lncRNA及其靶基因在羊卵巢发育中的应用

lncrna及其靶基因在羊卵巢发育中的应用
技术领域
1.本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及lncrna及其靶基因在羊卵巢发育中的应用。


背景技术：

2.随着基因组学和分子生物学的发展，发现了大量长非编码rna。许多lncrna 在多个生物过程中发挥作用。但是对于lncrna的作用在很大程度上是未知的，仍有许多功能待于完善和挖掘，对于lncrna在卵巢发育方面的研究更是局限。李加宇等人通过qpcr发现lncrna647、lncrna147和lncrna274在小鼠卵巢组织中特异性高表达，并检测出在小鼠不同发育阶段和发情时期下，三种lncrna 的表达量发生变化并具有一定规律。但目前关于lncrna在羊卵巢发育方面的研究鲜有报道。
3.卵巢是哺乳动物重要的生殖器官，也是配子和类固醇性激素的重要来源，它的健康发育对于动物繁殖具有重要作用。卵巢发育情况复杂，各个过程必须正常才能保证繁殖活动的顺利进行。此外，卵巢是一个动态变化的器官，发育过程包括卵母细胞和颗粒细胞的成熟，过程繁琐复杂，除了有各个激素影响外还受各种因子调节，例如成熟促进因子(mpf)、卵母细胞成熟抑制因子(omi)、环腺苷酸(camp)、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)、ca+、生长分化因子(gdf)等。
4.为了探究卵巢发育的分子机制，本技术选取中国本土湖羊品种为实验对象，采用rna-seq技术对卵巢组织中的lncrna进行测序分析，比较1月龄、3月龄的湖羊卵巢组织中lncrna的差异表达情况，利用生物信息学方法筛选出各阶段差异表达的lncrna及其调控基因，从而筛选出调控卵巢组织发育的lncrna及其调控基因，探索lncrna影响卵巢发育的调控机制。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种与羊卵巢发育相关的lncrna，所述lncrna为mstrg.12709，序列与seq id no.1具有90％以上序列同源性。
6.优选的，mstrg.12709序列与seq id no.1具有95％以上序列同源性；更优选的，长链非编码rna序列为seq id no.1。
7.mstrg.12709及其靶基因用于制备检测卵巢发育水平试剂中的应用。
8.优选的，通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测mstrg.12709 及其靶基因的表达水平。
9.优选的，mstrg.12709的靶基因为fshr。
10.优选的，核酸扩增技术采用一对特异性引物扩增mstrg.12709基因；核酸杂交包括与fshr基因的核酸序列杂交的探针。
11.优选的，通过免疫方法检测fshr基因表达产物的表达水平。
12.优选的，通过elisa检测试剂盒和/或胶体金检测试剂盒检测fshr基因达产物的表
达水平。
13.优选的，卵巢为羊卵巢。
14.一种检测羊卵巢发育的试剂，试剂包含用于核酸扩增的引物对，检测 mstrg.12709基因的表达水平。
15.优选的，用于核酸扩增的引物对序列为seq id no.2和seq id no.3。
16.优选的，试剂检测的样本为组织。
附图说明
17.图1为总rna琼脂糖凝胶电泳结果；
18.图2为卵巢组织差异表达mrna kegg pathway富集分析(h1 vs h3)图；
19.图3为1月龄vs3月龄卵巢组织差异表达lncrna和mrna共表达网络图，三角形节点代表lncrna，圆形节点代表mrna；
20.图4为差异表达基因qrt-pcr验证结果图。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
22.实施例1样品的采集剂rna提取
23.1.1样品的采集
24.将三个月龄的羊屠宰后，将两侧的卵巢组织摘除，剪成小块组织样后迅速放入冻存管中并投入液氮中保存，组织样温度维持低温后放入-80℃冰箱中保存，整个过程保持无菌环境，所有器具消毒处理。试验设置为3组，采集1月、3月龄的湖羊卵巢组织，进行1月龄湖羊卵巢组织与3月龄湖羊卵巢组织(h1 vs h3) 差异的lncrna和mrna的鉴定，每个组安排3个生物学重复。
25.1.2样本rna的提取和质量检测
26.每个样品分别取出等量的卵巢组织用来提取rna，保证无菌环境，并将得到的所有rna在-80℃低温保存。
27.提取rna，用nanodrop 2000紫外分光光度计对所提rna的纯度和浓度进行检测，在1.5％琼脂糖凝胶上监测rna降解和污染，尤其是dna污染，测定rna的完整性。使用bioanalyzer 2100检测样品rna的质量情况，测定rin 值。建库测序的要求是rna总量不少于2ug，od260 nm和od280 nm两者比值在1.9-2.1的范围内、rin》＝7且28s/18s》＝0.7，浓度≥100ng/μl，以确保使用合格的样品进行转录组测序，同时满足以上条件的样品可以进行下一步实验。
28.结果如图1表示，可以看出28s和18s条带清晰可见，各个样品结果中rin ≥7、28s/18s≥1且od260/280两者比值在1.9-2.1的范围内，表明rna较完整，污染较少，样品合格，符合测序要求。
29.实施例2测序及数据分析
30.构建cdna文库：建立cdna文库，分别为h1o1、h1o2、h1o3(1月龄湖羊卵巢组织cdna文库)，h3o2、h3o3、h3o4(3月龄湖羊卵巢组织cdna 文库)。
31.文库质检合格后，可以进行上机测序。利用illuminahiseq平台进行对检测合格的cdna文库进行测序，对下机之后的原始数据(raw data)进行分析。
32.预测lncrna首先需要完成基本筛选，再检测是否具有潜在编码能力，。首先筛选包含intergenic lncrna，intronic lncrna,sense-lncrna和anti-sense lncrna 等不同类型的转录本。表达水平分析及差异表达基因筛选：对样品中的mappedreads的数目和转录本长度进行归一化，采用fpkm法(fragments per kilobase oftranscript per million fragments mapped)作为衡量mrna和lncrna表达水平的指标，在差异基因筛选过程中(h1 vs h3、h3 vs h8)，将fold change≥2且 fdr《0.01作为筛选标准。
33.1月龄湖羊卵巢基本未发育，3月龄湖羊卵巢未发育成熟，通过对两个阶段 (h1 vs h3)的卵巢组织进行比较分析，将log2|fold change|≥2且fdr≤0.01 作为筛选标准。结果在1月龄和3月龄湖羊卵巢组织中共筛选出6716个差异表达的mrnas(3377个上调，3339个下调)和1972个差异lncrnas(1093个上调，879个下调)。
34.go注释(gene ontology)包括生物过程(bp)、分子功能(mf)和细胞成分(cc)三个方面，可以描述基因或基因产物功能的特定方面。
35.通过对1月龄和3月龄湖羊卵巢组织差异mrna进行go富集，以p≤0.05 筛选显著富集的通路，并使用r语言画图，发现在生物学过程方面差异基因主要富集在黄体酮代谢过程(progesterone metabolic process)、卵巢卵泡发育(ovarianfollicle development)、类固醇激素介导的信号通路(steroid hormone mediatedsignaling pathway)、生殖细胞发育(germ cell development)、调节类固醇激素的生物合成过程(regulation of steroid hormone biosynthetic process)、对促性腺激素反应(response to gonadotropin)等条目；在分子功能方面，主要富集在生长因子结合(growth factor binding)、胰岛素样生长因子受体结合(insulin-like growthfactor receptor binding)、雌激素受体结合(estrogen receptor binding)、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(cyclin-dependent protein serine/threoninekinase activity)等条目；在细胞组分方面，主要富集在小核糖体亚基(smallribosomal subunit)、电压门控钙通道复合物(voltage-gated calcium channelcomplex)、线粒体膜部分(mitochondrial membrane part)等条目。
36.kegg是通过生物信号途径对完全测序的基因组进行生物学解释的综合数据库资源。对差异表达mrna进行通路分析，结果富集在卵巢类固醇生成 (ovarian steroidogenesis)、tgf-β信号通路、雌激素信号通路(estrogen signalingpathway)、mapk信号通路(mapk signaling pathway)、nf-κb信号通路 (nf-kappa b signaling pathway)等通路中，每个通路对应的差异基因数目如图所示。
37.kegg通路富集分析表明，1、3月龄湖羊卵巢组织中差异表达mrna参与到多个与卵巢卵泡发育相关的通路中，富集在这些通路中的mrna可能参与调控湖羊两个阶段之间卵巢各部分的发育，以及影响性成熟等一系列现象的出现，对于本研究中挖掘相关mrna的功能具有重要的指导意义，结果见图2。
38.组间差异表达lncrna靶基因预测：lncrna靶基因预测共有两种方式，一种是基于位置关系的cis靶基因预测，另一种是基于表达量关系的trans靶基因预测。lncrna能够调控其邻近基因的表达，主要根据lncrna和基因的位置预测，在lncrna基因组位置上下游100kb范围内的mrna预测为cis作用靶基因即顺式调控靶基因。通过分析lncrna和mrna的表达量是否具有相关性来确定 lncrna靶向的远距离蛋白编码基因，即trans反式作用靶基因。采用pearson相关系数法分析样本间lncrna与mrna的相关性，以相关性绝对值|pcc|≥0.9 和显著性p≤0.01为阈值筛选反式作用靶基因。
39.将差异mrna进行功能注释后，筛选出与卵巢发育相关通路的go条目，这些条目中对应的差异mrna即可能参与卵巢生长过程的调节，也是研究卵巢发育的关键基因。将差异表达lncrna的靶基因进行功能注释，并筛选差异lncrna 对应的差异靶基因，两者均差异表达。结合差异mrna和差异lncrna靶基因功能注释结果，经过筛选发现几个与卵巢发育密切相关的基因差异表达，1月龄和3月龄差异表达的基因参与camp信号通路、卵巢类固醇生成通路、tgf-β信号通路、pi3k-akt信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟等通路和卵泡发育过程，并筛选到有几个lncrna通过cis和trans调控作用靶向其中的一些基因，结果如图3所示。mstrg.12709及其靶基因fshr成为我们的候选基因。
40.实施例3 qrt-pcr检测验证
41.3.1测序结果的可靠性验证
42.本实验在两个比较组(h1 vs h3)之间随机选择差异表达的lncrna和mrna 进行pcr检测，每个基因3个重复，验证每个lncrna和mrna的表达趋势，主要方法如下：
43.反转录
44.将低温保存的rna样品取出，解冻后在pcr管中配置反转录体系。在体系中加入以下试剂：
45.rna样品
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5μg
[0046]4×
gdna wiper mix
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
[0047]
nuclease-free h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5.5μl
[0048]
在42℃条件下反应2min，再加入5
×
hiscript ii q rt supermix iia，2μl，以上共10μl。设置反应条件为25℃10min，50℃30min，85℃5min，全部完成后低温-20℃保存备用。
[0049]
pcr反应设置
[0050]
pcr反应体系如下表，按步骤加入如下组分进行反应
[0051][0052]
表1 pcr体系中组分和体积
[0053][0054]
pcr数据分析及结果
[0055]
利用2
‑△△
ct
法计算所有基因在各个样本间的相对表达量，数据表示为平均数
ꢀ±
标准差(mean
±
sd)，p《0.05表示该基因在两组间差异显著。结果表明，fshr、、fshr在3月龄卵巢中显著上调表达，mstrg.283534.2显著下调； 在8月龄卵巢组织中，fst、inhba、inha、mstrg.123289.5显著下调，fshr、 mstrg.77987.3在显著上调，说明与测序结果一致，测序结果可靠。
[0056]
表2. 1月龄和3月龄湖羊卵巢差异表达基因验证结果
[0057][0058]
3.2候选基因的验证
[0059]
本实验收集18只1月龄、18只3月龄的湖羊，在两个组(h1 vs h3)之间对差异表达的lncrna和mrna进行pcr检测，每个基因3个重复，验证 mstrg.12709及其靶基因fshr差异表达情况，实验步骤同3.1。
[0060]
pcr数据分析及结果，利用2
‑△△
ct
法计算mstrg.12709及基因fshr在各个样本间的相对表达量，数据表示为平均数
±
标准差(mean
±
sd)，p《0.05表示该基因在两组间差异显著。结果表明，相对于1月龄组，fshr在3月龄组卵巢中显著上调表达，mstrg.12709相对于1月龄组，在3月龄组显著上调表达，表达量约为1月龄的6倍。
[0061][0062]
fshr是fsh作用的必要条件，本研究中fshr上调表达，fsh激活颗粒细胞中的fsh受体(fshr)以诱导卵泡分化、生长和雌二醇产生，在雌性家畜中，fshr仅在卵巢的gc中表达，在gc增殖、凋亡、分化、卵泡成熟和闭锁以及排卵中起关键作用，且卵巢卵泡中fshr的mrna水平与绵羊的繁殖力密切相关。