室温条件下，放置48小时，各杂质峰面积的相对标准偏差(rsd)均小于10％，表明上述供试品和对照品溶液的稳定性良好。
[0120]
从附图1～4及上述几个方面的方法学考察可见，本发明提供的检测方法能快速有效地分离测定利奈唑胺中潜在基因毒性杂质环氧氯丙烷、1，3-二氯丙烯、1，1，2-三氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷，从而为监控利奈唑胺的质量稳定性和临床用药安全性提供了保证和依据。
[0121]
(10)样品检测
[0122]
按照1.2中的检测方法检测7批利奈唑胺原料样品中的环氧氯丙烷、1，3-二氯丙烯、1，1，2-三氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷含量，结果见下表。
[0123]
表13样品检测结果
[0124][0125]
结果显示，7批利奈唑胺原料样品中环氧氯丙烷、1，3-二氯丙烯、1，1，2-三氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷含量均未检出，符合限度规定(≤1.25ppm)。
[0126]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，用有机溶剂配制待测溶液，采用顶空进样-气相色谱-质谱联用法进行潜在基因毒性杂质的检测，所述潜在基因毒性杂质包括环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷；所述顶空进样的条件包括：加热温度为103～107℃，加热平衡时间为28～32min；所述气相色谱法的色谱条件包括：气相色谱的升温程序为：起始温度38～42℃，维持5min，以19～21℃/min的速率升温至215～225℃；所述质谱的条件包括：采用三重四级杆串联质谱仪检测，四级杆温度150℃；采用ei离子源，离子源温度200～300℃。2.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述顶空进样条件还包括：取样针温度为110℃，顶空进样的传输线温度为120℃，进样时间为0.25min。3.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：进样方式为分流进样，分流比为5：1。4.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：毛细管色谱柱的柱长为60m，内径为250μm，固定相涂层液膜厚度为1.4μm。5.如权利要求4所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述毛细管色谱柱的固定相为6％氰丙基/苯基和94％聚二甲基硅氧烷。6.如权利要求5所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述毛细管色谱柱的型号为安捷伦vf-624ms。7.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱条件还包括：采用氦气为载气，所述载气的流速为0.9～1.1ml/min；和/或进样口温度为275～285℃。8.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：离子检测方式为多反应监测模式。9.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：环氧氯丙烷的定量离子为57＞31，定量离子碰撞能为7ev，定性离子为49＞47，定性离子碰撞能为28ev；1，3-二氯丙烯的定量离子为75＞39，定量离子碰撞能为11ev，定性离子为77＞39，定性离子碰撞能为12ev；1，1，2-三氯丙烷的定量离子为63＞27，定量离子碰撞能为13ev，定性离子为65＞27，定性离子碰撞能为14ev；1，2，3-三氯丙烷的定量离子为75＞39，定量离子碰撞能为15ev，定性离子为110＞75，定性离子碰撞能为5ev。10.如权利要求1所述的利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：电离能量为70ev。
技术总结本发明涉及分析化学领域，尤其涉及利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测方法。对于利奈唑胺中潜在的基因毒性杂质环氧氯丙烷、1,3-二氯丙烯、1,1,2-三氯丙烷和1,2,3-三氯丙烷，本发明提供的顶空进样-气相色谱-质谱联用的检测方法，通过参数条件的限定，具有灵敏度高，准确可靠，线性关系良好的优势，同时具有良好的精密度和耐用性，适用于利奈唑胺中潜在基因毒性杂质的检测，可作为其质量监控的依据。可作为其质量监控的依据。可作为其质量监控的依据。
技术研发人员：徐黎明 王亚静 董海峰 荣孜杭 周雅洁 祝春英 韩倩茹 骆会茹
受保护的技术使用者：石家庄四药有限公司
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/7/4
