一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基及方法
技术领域
1.本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基及方法。
背景技术：2.活的但不可培养(viable but non-culturable，vbnc)状态是细菌应对外部压力(如饥饿、寒冷)的一种常见生存策略。在1982年，vbnc细胞被发现并呈现后，研究人员发现了不同种类的细菌可以以vbnc状态存在在自然界中，vbnc细菌的特征是不能在固体培养基上形成菌落，但仍然具有代谢活动。vbnc状态使细菌能够逃避常规平板计数方法的检测，对医疗卫生和食品安全构成了潜在的风险。
3.asaia属细菌是一种革兰阴性需氧杆菌，属于醋酸杆菌科，最早于2000年从印度尼西亚和泰国的花和发酵的糯米中分离出来，目前asaia属共有8株菌，分别是asaia bogorensis、asaia siamensis、asaia krungthepensis、asaia lannensis、asaia spathodeae、asaia astilbes、asaia platycodi、asaia prunellae。据报道，其中的asaia bogorensis和asaia siamensis细菌容易污染饮料、香精调味剂等食品，即使有防腐剂(如苯甲酸酯，山梨酸酯和二甲基二碳酸酯等)存在，asaiaspp.也能够在其中生长良好。该属细菌也有临床感染的病例报道，如从糖尿病患者的腹膜透析液中分离出来、从肺囊性纤维化的病人中分离出来以及造成癌症儿童患儿的血流感染。另外，asaia lannensis和asaia bogorensis无法在mh(mueller
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hinton broth)肉汤培养基中生长，无法进行敏感性测试，给临床用药带来极大困难，极有可能是asaia lannensis和asaia bogorensis进入vbnc状态导致其无法在普通培养基上生长。目前人们对这些新出现的asaia病原体如何传播给人类知之甚少，但食物可能是最重要的来源。asaia lannensis和asaia bogorensis对食品的污染以及其引发的临床感染不仅造成严重的经济损失，而且对公共健康构成严重威胁。虽然已有研究者对某些细菌vbnc状态的诱导条件进行了研究，但是没有研究这类醋酸菌进入vbnc状态的诱导条件，而且以往研究诱导因素多，培养基复杂，没有统一的诱导模型，因此，建立方法简便，诱导时间短的醋酸菌诱导模型非常重要。
技术实现要素：4.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基。
5.本发明的另一目的在于提供一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法。
6.本发明的培养基及方法能够快速促进醋酸菌进入vbnc状态，为醋酸菌进入vbnc状态的研究、防控及利用提供有效的诱导模型。
7.本发明目的通过以下技术方案实现：
8.一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基，所述培养基每升含有甘露醇8.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、酵母膏5.0～10.0g。
9.上述诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基通过如下方法制备得到：
10.将甘露醇、蛋白胨、酵母膏加入到蒸馏水中搅拌混匀，调节ph值为7.2，高压灭菌得到。
11.进一步地，所述高压灭菌是指在121℃蒸汽下高压灭菌20min。
12.一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，包括如下步骤：
13.将醋酸菌接种于含有甘露醇、蛋白胨和酵母膏的诱导培养基中培养，生长至对数期后，加入山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠，诱导醋酸菌进入vbnc状态。
14.进一步地，所述醋酸菌为asaia lannensis或asaia bogorensis。
15.进一步地，所述诱导培养基每升含有甘露醇8.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、酵母膏5.0～10.0g。
16.进一步地，所述诱导培养基中培养是指在30℃，180rpm震荡培养4～6h。
17.进一步地，所述山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠加入的浓度为0.5～1.5g/l。
18.进一步地，所述诱导醋酸菌进入vbnc状态的条件为：温度-20℃，时间为6～24d。
19.进一步优选地，所述诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法包括如下步骤：
20.(1)诱导培养基的制备：将甘露醇、蛋白胨、酵母膏加入到蒸馏水中搅拌混匀，调节ph值为7.2，高压灭菌得到诱导培养基；
21.(2)诱导醋酸菌进入vbnc状态：将醋酸菌asaia lannensis或asaia bogorensis接种于步骤(1)的诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养4～6h，测od600值为0.05～0.1，稀释至终浓度为1.0
×
104～5.0
×
104cfu/ml，然后加入山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠，置于-20℃温度下静置诱导6～24d，asaia bogorensis和asaia lannensis均可进入vbnc状态。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.(1)本发明首次证明醋酸菌asaia bogorensis和asaia lannensis可通过特定防腐剂结合低温的方法诱导进入vbnc状态。
24.(2)采用本发明方法可快速有效促进醋酸菌进入vbnc状态，诱导方法较现有技术简便，诱导时间较现有技术短。
25.(3)vbnc状态的概念从提出到现在已经有40余年之久，但仍然没有很好的方式研究醋酸菌进入vbnc状态的模型，本发明建立的促进醋酸菌进入vbnc的方法可为研究vbnc状态醋酸菌防控和利用方面提供有效的研究模型，特别是在食品微生物防控方面将有较大的利用价值。
附图说明
26.图1为实施例中分别采用山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠诱导asaia lannensis进入vbnc状态的时间曲线图；
27.图2为实施例中分别采用山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠诱导asaia bogorensis进入vbnc状态的时间曲线图。
具体实施方式
28.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限
于此。
29.实施例1
30.本实施例采用山梨酸钾(1.0g/l)诱导醋酸菌asaia lannensis进入vbnc状态：
31.(1)配制诱导培养基：甘露醇8.0g、蛋白胨8.0g、酵母膏5.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
32.(2)诱导方法：将菌株asaia lannensis接种至上述诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养4h，测od600值为0.05，稀释至浓度为1.0
×
104cfu/ml，分成两等份，其中一份加入1.0g/l的山梨酸钾，另一份不添加作为未添加样品，然后分装每管1.1ml，放入-20℃的冰箱中，在诱导培养基中加入1.5％琼脂配成固体培养基，采用固体培养基每3天检测一次菌落总数，当固体平板上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，同时，未经诱导的醋酸菌为阳性对照，经100℃处理10分钟后的醋酸菌为阴性对照。结果表明，经山梨酸钾结合低温诱导18天后，醋酸菌asaia lannensis进入了vbnc状态。本实施例采用山梨酸钾诱导asaia lannensis进入vbnc状态的时间曲线图如图1所示。
33.实施例2
34.本实施例采用苯甲酸钠(1.0g/l)诱导醋酸菌asaia bogorensis进入vbnc状态：
35.(1)配制诱导培养基：甘露醇8.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏10.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
36.(2)诱导方法：将asaia bogorensis菌株接种至上述诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养6h，测od600值为0.053，稀释至浓度为1.5
×
104cfu/ml，分成两等份，其中一份加入1.0g/l的苯甲酸钠，另一份不添加作为未添加样品，然后分装每管1.1ml，放入-20℃的冰箱中，在诱导培养基中加入1.5％琼脂配成固体培养基，采用固体培养基每3天检测一次菌落总数，当固体平板上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法检测细菌的存活状态，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，同时，未经诱导的醋酸菌为阳性对照，经100℃处理10分钟后的醋酸菌为阴性对照。结果表明，经苯甲酸钠结合低温诱导24天后，醋酸菌asaia bogorensis进入了vbnc状态。本实施例采用苯甲酸钠诱导asaia bogorensis进入vbnc状态的时间曲线图如图2所示。
37.实施例3
38.本实施例采用亚硫酸钠(1.0g/l)诱导醋酸菌asaia lannensis进入vbnc状态：
39.(1)配制诱导培养基：甘露醇10.0g、蛋白胨8.0g、酵母膏5.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
40.(2)诱导方法：将asaia lannensis菌株接种至上述诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养5h，测od600值为0.1，稀释至浓度为5.0
×
104cfu/ml，分成两等份，其中一份加入1.0g/l的亚硫酸钠，另一份不添加作为未添加样品，然后分装每管1.1ml，放入-20℃的冰箱中，在诱导培养基中加入1.5％琼脂配成固体培养基，采用固体培养基每3天检测一次菌落总数，当固体培养基上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法检测细菌的存活状态，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，同时，未经诱导的醋酸菌为阳性对照，经100℃处理10分钟后的醋酸
菌为阴性对照。结果表明，经亚硫酸钠结合低温诱导12天后，醋酸菌asaia lannensis进入了vbnc状态。本实施例采用亚硫酸钠诱导asaia lannensis进入vbnc状态的时间曲线图如图1所示。
41.实施例4
42.本实施例采用山梨酸钾(1.0g/l)诱导醋酸菌asaia bogorensis进入vbnc状态：
43.(1)配制诱导培养基：甘露醇6.0g、蛋白胨8.0g、酵母膏6.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
44.(2)诱导方法：将asaia bogorensis菌株接种至上述诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养6h，测od600值为0.05，稀释至浓度为1.0
×
104cfu/ml，分成两等份，其中一份加入1.0g/l的山梨酸钾，另一份不添加作为未添加样品，然后分装每管1.1ml，放入-20℃的冰箱中，在诱导培养基中加入1.5％琼脂配成固体培养基，采用固体培养基每3天检测一次菌落总数，当固体平板上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法检测细菌的存活，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，同时，未经诱导的醋酸菌为阳性对照，经100℃处理10分钟后的醋酸菌为阴性对照。结果表明，经山梨酸钾结合低温诱导21天后，醋酸菌asaia bogorensis进入了vbnc状态。本实施例采用山梨酸钾诱导asaia bogorensis进入vbnc状态的时间曲线图如图2所示。
45.实施例5
46.本实施例采用苯甲酸钠(1.0g/l)诱导醋酸菌asaia lannensis进入vbnc状态：
47.(1)配制诱导培养基：甘露醇10.0g、蛋白胨50g、酵母膏5.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
48.(2)诱导方法：将asaia lannensis菌株接种至上述诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养4h，测od600值为0.06，稀释至浓度为2.5
×
104cfu/ml，分成两等份，其中一份加入1.0g/l的苯甲酸钠，另一份不添加作为未添加，然后分装每管1.1ml，放入-20℃的冰箱中，在诱导培养基中加入1.5％琼脂配成固体培养基，采用固体培养基每3天检测一次菌落总数，当固体培养基上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法检测细菌的存活状态，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，同时，未经诱导的醋酸菌为阳性对照，经100℃处理10分钟后的醋酸菌为阴性对照。结果表明，经苯甲酸钠结合低温诱导18天后，醋酸菌asaia lannensis进入了vbnc状态。本实施例采用苯甲酸钠诱导asaia lannensis进入vbnc状态的时间曲线图如图1所示。
49.实施例6
50.本实施例采用亚硫酸钠(1.0g/l)诱导醋酸菌asaia bogorensis进入vbnc状态：
51.(1)配制诱导培养基：甘露醇10.0g、蛋白胨8.0g、酵母膏10.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
52.(2)诱导方法：将菌株asaia bogorensis接种至上述诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养6h，测od600值为0.085，稀释至浓度为4.5
×
104cfu/ml，分成两等份，其中一份加入1.0g/l的亚硫酸钠，另一份不添加作为未添加样品，然后分装每管1.1ml，放入-20℃的冰箱中，在诱导培养基中加入1.5％琼脂配成固体培养基，采用固体培养基每3天检测
一次菌落总数，当固体平板上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法检测细菌的存活状态，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，同时，未经诱导的醋酸菌为阳性对照，经100℃处理10分钟后的醋酸菌为阴性对照。结果表明，经亚硫酸钠结合低温诱导12天后，醋酸菌asaia bogorensis进入了vbnc状态。本实施例采用亚硫酸钠诱导asaia bogorensis进入vbnc状态的时间曲线图如图2所示。
53.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基，其特征在于，所述培养基每升含有甘露醇8.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、酵母膏5.0～10.0g。2.根据权利要求1所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基，其特征在于，所述培养基通过如下方法制备得到：将甘露醇、蛋白胨、酵母膏加入到蒸馏水中搅拌混匀，调节ph值为7.2，高压灭菌得到。3.根据权利要求2所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的培养基，其特征在于，所述高压灭菌是指在121℃蒸汽下高压灭菌20min。4.一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：将醋酸菌接种于含有甘露醇、蛋白胨和酵母膏的诱导培养基中培养，生长至对数期后，加入山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠，诱导醋酸菌进入vbnc状态。5.根据权利要求4所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，所述醋酸菌为asaia lannensis或asaia bogorensis。6.根据权利要求5所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，所述诱导培养基每升含有甘露醇8.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、酵母膏5.0～10.0g。7.根据权利要求4所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，所述诱导培养基中培养是指在30℃，180rpm震荡培养4～6h。8.根据权利要求4所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，所述山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠加入的浓度为0.5～1.5g/l。9.根据权利要求8所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，所述诱导醋酸菌进入vbnc状态的条件为：温度-20℃，时间为6～24d。10.根据权利要求4所述的一种诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法，其特征在于，所述诱导醋酸菌进入vbnc状态的方法包括如下步骤：(1)诱导培养基的制备：将甘露醇、蛋白胨、酵母膏加入到蒸馏水中搅拌混匀，调节ph值为7.2，高压灭菌得到诱导培养基；(2)诱导醋酸菌进入vbnc状态：将醋酸菌asaia lannensis或asaia bogorensis接种于步骤(1)的诱导培养基中，置于30℃，180rpm震荡培养4～6h，测od600值为0.05～0.1，稀释至终浓度为1.0
×
104～5.0
×
104cfu/ml，然后加入山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠，置于-20℃温度下静置诱导6～24d，asaia bogorensis和asaia lannensis均可进入vbnc状态。
技术总结本发明属于微生物培养技术领域，公开了一种诱导醋酸菌进入VBNC状态的培养基及方法。所述培养基每升含有甘露醇8.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、酵母膏5.0～10.0g。所述诱导醋酸菌进入VBNC状态的方法包括如下步骤：将醋酸菌接种于含有甘露醇、蛋白胨和酵母膏的诱导培养基中培养，生长至对数期后，加入山梨酸钾、苯甲酸钠或亚硫酸钠，诱导醋酸菌进入VBNC状态。本发明的培养基及方法能够快速促进醋酸菌进入VBNC状态，为醋酸菌进入VBNC状态的研究、防控及利用提供有效的诱导模型。特别是在食品微生物防控方面将有较大的利用价值。物防控方面将有较大的利用价值。物防控方面将有较大的利用价值。
技术研发人员：谢小保 文霞 陈漪汶 苏皑庭 张淑瑶
受保护的技术使用者：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2022/7/5
