一种水凝胶及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种水凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.随着我国人口老龄化的加剧以及生活方式的改变，半月板损伤患者数量逐年增加。目前， 半月板损伤的发生率为12～14％，患病率为万分之六左右。除带来运动功能障碍外，半月板损 伤常并发膝关节骨性关节炎(oa)，给患者带来巨大痛苦。骨关节炎是一种退行性关节疾病， 涉及关节软骨破坏并可导致残疾。由于oa发病机制复杂，目前尚无积极有效的治疗手段。 2012年，kristen johnson课题组在《science》上报道了一种小分子化合物kgn，研究者通过 高通量筛选出的kgn在体外可促进干细胞向软骨细胞分化，并且局部注射kgn可有效促进 骨关节炎小鼠的软骨再生。但是，kgn水溶性差，易被组织清除，难以在关节腔内长期维持 有效浓度。类似的问题也存在于其他软骨损伤治疗药物如非甾体类抗炎药物上。
3.目前，尽管已有研究者提出将软骨损伤治疗药物结合生物医用高分子提高药物长期释放 性能，但是现有研究缺乏材料对关节支撑保护、材料润滑性能和治疗药物长期缓释的综合考 量。明胶和胶原是蛋白质类天然高分子，具有良好的生物活性和可生物降解外性，在骨和软 骨组织工程中展现出优异的应用前景。磷脂是含有磷酸的脂类，是组成生物膜的主要成分， 具有优异的疏水药物负载能力。然而，现有技术中，有的水凝胶在制备时需要进行紫外光光 照，并且，制得的水凝胶对关节缺乏润滑保护作用；有的水凝胶不具有生物活性，无法用于 软骨损伤修复。非生物医用领域的水凝胶中加有多种化学成分，生物安全性低，无法用于负 载软骨损伤治疗药物，不适用于生物医用领域。


技术实现要素：

4.根据第一方面，在一实施例中，提供一种水凝胶，包括：天然高分子化合物、磷脂、交 联剂，所述交联剂包括谷氨酰胺转氨酶、京尼平、戊二醛中的至少一种。
5.根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述水凝胶的制备方法，包括：
6.一次溶解步骤，包括按配方量取磷脂与药物，将所述磷脂、药物溶解于第一溶剂中，得 到溶解液；
7.溶剂去除步骤，包括去除所述溶解液中的第一溶剂，得到膜材料；
8.二次溶解步骤，包括将所述膜材料溶于第二溶剂中，得到载药脂质体；
9.天然高分子化合物加入步骤，包括按配方量将天然高分子化合物加入所述载药脂质体中， 得到含脂质体的天然高分子溶液；
10.交联步骤，包括将交联剂加入所述含脂质体的天然高分子溶液中，得到所述水凝胶。
11.根据第三方面，在一实施例中，提供第一方面所述水凝胶在制备组织修复和/或疾病治疗 药剂中的应用。
12.依据上述实施例的一种水凝胶及其制备方法与应用，本发明选用磷脂分子作为软骨损伤 治疗药物的载体，制备方法简单，药物负载效率高，可实现药物的长期释放。
13.在一实施例中，本发明选用的磷脂分子可降低材料的摩擦系数，减轻关节磨损。
14.在一实施例中，本发明制备的载药水凝胶可原位注射成型，使用简单方便。
15.在一实施例中，本发明制备的载药水凝胶具有良好的生物相容性和可控的生物降解性。
附图说明
16.图1是实施例1中载药脂质体的透射电镜照片。
17.图2是实施例1～3中载药脂质体的粒径分布图。
18.图3是实施例2中载药脂质体对双氯芬酸钠的缓释曲线。
19.图4是实施例3中载药脂质体对kgn的缓释曲线。
20.图5是实施例3中包载载药脂质体的可注射水凝胶的冷冻电镜照片。
21.图6是进行大鼠半月板切除手术并注射pbs、实施例2制得的水凝胶、实施例3制得的 水凝胶后12周的ct结果图。
具体实施方式
22.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似 元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申 请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情 况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关 的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述 所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明 书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
23.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施 方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式 进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例， 并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
24.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具 有任何顺序或技术含义。
25.本文中，“mmol/l”简写为“mm”。
26.根据第一方面，在一实施例中，提供一种水凝胶，包括：天然高分子化合物、磷脂、交 联剂，所述交联剂包括但不限于谷氨酰胺转氨酶、京尼平、戊二醛中的至少一种。本发明选 用的交联剂主要对蛋白类天然高分子化合物起到交联作用。
27.在一实施例中，本发明选用的磷脂分子可降低材料的摩擦系数，减轻关节磨损。
28.在一实施例中，天然高分子化合物为天然材料来源，生物活性良好，部分天然高分子如 明胶和胶原的成分与半月板和关节软骨的成分类似，从成分上起到仿生的效果；交联后起到 支撑关节的作用。
29.在一实施例中，交联剂的作用包括：(1)可原位交联水凝胶，使水凝胶与缺损半月
板复 杂形状贴合，更好地保护关节软骨；(2)使用的交联剂由微生物发酵获取，生物安全性较高。
30.在一实施例中，所述水凝胶中含有1～20wt％天然高分子化合物、5～50mmol/l磷脂、 5～40u/g交联剂。水凝胶中天然高分子化合物的浓度包括但不限于1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、 5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、 17wt％、18wt％、19wt％、20wt％。水凝胶中磷脂的浓度包括但不限于5mmol/l、10mmol/l、 15mmol/l、20mmol/l、25mmol/l、30mmol/l、35mmol/l、40mmol/l、45mmol/l、50mmol/l。 水凝胶中交联剂的浓度包括但不限于5u/g、10u/g、15u/g、20u/g、25u/g、30u/g、35u/g、 40u/g。
31.在一实施例中，所述水凝胶中含有5～20wt％天然高分子化合物、5～50mmol/l磷脂、 5～40u/g交联剂。
32.在一实施例中，天然高分子化合物包括但不限于蛋白质。
33.在一实施例中，所述蛋白质包括但不限于明胶、胶原、丝素蛋白中的至少一种。
34.在一实施例中，所述磷脂包括但不限于氢化大豆磷脂(cas号：92128-87-5；亦称氢化 卵磷脂)、蛋黄卵磷脂(cas：93685-90-6)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(cas：18194-24-6)中 的至少一种。
35.在一实施例中，所述水凝胶负载有药物。
36.在一实施例中，所述药物在所述水凝胶中的浓度可以为1～10mg/ml。药物在所述水凝胶 中的浓度包括但不限于1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、 8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml。
37.在一实施例中，所述药物包括但不限于软骨损伤治疗药物。
38.在一实施例中，所述软骨损伤治疗药物包括但不限于kartogenin(kgn)、非甾体类抗炎 药物中的至少一种。
39.在一实施例中，所述非甾体类抗炎药物包括但不限于双氯芬酸钠、吲哚美辛、洛索洛芬、 萘普生中的至少一种。
40.在一实施例中，所述水凝胶为可注射型水凝胶。
41.在一实施例中，所述水凝胶还含有水。
42.根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述水凝胶的制备方法，包括：
43.一次溶解步骤，包括按配方量取磷脂与药物，将所述磷脂、药物溶解于第一溶剂中，得 到溶解液；
44.溶剂去除步骤，包括去除所述溶解液中的第一溶剂，得到膜材料；
45.二次溶解步骤，包括将所述膜材料溶于第二溶剂中，得到载药脂质体；
46.天然高分子化合物加入步骤，包括按配方量将天然高分子化合物加入所述载药脂质体中， 得到含脂质体的天然高分子溶液；
47.交联步骤，包括将交联剂加入所述含脂质体的天然高分子溶液中，得到所述水凝胶。
48.在一实施例中，一次溶解步骤中，所述第一溶剂包括但不限于二氯甲烷、乙醇中的至少 一种。
49.在一实施例中，一次溶解步骤中，所述第一溶剂过量。
50.在一实施例中，具体可以加入第一溶剂溶解至磷脂浓度为1mg/ml。
51.在一实施例中，溶剂去除步骤中，去除所述溶解液中的溶剂的方法包括但不限于旋转蒸 发、真空干燥中的至少一种。
52.在一实施例中，溶剂去除步骤中，所述旋转蒸发的温度为30～40℃。旋转蒸发的温度包 括但不限于30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。
53.在一实施例中，二次溶解步骤中，所述第二溶剂包括但不限于水、pbs缓冲液、生理盐 水中的至少一种。
54.在一实施例中，二次溶解步骤中，所述第二溶剂的温度为55～65℃。第二溶剂的温度包 括但不限于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。
55.在一实施例中，二次溶解步骤中，加入第二溶剂后，磷脂在所得溶液中的浓度为5～50 mmol/l。
56.在一实施例中，二次溶解步骤中，所得的载药脂质体的载药量为1～10mg/ml。
57.在一实施例中，天然高分子化合物加入步骤中，按配方量将天然高分子化合物加入所述 载药脂质体时，所述载药脂质体的温度为40～60℃。载药脂质体的温度包括但不限于40℃、 45℃、50℃、55℃、60℃。
58.在一实施例中，天然高分子化合物加入步骤中，得到的含脂质体的天然高分子溶液中， 天然高分子化合物在所述溶液中的质量百分比为1～20wt％。
59.在一实施例中，交联步骤中，将交联剂加入所述含脂质体的天然高分子溶液时，所述含 脂质体的天然高分子溶液的温度为37～40℃。含脂质体的天然高分子溶液的温度包括但不限 于37℃、38℃、39℃、40℃。
60.在一实施例中，交联步骤中，得到的所述水凝胶中含有5～40u/g交联剂。
61.根据第三方面，在一实施例中，提供第一方面所述水凝胶在制备组织修复和/或疾病治疗 药剂中的应用。
62.在一实施例中，所述组织包括但不限于骨组织、软骨组织。
63.在一实施例中，所述疾病包括但不限于软骨损伤。
64.在一实施例中，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有摩擦响应释放软 骨损伤治疗药物和润滑特性的可注射型水凝胶及其制备方法，该可注射水凝胶可解决现有支 架材料摩擦系数大和软骨损伤治疗药物难以长期稳定缓释的技术问题。
65.在一实施例中，本发明提供一种具有摩擦响应释放软骨损伤治疗药物和润滑特性的可注 射型水凝胶，其主要原料包括蛋白质类天然高分子、磷脂、软骨损伤治疗药物和交联剂。
66.在一实施例中，所述负载软骨损伤治疗药物的载药脂质体制备方法如下：磷脂和软骨损 伤治疗药物加入过量溶剂中，超声振荡溶解。将所得溶液旋转蒸发除去溶剂，得到磷脂和药 物均匀混合的膜材料。在膜材料中加入超纯水，在特定温度的水浴条件下超声振荡制得负载 软骨损伤治疗药物的载药脂质体。
67.在一实施例中，所述可注射水凝胶的制备方法如下：将明胶或胶原溶解制备预溶液，与 含载药脂质体的溶液混合。在混合溶液中加入交联剂，超声振荡溶解制备得到可注射水凝胶。
68.在一实施例中，本发明选用磷脂分子作为软骨损伤治疗药物的载体，制备方法简
声振荡20min，制得脂质体浓度为50mm、kgn载药量为10mg/ml的载药脂质体。
91.(4)将明胶在60℃条件下溶于步骤(3)制得的溶液中，得到明胶终浓度为20wt％的 含脂质体明胶溶液。
92.(5)将谷氨酰胺转氨酶在37℃条件下超声振荡溶于步骤(4)制得的含脂质体明胶溶 液中，制备得到谷氨酰胺转氨酶浓度为40u/g的负载kgn的可注射水凝胶。
93.可注射水凝胶性能测试
94.对各实施例中制备的载药脂质体进行形貌、粒径表征及药物释放实验，对各实施例中制 备的包载载药脂质体的水凝胶进行形貌观察和用于大鼠半月板损伤模型修复实验。详细试验 方法如下：
95.脂质体透射电镜表征
96.使用磷钨酸对实施例1中制备的脂质体染色，样品稀释至合适浓度后，用毛细管滴加至 铜网上，使用透射电镜观察脂质体形貌。结果如图1所示，所制备脂质体大小均匀，形状规 则。
97.脂质体粒径表征
98.使用马尔文纳米粒度仪表征实施例1～3中制备的脂质体。图2(a)、图2(b)所示分别 为实施例1、实施例2制得的氢化大豆磷脂脂质体粒径分布图，可见，粒径分布均匀，平均 粒径在260nm左右；图2(c)所示为实施例3制得的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱脂质体粒径分 布图，存在两个主要粒径分布峰，平均粒径在450nm左右。
99.脂质体药物释放实验
100.本实验以亲水性药物双氯芬酸钠和疏水性药物kgn为例，说明各实施例所制备脂质体 对药物缓释的普适性。取1ml实施例2或实施例3中制备的载药脂质体，转移至3500da 透析袋中。透析袋置于10ml pbs中，放入37℃摇床孵育。每隔特定时间取出1ml pbs并 补充1ml新鲜pbs，使用紫外分光光度计测量pbs的吸光度。根据标准曲线计算双氯芬酸 钠或kgn含量并绘制药物的累积释放曲线。实施例2制得的载药脂质体中双氯芬酸钠缓释 结果如图3所示，所制备的脂质体可缓释双氯芬酸钠，48h时释放总含量的50％左右。实施 例3制得的载药脂质体中kgn缓释结果如图4所示，所制备的脂质体可缓释kgn，400h 时释放总含量的65％左右。
101.包载载药脂质体水凝胶形貌观察
102.取实施例3中制备的包载载药脂质体水凝胶，冷冻干燥后使扫描电镜观察水凝胶的微观 形貌。结果如图5所示，水凝胶具有连通的微观孔结构，且脂质体均匀地分布在水凝胶表面。
103.大鼠半月板损伤模型修复实验
104.本实验以12～16周龄的大鼠为动物模板，将大鼠分为实验组和对照组。每组4只大鼠， 术前禁食12小时。实验时，切开关节处皮肤暴露关节腔，切除半月板内侧1/4制造半月板缺 损模型。分别使用实施例2中制备的负载双氯芬酸钠水凝胶(简称hdg)和实施例3中制备 的负载kgn水凝胶(简称hkg)对缺损部位填充治疗，在缺损部位填充相同体积的pbs作 为对照组。大鼠喂养12周后，使用micro-ct对损伤部位观察，结果如图6所示。图6所示 的负载双氯芬酸钠水凝胶组(hdg)和图6所示的负载kgn水凝胶组(hkg)的关节间隙 正常，软骨部位光滑完整；而图6所示的对照组的关节间隙明显变窄，软骨部位较为粗糙。 ct结果说明
该可注射水凝胶可以起到保护软骨的作用。
105.综上，本发明提供了一种具有摩擦响应释放软骨损伤治疗药物和润滑特性的可注射型水 凝胶及其制备方法。该可注射型水凝胶以蛋白质类天然高分子、磷脂和软骨损伤治疗药物为 主要原料，采用旋转蒸发和超声分散等简单方法制备负载软骨损伤治疗药物的载药脂质体， 并进一步将载药脂质体和高分子溶液复合，通过原位交联的方式制备可注射水凝胶。本发明 制备的可注射水凝胶生物相容性良好，释放的脂质体具有润滑作用，可减轻关节磨损。该水 凝胶可以有效延长药物在关节腔内的释放时间，提高药物的生物利用率，对软骨损伤具有修 复作用。
106.以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发 明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、 变形或替换。