一种基于silac进行血清胱抑素c绝对定量的质谱方法
技术领域：
：1.本发明涉及质谱检测
技术领域：
：，尤其涉及一种基于silac进行血清胱抑素c绝对定量的质谱方法。
背景技术：
：：2.血清胱抑素c(cysc)作为一种新型的、内源性测定gfr的物质，不受患者年龄、性别、体质量、身高、胆红素、血糖、营养状况的影响，是反映早期肾小球滤过率(gfr)变化的一个理想、可靠的内源性标志物。血清中cysc浓度较低，测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。血清中cysc含量的检测方法早期有酶免疫测定法(eia)和单向免疫扩散法(rid)，但方法灵敏度差。随后，又有较简单且更灵敏的荧光免疫(fia)、放射免疫(ria)方法，以改善cysc含量测定的可靠性，这些测定方法都为非均相检测，操作程序复杂、检测时间长，不便于临床广泛应用。近年来出现了颗粒增强散射免疫比浊法(penia)和胶乳颗粒增强透射免疫比浊法(petia)，这两种方法为均相测定，方法间具有良好的相关性，影响因素少，测定时间短，可在全自动生化分析仪上进行常规检测。均相发光免疫分析具有均相、一步、免清洗和高通量检测等一系列优点，方法的精密度更高，但存在hook现象，溶血和黄疸的标本会影响检测结果。3.同位素稀释质谱技术(id/ms)具有绝对测量性质、灵敏度高、方法准确、测量范围宽、样品制备不需要严格定量分离、测量值能够直接溯源到国际单位制的物质的量的基本单位—摩尔等优点。id/ms已被广泛应用于蛋白类生物标记物的定量检测，已建立id/ms法定量检测的蛋白/肽包括载脂蛋白a-i(apoa-i)，前列腺特异性抗原(psa)，c-反应蛋白(crp)，胰岛素样生长因子结合蛋白-3(igfbp-3)，髓过氧化物酶(mpo)、多重耐药相关蛋白14(mrp14)、n端前b型脑钠肽(ntprobnp)、肌钙蛋白i(ctni)、肌钙蛋白t(ctnt)、白介素-33(il-33)、载脂蛋白b(apob)、人转铁蛋白(htrf)、c-肽、β淀粉样肽(1-42)(aβ42)、cysc、尿白蛋白等。但由于同位素标记物的确定和目标蛋白缺乏溯源性等问题，目前基于id/ms技术的对目标蛋白进行绝对定量的方法仍然十分有限，其中仅c-肽和aβ42具有国际公认的溯源性标准方法。4.由于蛋白/肽在结构上的复杂性，基于id/ms法进行蛋白/肽类生物标志物检测方法的开发，具有一定的特殊性。根据同位素标记内标种类的不同，基于id/ms定量蛋白/肽的方法分为四类：标记肽段作为内标的绝对定量法(absolutequantification，aqua)、标记多肽作为内标的定量串联体法(quantificationconcatamers，qconcat)、蛋白质标准物绝对定量法(proteinstandardabsolutequantification，psaq)和细胞培养稳定同位素标记定量法(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，silac)。采用不同的方法，同位素标记内标在不同的步骤加入样品中，加入越早，样品处理步骤引入的误差就越小，定量准确度越高。因此，理想内标应是同位素标记的完整蛋白，且该蛋白应具有与目标蛋白相同的物理化学性质，如相同的三级和四级结构、相同的翻译后修饰等。5.血清中cysc的含量测定方法各异，目前临床主要采用免疫学检测方法，这些方法以抗原抗体反应为基础，不可避免的产生交叉反应导致准确度欠佳，且国内外试剂厂商较多，不同生产厂家的试剂结果可比性差，测定结果有明显系统误差等缺陷，给临床诊疗带来了困惑和技术难题。因此，如何保证检验结果可比性与准确性成为实验室、临床、患者以及制造商所关心的问题。6.基于id/ms定量蛋白/肽的方法分为四类，方法各有优缺点：aqua法使用最为广泛，因为aqua法不仅可用于常规蛋白的绝对定量，还可用于翻译后修饰(如磷酸化)蛋白的绝对定量，且同位素标记肽段可商品化购买，使用非常方便，因此该法在蛋白绝对定量中得到广泛应用，但该内标肽段是在蛋白酶解后加入，忽视了样品前处理过程中目标蛋白损失和酶解不完全造成的误差，因此定量结果不准确。qconcat法蛋白也没有参与样本前处理过程，无法补偿在样品前处理过程中目标蛋白的丢失，定量准确性也欠佳，因此在临床医学中极少应用。psaq蛋白是在非细胞生物系统中合成，与内源性目标蛋白酶解速率可能存在差异，且稳定性差和表达量低；由于使用的是非细胞表达系统，因此表达量有限，不能用于大规模样品的测定。silac法与psaq法唯一的区别，就是使用细胞生物系统合成稳定同位素标记蛋白内标。silac法使内标蛋白与内源性目标蛋白在样品处理和蛋白酶解效率方面差异降到最低，且蛋白表达量高，可用于大规模样品的定量检测，因此silac法是当前蛋白绝对定量最准确的方法。但目前仍然没有基于silac法使用完整蛋白作为同位素标记内标进行血清cysc进行蛋白绝对定量的方法。技术实现要素：7.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于silac进行血清胱抑素c绝对定量的质谱方法。8.本发明首先对目标蛋白cysc的特征肽段进行生物信息学分析，使用expasy软件中的peptidemass工具预测胰蛋白酶水解cysc后产生的肽段。然后通过protparam工具对特征肽段的理化性质进行检索分析。选择稳定性和溶解性均较好的特征肽段作为候选肽段。然后，基于筛选出的候选肽段的目标分子信息，采用lc-ms/ms技术的多反应监测原理(mrm)有针对性地选择数据进行质谱数据采集，对于符合目标离子规则的信号进行采集，去除不符合规则的离子信号的干扰。根据lc-ms/ms技术对特征肽段定量的特点，筛选出特异性的分析肽段。对cysc碎片以及被离子修饰发生化学变性的各种形式cysc初步鉴定。将cysc标准品进行胰蛋白酶水解，高分辨质谱对水解后的样本进行蛋白组学分析。分离出的蛋白碎片按不同的分离时间进入质谱，肽段在质谱仪中受到高速电子轰击后，可形成离子及断裂成各种不同大小的带电碎片，断点主要在肽键处，高分辨飞行时间质谱可测定碎片的质荷比，推导出质量，进而得出氨基酸序列。对所得碎片的氨基酸序列进行分析，验证其是否包含筛选出的特征肽段。9.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种基于silac进行血清胱抑素c绝对定量的质谱方法，包括以下步骤：10.s1.制备15n标记的cysc完整蛋白内标；11.s2.在进行血清中cysc定量检测的过程中向血清样本中加入15n标记的cysc后对样本进行前处理；12.所述前处理包括以下步骤：目标蛋白预分离；蛋白变性、还原和烷基化；蛋白水解、脱盐及纯化。13.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，所述15n标记的cysc完整蛋白内标的制备具体为：利用大肠杆菌原核表达或毕赤酵母真核表达和发酵、纯化合成15n标记的cysc蛋白，特征性的标记同位素。14.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，可用cysc的特异性肽段代表cysc进行cysc的定量分析。15.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，所述cysc的特异性肽段的氨基酸序列如seqidno：2所示。16.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，所述样本前处理采用特异性抗体-m270环氧树脂磁珠免疫共沉淀提取血清中cysc。17.id/ms作为国际物质量咨询委员会(ccqm)推荐的具有绝对测量性质的方法，同位素内标是必然选择。而id/ms定量蛋白质过程中，采用不同同位素标记内标的方法，内标在不同的步骤加入样品中，加入越早，样品处理步骤引入的误差就越小，定量准确度越高。silac得到的同位素内标与目标蛋白具有相同结构和理化性质，可使得内标蛋白与内源性目标蛋白在样品处理和蛋白酶解效率方面差异降到最低，是当前蛋白绝对定量最准确的方法。18.本发明采用细胞培养的方法进行cysc完整蛋白内标的制备：利用大肠杆菌原核表达或毕赤酵母真核表达技术和发酵、纯化技术合成15n标记的cysc蛋白，特征性的标记同位素，并对其纯度和结构分别采用sds-page和maldi-tofms进行了确定。在进行血清中cysc定量检测的过程中向血清样本中加入15n标记的cysc后对样本进行前处理，主要包括：目标蛋白预分离；蛋白变性、还原和烷基化；蛋白水解、脱盐及纯化等步骤。对id-lc-ms/ms检测方法的色谱、质谱条件进行系统优化。对血清样本的前处理进行系统的验证，主要包括：高丰度蛋白的去除、不同还原剂和烷基化试剂的比较、胰蛋白酶的选择、酶与底物比例的优化、酶切时间的优化、固相萃取柱的筛选及萃取效率的评价等，确定最优的样本前处理条件。19.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，所述蛋白水解中采用的蛋白水解酶为promega(v5280)质谱级的酶。20.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，所述蛋白水解中底物：酶＝2:1，w/w。21.作为本发明所述质谱方法的优选实施方式，所述蛋白水解的孵育时间为12h～16h。22.本发明对初步建立的id-lc-ms/ms血清cysc绝对定量方法的主要性能：灵敏度、方法特异性、精密度、准确度、线性范围、基质效应等进行评估，并对选用的cysc蛋白标准物质和氨基酸标准物质进行国际单位(si)溯源研究，实现靶向蛋白的精准定量，开发血清cysc绝对定量方法。更好地阐明血清cysc的特性、含量及其诊断肾脏疾病的价值。23.本发明的有益效果：24.(1)本发明公开了基于silac人血清胱抑素c绝对定量方法的建立与性能评价，首次使用15n标记的cysc完整蛋白作为内标进行目标蛋白的绝对定量，极大的降低了在样本前处理过程中由样本损失，酶切不完全等造成的结果误差。25.(2)样本前处理采用特异性抗体-m270环氧树脂磁珠免疫共沉淀，提取效率较现有方法高，提高了实际样本检测灵敏度和抗干扰能力。26.(3)采用cysc国家标准物质gbw09870联合氨基酸分析法进行血清中cysc检测的量值溯源，使得检测结果可溯源到国际单位制(si)。附图说明27.图1为经不同前处理试剂盒处理的血清样本cysc检测色谱图；其中，a：bluealbuminandiggdepletionkit处理的样本，b：piercetmtop12abundantproteindepletionspincolumns处理的样本，c：采用特异性抗体-m270环氧树脂磁珠免疫共沉淀方法处理的样本。28.图2为酶与底物比例的优化结果图。29.图3为检测标准物质erm-da471-ifcc的结果图。30.图4a为特征肽段ms/ms二级离子扫描图；b：15n-cysc蛋白内标胰蛋白酶水解后特征肽段ms/ms二级离子扫描图。31.图5为胰蛋白酶水解后15n-cysc蛋白色谱图。具体实施方式32.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。33.实施例115n同位素标记的重组胱抑素c原核表达及蛋白纯化34.1)目的基因合成35.从pubmed蛋白库中检索获得cysc蛋白的氨基酸序列，并对该序列进行优化。分析蛋白的1-20号氨基酸为跨膜区域，然后去除信号肽，并在序列羧基端融合6xhis标签。其目的是为了便于后续实验中使用镍柱对蛋白进行纯化。在优化时增加了对应序列，优化后目的蛋白分子量约为15kd。在pubmed基因库中得到对应的核酸序列。对该序列分析，在primerprimer5.0软件进行密码子使用偏好性调整、密码子使用分布优化及gc含量优化等设计。分析限制性酶切位点分布。最终设计得到含ncoi-xhoi酶切位点的优化的基因序列。优化后的基因序列对应的氨基酸序列与优化前氨基酸序列进行比对，优化前后氨基酸序列保持一致。36.表1原始和优化的cysc基因密码子分布[0037][0038]表1(续)原始和优化的cysc基因密码子分布[0039][0040][0041]2)重组质粒的构建[0042]合成的基因与pet28a(+)质粒同时使用ncoi和xhoi酶进行双酶切。使用琼脂糖凝胶电泳对酶切后的产物进行回收纯化，然后采用说明书推荐体系进行连接反应。瞬时离心后置22℃过夜连接。连接产物通过化学法转化大肠杆菌top10，取适量菌液均匀涂布于含卡那霉素的抗性平板放置于37℃恒温培养箱中。待菌液吸收干净后倒置培养基，于37℃恒温培养过夜；挑取阳性克隆菌落进行质粒提取并进行ncoi和xhoi双酶切及琼脂糖凝胶电泳的双酶切鉴定。[0043]3)重组蛋白的表达[0044]①将重组质粒转化至大肠杆菌rosetta[0045]a.向100μl感受态细菌中加入1μl质粒，置冰上20min；[0046]b.42℃热激90s，迅速置冰中5min，加入600μllb培养液；[0047]c.在37℃，220rpm条件下振摇1h然后离心，离心完全部涂布于含50μg/mlkan+的lb平板，37℃倒置培养过夜。[0048]②iptg诱导15n标记pet28a(+)融合蛋白的表达[0049]a.在转化平板上挑取单克隆接种于含50μg/mlkan+的10mllb培养液的试管中，在37℃条件下，220rpm振摇过夜；[0050]b.次日，向到培养物中加入iptg(终浓度0.1mm)；[0051]c.诱导融合蛋白表达：37℃，220rpm振摇4h；[0052]d.取出1ml培养物，室温，10000g离心2min。弃上清，用100μl上样缓冲液重悬菌体沉淀并直接100℃煮10min后上样。如蛋白有表达，则进行后续步骤；[0053]e.取5ml步骤b中的菌液，10000g，离心2min收集菌体，用2mlm9培养基重悬菌体，10000g，离心2min收集菌体，重复此步骤2遍。将菌种接种到含有2l15n的m9培养基(含50μg/mlkana+)中，37℃220rpm振摇至菌体od600为0.6-0.8。[0054]4)蛋白提取与纯化[0055]①4000g，离心10min，收集菌体弃上清，用pbs重悬菌体后再次离心收集菌体，0.01mpbs重悬液进行超声波破碎后(按1:1000比例加入aebsf或cocktail)，4℃，8000rpm，离心20min，取上清，沉淀保留；[0056]②上清纯化：ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱采用ni-idabinding-buffer进行预平衡，平衡完后利用低压层析系统以0.5ml/min的流速进行上样；[0057]③用ni-idabinding-buffer(20mmtris-hcl，0.15mnacl，ph8.0)以0.5ml/min的流速进行冲洗，至流出液od280值到达基线；[0058]④用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，10mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min的流速冲洗，至流出液od280值到达基线；[0059]⑤用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，50mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；随后分别以含有100mm、150mm、300mm咪唑的ni-idaelution-buffer，其他条件相同的情况下进行目的蛋白的洗脱，并收集流出液；[0060]⑥将上述收集的流出液集中放入透析袋中，使用0.01mpbsph7.2-7.4进行透析过夜；[0061]⑦20mmtris，8m尿素进行蛋白沉淀，300mmnacl，ph8.0直接溶解沉淀样品后进行离心，离心条件为：4℃，8000rpm，20min。离心完后收集上清，再按照步骤②‑⑥进一步进行蛋白纯化。[0062]5)小规模纯化测试[0063]按照3)的蛋白表达步骤，培养基用200mlm9，不含15nh4cl标记组分(含普通的nh4cl)进行诱导表达分析。[0064]6)放大与15n标记[0065]按照3)的蛋白表达步骤，培养基用1lm915nh4cl，扩大培养，并按照3)步骤进行蛋白表达与纯化。[0066]7)maldi-tofms对cysc标准品与重组表达纯化的15n标记的cysc产物进行鉴定[0067]将纯化得到的15n-cysc和cysc标准品一起，进行maldi-tofms分析。[0068]在进行maldi-tofms前，需要对样本进行一定的处理，主要步骤为：[0069]①准备蛋白标准品溶液：分别为0.29mg/ml15n-cysc和0.3mg/mlcysc；[0070]②溶液基质的配制：10mg/ml芥子酸(含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(50:50，v/v)溶液)；[0071]③1μl上述标准品溶液分别加入溶液基质中；[0072]④让样本分散在基质分子中并形成共结晶后滴在钢靶上；[0073]⑤在室温下放置使得溶剂挥发；[0074]⑥在m/z为10000-120000的范围内进行正离子扫描。[0075]实施例2cysc特征肽段的选择[0076](1)cysc蛋白序列信息[0077]ncbi蛋白数据库查cysc蛋白序列信息如下：[0078]cystatin-cprecursor[homosapiens][0079]ncbireferencesequence：np_000090.1[0080]蛋白序列如下：[0081]1magplrapllllailavalavspaagsspgkpprlvggpmdasveeegvrraldfavgey[0082]61nkasndmyhsralqvvrarkqivagvnyfldvelgrttctktqpnldncpfhdqphlkrk[0083]121afcsfqiyavpwqgtmtlskstcqda(seqidno：1)[0084](2)cysc经胰蛋白酶水解后产生的肽段预测。[0085]expasy软件中的peptidemass工具预测cysc经胰蛋白酶水解后产生的肽段，理论等电点pi：8.75/mw(averagemass)，分子量：13347.14。[0086](3)特征肽段的理化性质检索分析。[0087]通过protparam工具对特征肽段的理化性质进行检索分析，主要包括水解肽段的mr、平均亲水系数、等电点、酸碱性和稳定性进行分析。选择稳定性和溶解性均较好的特征肽段作为候选肽段。[0088]根据质谱定量特征肽段筛选的原则，考虑特征肽段对于目标蛋白的特异性，以及质谱检测过程中要求的分子量范围，稳定性等因素，本发明选取的肽段序列为aldfavgeynk(seqidno：2)。它在色谱柱上具有良好的保留，可溶于水，序列中不含有半胱氨酸和甲硫氨酸等易发生化学修饰的位点，不含有肽键易酶解断裂的脱酰胺的n端谷氨酰胺和天冬氨酸-甘氨酸序列等特殊序列形式。此外，该序列通过blast检索，发现该肽段序列仅在cysc(accessionno.np_000090.1(homosapiens)中包含，为其特异性肽段，表明该特征肽段可以代表cysc用来进行cysc的定量分析。[0089]实施例3质谱条件的确定[0090]肽段标准品质谱条件确认：针对筛选出的特征肽段，由生物公司进行特征肽段及其同位素标记内标的合成。配制1ml特征肽段标准品，浓度1μg/ml，针泵进样。[0091]cysc蛋白标准品和15n标记的cysc蛋白标准品质谱条件确认：10μgcysc或15n标记的cysc蛋白标准品按照蛋白样本前处理步骤进行蛋白变性，还原烷基化和蛋白水解后，针泵进样。[0092](1)离子对选择[0093]1)q1ms一级全扫描。[0094]2)特征肽段子离子扫描(productionms2)[0095]输入母离子质荷比；[0096]优化ce，范围5-30，观察子离子与母离子信号强度，选择信号最强的2个子离子为选定子离子，分别作为定量和定性使用；[0097]3)mrm优化[0098]确定好母离子和子离子后，对mrm条件中去簇电压(dp)、碰撞能(ce)，出口电压(cxp)等进行优化。优化范围dp：0-300；ce：5-180；cxp：0-14。[0099]4)特征肽段质谱结果[0100]①特征肽段：aldfavgeynk；分子量：1226.36。[0101]②母离子扫描，扫描范围：300-1500m/z；分辨率：70,000；最大进样时间：50s；喷雾电压：2.1kv；毛细管温度：320℃；s-lensrf水平：50。[0102]③特征肽段母离子(ms1)质谱扫描结果显示，其母离子离子化碎片信息[m+h]+和[m+2h]2+的质荷比(m/z)分别为：1226.61和613.81。其中[m+2h]2+的离子相应更高，因此选择[m+2h]2+(613.81)为母离子预测ms/ms二级离子(子离子)。[0103]④ms/ms二级离子扫描[0104]扫描范围：400-1200m/z；扫描模式：aif-ms/ms二级离子扫描。[0105]特征肽段母离子：m/z-613.81。[0106]分辨率：70,000；nce：30v；最大进样时间：50s；喷雾电压：2.1kv；毛细管温度：320℃；s-lensrf水平：50。[0107]结果：通过ms/ms扫描得到的碎片离子，特征肽段y+3-y+9结果分别为424.22，553.26，610.28，709.35，780.39，927.46，1042.48。[0108]5)内标蛋白质谱结果[0109]15n-cysc蛋白内标胰蛋白酶水解后特征肽段母离子扫描，用15n-cysc蛋白经蛋白前处理酶切完成后得到的肽段溶液进行特征肽段母离子扫描。[0110]扫描范围：300-1500m/z和500-700m/z。[0111]结果：特征肽段母离子质谱扫描结果显示，其母离子离子化碎片信息[m+h]+和[m+2h]2+的质荷比(m/z)分别为：1237.56和619.79，根据特征肽段含有13个n元素，结合同位素标记率≈95％，预计能够被标记的n为11-13个。15n-cysc的特征肽段的[m+h]+1237.56比cysc的特征肽段的[m+h]+1226.61大11，因此可初步断定特征肽段中有11个n被同位素标记。选择[m+2h]2+(619.79)为母离子预测ms/ms二级离子(子离子)，来进一步验证。[0112]ms/ms二级离子扫描：[0113]扫描范围：400-1200m/z；扫描模式：aif-ms/ms二级离子扫描。[0114]特征肽段母离子：m/z-613.81。[0115]分辨率：70,000；nce：30v；最大进样时间：50s；喷雾电压：2.1kv；毛细管温度：320℃；s-lensrf水平：50。[0116]母离子：[m+2h]2+(619.79)；[0117]内标肽段y+5-y+9结果分别为616.27，716.33，788.39，936.43，1052.46。[0118]未被标记的特征肽段y+5-y+9ms/ms二级扫描离子为：610.28，709.35，780.39，927.46，1042.48。其中y+9分子量差10，y+8分子量差9，y+7分子量差8，y+6分子量差7，y+5分子量差6。[0119]实施例4色谱条件的确定[0120]仪器：waterstq-s三重四极杆质谱仪；[0121]检测时间：5min；[0122]流速：0.3ml/min，进样量：7μl；[0123]色谱柱：acquitybeh,c18,1.7μm,100mm×2.1mm；[0124]柱温：40℃；[0125]流动相b：0.1％fa乙腈；流动相a：0.1％fa水相。[0126]cysc定量检测流动相梯度：[0127]time，mina，％b，％09551.09552.510903.410903.59555.0955[0128]实施例5样本前处理[0129]1)优选为采用特异性抗体-m270环氧树脂磁珠免疫共沉淀方法，对目标蛋白进行靶向富集。[0130](1)磁珠称量和重悬[0131]a.电子天平称取6mg磁珠于1.8mlep管中；[0132]b.加入1ml的buffera涡旋混匀，1200rmp，26℃，10min；[0133]c.将ep管置于磁力架1-2min，弃上清；[0134]d.重复步骤c1-2一次。[0135](2)磁珠-抗体偶联[0136]a.向ep管内加入140μl的buffera(0.1m磷酸钠盐缓冲液，ph＝7.4)、60μl的特异性抗体和100μl的bufferb(3m硫酸铵)，轻轻吹打混匀；[0137]b.1200rmp，26℃孵育12-16h；[0138]c.将ep管置于磁力架上1-2min，弃上清；[0139]d.取下ep管，加入1ml含0.1％bsa的pbs，轻轻吹打混匀；[0140]e.将ep管置于磁力架上1-2min，弃上清；[0141]f.重复步骤d-e两次，共洗三次；[0142]g.向ep管中加入600μl的pbs，轻轻吹打混匀；[0143]h.将磁珠均分为3份，每份200μl；[0144]i.将分装后的ep管置于磁力架1-2min，弃上清。[0145](3)磁珠-抗体复合物与血清cysc免疫共沉淀[0146]a.向ep管中加入500μl样本(400μl血清+100μl内标，提前混匀)；[0147]b.1200rmp，26℃孵育3h；[0148]c.将ep管置于磁力架上1-2min，弃上清；[0149]d.向ep管中加入1ml的pbs，轻轻吹打混匀；[0150]e.将ep管置于磁力架上1-2min，弃上清；[0151]f.重复步骤d-e两次，共洗三次。[0152](4)洗脱[0153]a.取下ep管，加入250μl的pbs，再加入2.5μl的10％sds，涡旋混匀；[0154]b.将ep管置于100℃金属浴10min；[0155]c.取下ep管，恢复室温后将ep管置于磁力架上1-2min；[0156]d.将上清吸出，转移到新的ep管中。[0157](5)蛋白变性、还原、烷基化及酶解[0158]蛋白变性：用pbs补齐体系体积至250μl，向2mlep管中分别加入50μgkit处理后血清样本，加入pbs使反应体积达到250μl，涡旋后瞬离；加热变性，100℃，金属浴5min；[0159]还原、烷基化：还原、烷基化反应(tcep:caa＝1:4)：加6.25μl400mmtcep(终浓度为5-10mm)，同时加12.5μl800mmcaa(终浓度为5-10mm)，旋涡后4℃瞬离，放入37℃孵箱孵育1h；[0160]超滤：nanosep10komega超滤管进行超滤。[0161]a.平衡超滤膜：往超滤管中200μl100mmabc溶液，12000g离心10min(不同牌子超滤管平衡液不一样，看说明书进行操作)；[0162]b.将上述样本(约300μl)全部转移至超滤管中，轻轻吹打混匀，12000g，4℃离心5min；[0163]c.待样本超滤后，加入100μl100mmabc溶液(除盐及置换酶解的缓冲体系)，13500g，4℃离心5min，重复5次，弃去滤液或更换新的收集管。[0164]酶解：酶解体积约50μl，底物：酶＝(w/w)；采取trypsin(promega)：底物＝1:50先消化2-4h，然后用trypsin(promega)：底物＝1:100后消化16h(过夜)进行酶解。[0165]a.设置酶解体系约为50μl，按照底物：酶＝2:1(w/w)比例计算加入胰酶体积约为2μl，则加入100mmabc溶液补足体积至50μl，轻轻吹打混匀，4℃低速(约100-300rpm)瞬离1-2min；[0166]b.37℃孵育2-4h；[0167]c.按照底物：酶＝20:1(w/w)比例计算加入胰酶体积约为1μl，轻轻吹打混匀，封口膜封口避免孵育时溶液挥发，4℃(约100-300rpm)瞬离1-2min；[0168]d.37℃孵育16h(至少12小时)，过夜；[0169]e.终止酶解：孵育过夜后，13500g，4℃离心5min，用100μlabc溶液清洗2次，收集滤液，用abc溶液补齐体系至450μl，加入1％tfa(50μl)终止消化。[0170](6)除盐[0171]a.活化：spe柱加入750μl乙腈(或甲醇)，流速控制在1-2ml/min(可自然滴落)，重复操作3次，弃去滤液；[0172]b.平衡：spe柱加入750μl0.1％tfa，流速控制在1-2ml/min(可自然滴落)，重复操作4次，弃去滤液。注意：加载样本前柱子保持湿润状态，不要抽干平衡液；[0173]c.加载样本：将样本装载到柱子，流速控制在1-2ml/min(可自然滴落)，待样本第一次完全过柱后，将收集管中的溶液再次过柱，保证柱子完全吸附样本，弃去滤液；[0174]d.冲洗：spe柱加入750μl0.1％tfa+5％甲醇溶液，流速控制在1-2ml/min(可自然滴落)，重复操作3次；冲洗最后一次时可将流速加快，抽干柱子填料里的溶液，保持较为干燥的状态，弃去滤液；[0175]e.洗脱：spe柱加入500μl0.1％tfa+80％乙腈溶液，流速控制在1-2ml/min(可自然滴落)，重复操作2次，收集滤液；[0176]f.浓缩：先氮吹仪吹1-2h以助于有机溶剂挥发，之后用冷冻浓缩仪真空抽(旋)干，约1h；[0177]g.复溶：0.1％fa复溶(可加2-3％乙腈)，复溶后体积约20-100μl。[0178]实施例6样本前处理条件的优化[0179](1)不同前处理试剂盒的比较[0180]人血浆或血清样本中蛋白含量及种类较多，不同种类的蛋白浓度跨度很大，其中与疾病相关的蛋白大多为低丰度蛋白。在进步靶向蛋白检测或进行蛋白组学分析时，高丰度蛋白往往会掩盖低丰度蛋白，因此去除高丰度蛋白是进行蛋白定量或蛋白组学研究的必须步骤。[0181]本发明分别比较了piercetmtop12abundantproteindepletionspincolumns，bluealbuminandiggdepletionkit和特异性抗体-m270环氧树脂磁珠免疫共沉淀提取血清中cysc三种样本前处理的方法。[0182]结果发现，bluealbuminandiggdepletionkit处理的样本，血清量可以达到70-100μl，但经过其前处理后仍含有较高的蛋白量，而且从色谱图中可以看到，其目标离子的基线存在明显干扰。piercetmtop12abundantproteindepletionspincolumns处理完后，总蛋白含量有明显降低，色谱峰的目标离子处干扰较少，但由于其血清量只能为10μl，影响了其检测的灵敏度，而且这种试剂盒的成本较高，适合于蛋白组学的样本前处理，对于单个蛋白的靶向处理优势有限而且成本较高不适合长期使用。而使用特异性抗体-m270环氧树脂磁珠免疫共沉淀靶向提取血清中cysc的方法进行样本前处理，可以对目标蛋白进行精准的富集，血清量可以达到100μl，甚至更高，减少了样本中杂质的干扰，而且有助于提高检测的灵敏度。[0183](2)spe-pakc18萃取回收率优化[0184]盐类在电喷雾系统中有强烈的竞争性离子化作用，引起较强的离子抑制效应，使待测物的灵敏度明显降低。此外，盐类还会腐蚀和污染质谱硬件系统，严重时导致硬件损坏，蛋白酶消化体系中含有较多盐类，因此在用质谱对胰酶消化肽进行分析时，应首先进行脱盐处理。脱盐最常使用商品化反相spe柱，该柱使用方便，脱盐效果好。样本脱盐及纯化后应蒸干，并通常使用流动相a复溶。但目前市面上spe柱产品较多，不同品牌的spe柱对目标肽段的萃取回收率不同，因此本发明选取3种不同spe柱进行了萃取率的比较和优化。分别为：[0185]agela-spe：型号为100mg/1ml，100/pkg；货号为s181001；[0186]techway-spe：型号为100mg/1ml，100/pkg；货号为20102-1010；[0187]waters-spe：型号为1cc，50mg，货号为wat054955。[0188]因为spe处理最关键的是要减少目标肽段的损失，本发明直接用500ng/ml的特征肽段和内标进行实验。[0189]实验分组：[0190]注：before是指spe柱处理前加入内标肽段(is)液，after是指spe柱处理后再加入内标肽段(is)。is：内标肽段。[0191]表2spe-pakc18萃取回收率优化实验分组[0192][0193]针对本优化实验的溶液体系配制：[0194]a1、b1和c1组各加入超纯水400μl至1.5ml离心管中，然后吸取50μl，500ng/ml特征肽段标准品溶液和50μl，500ng/ml内标肽段标准品溶液，将体系补足至500μl。[0195]a2、b2和c2组各加入超纯水450μl至1.5ml离心管中，然后吸取50μl，500ng/mlpeptide溶液，将体系补足至500μl。[0196]spe活化操作：[0197]按照上述spe柱活化方法，[0198]a组各取4支agela的spe柱，分别标记上a1-1、a1-2、a2-1、a2-2；[0199]b组各取4支techway的spe柱，分别标记上b1-1、b1-2、b2-1、b2-2；[0200]c组各取4支waters的spe柱，分别标记上c1-1、c1-2、c2-1、c2-2。[0201]质谱检测：[0202]在进样瓶身上分别标记a1-1、a1-2、a2-1、a2-2；b1-1、b1-2、b2-1、b2-2；c1-1、c1-2、c2-1、c2-2。将复溶后的溶液全部转移至进样瓶中，涡旋震荡3-5秒，避免产生气泡，进样检测。[0203](3)蛋白变性、还原剂与烷基化试剂的优化[0204]蛋白变性剂可使用热变性，也可使用化学变性剂变性，如尿素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠(sds)、脱氧胆酸钠(doc)、三氟乙醇(tfe)、乙腈(acn)和甲醇(meoh)等，其中尿素最常用，其通过破坏蛋白内部疏水键使蛋白变性，变性浓度通常为6m或8m。在使用尿素变性前，如预先将样本进行热变性，可提高蛋白变性效率。[0205]蛋白酶切前需要将分子间的二硫键进行还原，阻止半胱氨酸间形成蛋白质分子内或分子间二硫键，最常使用的还原剂有：三(2-羧乙基)膦(tcep)和二硫苏糖醇(dtt)。与dtt相比，tcep不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉，可在常温下反应。因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常优先选择tcep。[0206]氰乙酰胺(caa)和碘乙酰胺(iaa)为最常使用的烷基化试剂，其可迅速与半胱氨酸上巯基(-sh)反应，阻止二硫键的再次形成，保持蛋白的还原状态。但iaa见光易分解而且能够与还原试剂反应，iaa做为蛋白质烷基化试剂使用时一般不可配制储存溶液，需现用现称，反应时容器亦应用锡箔纸裹住。因此如果使用iaa进行蛋白烷基化一般先使用还原剂进行还原反应30min后加入过量iaa(1:5)再进行30min的烷基化，而且多的iaa会造成过度乙酰化，使非半胱氨酸乙酰化，因此还需使用dtt将多余的iaa中和，操作相对复杂而且等待时间也比较长。而使用caa比较稳定，且不与还原剂反应，可以与还原剂一起加入，减少操作步骤，节约反应时间。[0207]因此本发明将样本进行热变性然后加入尿素变性，再加入tcep和caa进行还原-烷基化，提高了样本前处理的效率。[0208](4)胰蛋白酶种类优化：[0209]蛋白水解是id-ms法准确定量蛋白的关键步骤，尤其对aqua法而言。蛋白水解酶包括胰蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-n(lys-n)、胞内蛋白酶赖氨酸-c(lys-c)、糜蛋白酶、胃蛋白酶等，其中胰蛋白酶具有较高的水解效率，可特异性水解赖氨酸和精氨酸羧基端肽键，因此最为常用。胰蛋白酶类型、孵育时间、酶与底物质量比等均会影响酶解效率。虽然本发明最终选用silac蛋白内标法进行cysc的精准检测，同位素标记的cysc在样本前处理前就加入血清标本并混匀，不同酶的消化效率理论上对正确度的影响较小，但酶消化的效率直接影响了所获得但特征肽段的绝对量，从而影响质谱的检测灵敏度，酶解效率太低会导致获得的特征肽段少，从而使得检测灵敏度低，因此，优化酶解效率对本发明仍然具有非常重要的意义。[0210]首先，对胰蛋白酶的种类进行优化，通过选择不同品牌的胰蛋白酶对cysc标准品进行蛋白水解，水解后，在除盐之前加入已知量的特征肽段内标进行lc-ms/ms检测。[0211]实验分组：[0212]表3胰蛋白酶种类优化实验分组[0213]groupscysc,μgis,ngtrypsintrypsin/protein(w/w)a525promega(v5280)1:10b525sigma(93614-1g)1:10c525thermo(90057)1:10[0214]注：w/w是质量比。[0215]实验操作：[0216]a.溶液体系配制：实验组各加入245μlpbs至1.5ml离心管中，然后吸取5μl1mg/mlcysc溶液，将体系补足至250μl。[0217]b.酶解：酶解体积约50μl，按照酶：底物＝1:10(w/w)先消化2-4h，然后用按trypsin：底物＝1:100补充胰蛋白酶后消化过夜(共16h)。底物的量为cysc的量为5μg，经计算，应加入5μl0.1μg/μl胰蛋白酶。[0218]c.lc-ms/ms检测。[0219]结果发现，采用promega(v5280)质谱级的酶进行酶切，在相同酶切条件下，酶解效率最高。因此选择该酶作为样本前处理中的蛋白水解酶进行后续研究。[0220](4)酶与底物比例的优化：[0221]酶与底物质量比对酶切效率也有较大的影响，本发明对酶切比例也进行了优化。在确定选用promega(v5280)质谱级的酶进行蛋白水解后，本发明进一步对酶与底物质量比例进行了优化，由于需要计算酶解后特征肽段的绝对回收率，因此选择在酶解完成后加入已知量的同位素标记的特征肽段作为内标进行评价，即采用aqua法进行酶解效率的比较。[0222]实验分组：[0223]表4酶与底物比例的优化实验分组[0224]groupscysc,μgis,ngtrypsin/protein(w/w)a5251:2b5251:5c5251:10d5251:20e5251:50f5251:100[0225]注：w/w是质量比。[0226]a：底物：酶＝2:1(w/w)则酶的量为2.5μg，经计算应加入5μl0.5μg/μl酶；[0227]b：底物：酶＝5:1(w/w)则酶的量为1μg，经计算应加入10μl0.1μg/μl酶；[0228]c：底物：酶＝10:1(w/w)则酶的量为0.5μg，经计算应加入5μl0.1μg/μl酶；[0229]d：底物：酶＝20:1(w/w)则酶的量为0.25μg，经计算应加入2.5μl0.1μg/μl酶；[0230]e：底物：酶＝50:1(w/w)则酶的量为0.1μg，经计算应加入2μl0.05μg/μl酶；[0231]f：底物：酶＝100:1(w/w)则酶的量为0.05μg，经计算应加入1μl0.01μg/μl酶。[0232]实验操作：[0233]a.按照上述计算出应加入的酶的量。[0234]b.每组平行2个标本，每个标本进样2次，一共4个检测结果。[0235]本部分研究结果表明，不同比例的酶对蛋白水解的效率之间存在显著差异，且当底物：酶＝2:1(w/w)时酶解效率最高，图2，因此，选择该比例进行后续条件的优化。[0236](5)蛋白水解不同孵育时间优化：[0237]本发明优化了采用promega(v5280)质谱级的酶，在底物：酶分别为2:1和5:1(w/w)情况下不同孵育时间的酶解效率(孵育时间分别为0.5，1，2，4，8，12，16，24h)。比较了不同孵育时间的酶切效率。本部分研究结果表明，蛋白水解的孵育时间最好大于12h，否则蛋白可能没有酶解完全，从而影响检测的灵敏度。本发明选择蛋白水解的孵育时间为16h。[0238](6)方法性能[0239]灵敏度：[0240]在检测了系列低值样本后发现，浓度为0.1ng/ml时，s/n为3.87，确定为最低检测限(lod)；浓度为0.2ng/ml时，s/n为13.35，确定为定量检测限(loq)。需要注意的是，这两个检测限是有限定条件的，即使用100μl血清样本，采用多克隆抗体-纳米磁珠靶向提取血清中cysc处理的样本，前处理方式参考实施例5中的具体步骤。因此，本发明的lod为0.1mg/l，loq为0.2mg/l。[0241]方法特异性：[0242]由于本发明所选取的特征肽段是经过严格筛选出来，能够特异性的代表目标蛋白，具有较高的分析特异性。而且在本发明中针对选定的特征肽段，进行了多个离子对的监测，未发现其他化合物对其产生干扰。[0243]精密度：[0244]本发明中在低浓度方法变异小于5％，而高浓度样本小于3％，如表5。由于cysc在人体内的含量参考区间在0.51-1.09mg/l，肾脏病患者的cysc会达到5mg/l或以上，因此在相同浓度下的检测变异，本方法精密度与已公布其他蛋白类的国际参考方法相当。[0245]表5方法精密度[0246][0247]在浓度为0.5mg/l，1.0mg/l和5.0mg/l时批内和批间精密度范围分别为1.84％-3.22％和2.06％-4.33％。[0248]准确度：[0249]采用活性炭吸附人血清作为空白血清(cysc检测值为0)，分别加入0.5、1.0和5.0mg/l的cysc标准品(gbw09870)进行检测。[0250]标准品回收率96.1-103.4％；[0251]表6加标回收率[0252]added(mg/l)expecteddetectedrecovery，％cv，％n＝40.50.50.48196.11.651.01.01.029102.91.915.05.05.168103.41.03[0253]检测标准物质erm-da471-ifcc的结果为5.57±0.0(n＝3，偏倚：1.74％)，参见图3。[0254]线性范围：[0255]一般认为标准曲线的r》0.999即可接受线性范围，而线性范围与配制标准品配制的浓度有关，实验中配制的0.2到10.0mg/l一系列浓度标准品，得到的回归方程为：y＝2.1629x-0.0023，r＝0.9997。候选参考方法线性范围为0.2-10.0mg/l。[0256]携带污染率：[0257]携带污染率(1000.0ng/ml，％)＝0.4％，携带污染率小于1％。表明在现有实验条件下，没有明显的携带污染。[0258]表7携带污染率[0259][0260][0261]携带污染率(％)＝(l3-l2)/(h-l2)＝0.04％。[0262]基质效应评价：[0263]采用两组基质，每组4点的标准曲线去评价基质效应，分别进行线性回归分析，并计算血清组相对于纯水基质组的回收率，结果发现两组之间的线性没有太大差别，而且回收率接近100％，因此说明采用silac法进行样本前处理，基质对检测结果的影响较小，没有明显的基质效应。因此在进行定量过程的标准曲线建立过程中，为了减少实验步骤，和抗体损耗，可以采用纯水基质进行标准曲线的建立。[0264]表8基质效应评价线性回归结果分析[0265][0266]表9基质效应影响情况[0267][0268][0269]溯源性：[0270]无论实验何种检测方法，若要准确定量蛋白/肽取决于所使用的标准量值是否准确，即所使用的标准是否可溯源至si单位，这是实现蛋白定量检测标准化的必要步骤。silac法中使用的标准为目标蛋白纯品和同位素标记蛋白。其中同位素标记肽段和蛋白由于不影响定量，因此可不进行溯源分析。氨基酸分析(aminoacidanalysis，aaa)是唯一可绝对定量溶液中蛋白/肽的方法，且是蛋白/肽定量的金标准，本发明使用氨基酸分析法进行重组cysc纯标准品的定量检测，并进一步选用胱抑素c的国家标准物质gbw09870进行纯标准品的正确度验证，以满足计量溯源的要求。[0271]基于id-lc-ms/ms法的氨基酸分析，主要分为四大步骤：[0272](1)定量氨基酸种类的选择：有些氨基酸无法抵抗传统水解条件(6mhcl，120℃水解12h)，易被破坏或发生丢失。脯氨酸(pro)、缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)可耐受150℃水解高温，因此最常被选择用于氨基酸定量分析；[0273](2)蛋白质/肽水解为氨基酸；蛋白/肽水解方法通常包括化学法和酶法，化学法又包括酸水解法和碱水解法，所有方法中酸水解法最常用。通常使用hcl进行水解，对蛋白浓度、hcl浓度、水解温度、水解时间、蛋白保护剂等条件进行系统优化；[0274](3)色谱分离氨基酸；[0275](4)质谱定量检测氨基酸。氨基酸定量分析一般使用mrm模式在三重四级杆质谱仪上进行。[0276]cysc蛋白在6mol/lhcl，120℃条件下，反应12h，可完全水解成氨基酸。本发明以蛋白水解产物苯丙氨酸(phe)和缬氨酸(val)为研究对象，使用gbw09235苯丙氨酸标准物质，gbw09236缬氨酸标准物质，13c9,15n-phe和13c5-val为内标，建立括号法(bracketing)的标准曲线，分别计算水解产物phe和val浓度，从而准确定量cysc蛋白。[0277]蛋白溶液及标准溶液配制：[0278]从-70℃冰箱内取出cysc蛋白标准品，在室温下平衡30min，将蛋白浓度约1mg/ml的母液进行10倍稀释，得到约0.1mg/ml蛋白液。将蛋白液分装于安剖瓶中，密封后置-70℃冰箱保存。采用天平称重法进行试剂配制和稀释过程。所使用的天平为经校准的、精度为d＝0.01mg的电子天平。gbw09870出cysc蛋白标准物质不稀释直接检测。[0279]氨基酸标准品和内标品的配制：[0280]标准溶液母液：2mg/ml；[0281]配制步骤：[0282]‑‑用天平准确称取20mg氨基酸标准品，溶于10ml水中；[0283]‑‑储存：储存在-70℃冰箱。[0284]标准溶液工作液：2μg/ml；[0285]配制步骤：[0286]‑‑用移液器量取50μl标准溶液母液(2mg/ml)于50ml容量瓶中，用纯水定容；[0287]‑‑储存：储存在-70℃冰箱。[0288]用同位素标记的氨基酸作为内标品，采用标准溶液配制相同的方法配制内标品工作液：2μg/ml。[0289]使用包括法(bracketing)配制标准曲线，按照下表列出的比例和取样量，在15ml离心管中按照标准品和内标的质量比(massratio)为0.5，0.8，1.0，1.2和1.5分别加入不同体积的标准溶液工作液(ws)和相同体积的内标工作液(isws)。[0290]表10bracketing的方法配制标准曲线[0291]massratio0.50.81.01.21.52μg/mlws(μl)1001602002403002μg/mlisws(μl)200200200200200[0292]蛋白质酸水解步骤：[0293]向氨基酸水解管中加入约25mg蛋白液，根据加入蛋白物质的量，计算出蛋白完全水解后理论产生的phe和val物质的量，然后加入等摩尔13c9,15n-phe和13c5-val内标溶液。加入400μl6mol/lhcl，混匀后氮吹15min，为减少氨基酸的氧化，吹干后立即盖好盖子。于120℃烘箱中水解12h后取出，n2吹干，然后用1ml含0.1％甲酸水复溶，溶液经0.22μm滤膜过滤后上机测定。[0294]id-lc-ms/ms法的氨基酸分析：[0295]选用watersacquityuplctm串联xevotq-s三重四极杆质谱仪检测系统进行氨基酸的定量分析。色谱柱：acquityuplc@behc18,1.7μm,2.1×50mm。[0296]色谱条件：[0297]a)色谱柱：acquityuplc@behc18,1.7μm,2.1×50mm；[0298]b)柱温：45℃；[0299]c)流速：0.4ml/min；[0300]d)进样量：10μl；[0301]e)流动相b：纯乙腈(有机相)；流动相a：0.1％甲酸水溶液(水相)。[0302]表11氨基酸液相色谱洗脱条件[0303]time/minpumpa0.1％甲酸水(％)pumpb乙腈(％)09551.09553.040604.05954.55954.69556.0955[0304]串联质谱检测条件：[0305]电离模式：esi+；[0306]离子对参数：[0307]表12氨基酸串联质谱检测条件[0308][0309]样本检测顺序和结果计算：[0310]按照质量比为0.5，0.8，1.0，1.2和1.5的顺序依次检测工作校准曲线的5个点(先进低浓度的标准溶液，再进高浓度的标准溶液)，然后按照(质控品、样本)的顺序检测，待样本检测完毕后，再逆序检测工作标准曲线的5个点。[0311]选择两次检测标准液氨基酸/内标的质量比：0.5，0.8，1.0，1.2和1.5，及其对应的色谱峰的峰面积比建立工作曲线，其中以氨基酸/内标色谱峰的峰面积比为自变量，以质量比为因变量，建立标准曲线线性回归拟合方程，并建立工作曲线方程：y＝bx+m(1)[0312]x——氨基酸/内标质量比w；[0313]y——氨基酸/内标色谱峰的峰面积比i；[0314]b——标准曲线线性回归方程的斜率；[0315]m——标准曲线线性回归方程的截距。[0316]id-lc/ms/ms检测可得到氨基酸/内标色谱峰的峰面积比is，通过式(1)校准曲线可计算得到氨基酸/内标质量比ws。则样本浓度c可通过以下公式计算得到：[0317][0318]c——实际样本中氨基酸浓度，单位为μmol/l；[0319]vs——血清样本的体积；[0320]ws——血清样本中氨基酸/内标质量比；[0321]qi——血清样本中内标的含量，单位为μg；[0322]m——氨基酸摩尔质量，phe和val摩尔质量分别为165.19g/mol、117.15g/mol。[0323]式中：[0324]qi＝ci×vi；[0325]ws＝(is–m)/b；[0326]将其带入公式(2)：[0327][0328]c——实际样本中氨基酸浓度，单位为μmol/l；[0329]ws——血清样本中氨基酸/内标质量比；[0330]vs——血清样本的体积；[0331]is——样本中氨基酸/内标色谱峰的峰面积比；[0332]vi——加入内标溶液的体积；[0333]ci——内标溶液浓度；[0334]p——氨基酸标准品的纯度值(由标准物质证书提供)；[0335]m——氨基酸摩尔质量。[0336][0337]c——cysc摩尔浓度，单位为μmol/l；[0338]c——实际样本中氨基酸浓度，单位为μmol/l；[0339]mp——cysc的摩尔质量；[0340]n——蛋白序列中相应氨基酸的个数；[0341]aa——为氨基酸的摩尔质量；[0342]m——氨基酸摩尔质量。[0343]cysc标准品的测量结果：[0344]表13氨基酸法测量cysc标准品的结果[0345][0346]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12当前第1页12
