1.本发明涉及外泌体提取分离的技术领域，具体为一种刺参体液样品外泌体分离的方法。
背景技术：2.外泌体(exosomes,exos)是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，是细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)的一种。2013年诺贝尔生理学或医学奖颁发给研究“细胞的囊泡运输调控机制”的三位科学家，外泌体逐渐成为国际性的研究热点。外泌体中富含各种mrna、mirna和蛋白等，并可在不同的细胞之间转运，被靶细胞摄取后影响靶细胞的生物学行为，是重要的细胞间转运系统。外泌体特殊的膜结构能够保护其内部的rna免受酶的降解，因此相对于体液rna，外泌体中各类rna更为稳定，含量更高。因此，外泌体是研究机体内各类核酸调控机制的重要研究对象。
3.刺参体液主要包括体腔液及波里氏囊体液，分别存于刺参的体腔及波里氏囊体中。由于刺参缺乏特异性免疫，体液是刺参进行机体防御重要的承担者。刺参体液中包含大量的吞噬细胞、桑葚细胞等体腔细胞，且含有凝集素、穿孔素和类补体样因子等体液免疫因子，二者共同组成刺参的天然免疫防御。在刺参响应高温、低氧、低盐、酸化、病原侵害等胁迫条件时，体腔液中的细胞及免疫因子发生变化且发挥重要功能，可削弱胁迫对机体的损害作用。
4.刺参体液中存在丰富的体腔细胞，可以分泌大量外泌体，是刺参免疫等生理生化及分子调控研究领域重要的研究对象。外泌体的完整性对于其生物活性至关重要。然而目前市场上已有的快速提取外泌体的试剂盒大多针对哺乳类动物，并不适用于刺参等棘皮动物，且普通的离心法未考虑刺参体液渗透压特性及体液中残留的肠道及呼吸树等组织样品碎片的影响，无法保证提取样品的完整性、产量、特异性及稳定性。因此针对刺参体液样品建立一套稳定有效、操作简单且能保障膜完整性的外泌体制备方法具有重要价值。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种刺参体液样品外泌体提取分离的方法，以解决刺参外泌体暂无明确提取方法的问题。
6.本发明涉及一种刺参体液样品外泌体分离方法。针对刺参的体液样品，初步过滤后混合等渗抗凝剂进行预处理，随后利用低温中速离心、高速离心、超速离心结合多次过滤的方法，提取分离刺参中的外泌体，并利用等渗缓冲液进行重悬，用于后续实验。
7.一种刺参体液样品外泌体分离的方法，主要包括以下步骤：
8.(1)体液样品提取：
9.解剖刺参后收集体液样品500μl～50ml，筛绢过滤后置于离心管中；
10.(2)体液样品处理：
11.向离心管中加入等体积量的刺参等渗抗凝剂混合；通过40μm网状过滤器过滤至离
心管中，进行后续提取；
12.(3)低温中速离心：
13.低温中速离心15min后，将上清转移至新的离心管中，去除滤液中的碎片；
14.(4)低温高速离心过滤：
15.将(3)中取得的上清液低温高速离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
16.(5)低温超高速离心：
17.将(4)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，低温超高速离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
18.(6)外泌体样品获取与保存：
19.用50～150μl预冷至4℃的等渗缓冲液重悬沉淀，转移至无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
20.刺参等渗抗凝剂(ph＝7.0～8.5(优选范围7.3～8.0))，于水溶液中各组分浓度分别为0.015～0.03m egta、0.30m～0.60m nacl、0.005～0.05m kcl、0.01～0.2m tri-hcl；
21.刺参等渗缓冲液(ph＝7.0～8.5)，于水溶液中各组分浓度分别为0.0005～0.002m egta、0.20～0.53m nacl、0.005～0.10m tri-hcl。
22.加入刺参等渗抗凝剂和等渗缓冲液的目的在于针对刺参的渗透压在提取过程中保持等渗，保证刺参细胞及外泌体完整性及稳定性。
23.多次过滤及离心的目的在于去除刺参解剖过程中产生的组织碎片、细胞碎片、杂质及大颗粒囊泡。
24.进一步的，步骤(1)中解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器收集体液样品。过滤用的300目筛绢应灭菌，离心管应无菌无酶。
25.步骤(3)中中速离心的速度为3000
×
g,，步骤(4)中高速离心的速度为10000
×
g，步骤(5)中超高速离心的速度为120000
×
g。以上离心过程均需在低温4℃下进行。
26.步骤(2)及步骤(6)中的刺参等渗抗凝剂和等渗缓冲液中不含外泌体。
27.步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)中所使用的离心管需提前进行灭菌处理。
28.本发明提出的刺参外泌体分离方法稳定有效，操作简单，所提取的外泌体完整性较强、含量较多、纯度较高。
附图说明
29.图1是实施例1、实施例2分离的刺参外泌体透射电镜检测结果(a.体腔液(100000
×
)；b.波里氏囊体液(60000
×
))。
30.图2是实施例1、实施例2分离的刺参外泌体标志蛋白检测结果。
31.图3是实施例5(a)、实施例6(b)、实施例7(c)、实施例8(d)、实施例9(e)分离的刺参外泌体电镜检测结果。
具体实施方式
32.以下对本发明的具体实施方式中，对于提取的外泌体所采用的电镜检测、粒径检测和western blot检测方法统一如下：
33.电镜检测：
34.室温条件下，将10μl gluta固定液(solarbio,p1126)与10μl外泌体混合固定后滴加至铜网上，静置吸附5min后，用滤纸小心吸去多余的液体。室温下向铜网上滴加10μl饱和醋酸双氧铀溶液(国药集团,spi-02624)染色处理1min，用滤纸小心吸去多余的染色液。室温下在铜网上滴加25μl ddh2o后静置5min，再次滴加25μl ddh2o静置5min后，将铜网在室温下晾干。利用透射电子显微镜(jeol,jem-1230)观察，电压设置为80kv。
35.粒径检测：
36.利用nanosight纳米粒径分析仪(malvern,ns300)检测，具体步骤如下：
37.(1)打开仪器电源、电脑软件，确认左下方状态框内连接正常；
38.(2)利用注射器吸取1ml外泌体样品后向样品池缓慢注入；
39.(3)将激光模块放回底座上；将omega温度计的探头放入激光模块面板的铜孔内；
40.(4)点击start camera，调整焦距，选择合适的screen gain和camera level；
41.(5)在sop中选择所需要的测量方式，调整各项测量参数；点击create and run，依照屏幕提示完成测试；(表1)
42.(6)取出样品，清洗管路及top-plate。
43.表1是刺参中不同体液样品中外泌体的粒径浓度
[0044][0045]
注：用pbs稀释，稀释倍数指稀释至原体积的倍数。
[0046]
western blot检测：(文献：《exosomal long non-coding rna mstrg.292666.16is associated with osimertinib(azd9291)resistance in non-small cell lung cancer》(deng,2020))
[0047]
(1)将20μl外泌体与5μl loading buffer(beyotime,p0015l)混匀后，置于100℃水浴中5～6min。12000
×
g离心10min后，保留上清，放置冰上待上样。
[0048]
(2)配制sds-page分离胶(表2)。
[0049]
表2不同浓度的分离胶配制方案
[0050]
[0051][0052]
按顺序加入各溶液，混匀并加至两块制胶玻璃板中，用异丙醇(生工生物,a507048-0500)封平。待下层胶凝固后，弃去异丙醇并用ddh2o冲洗，吸干残余液体，准备配制浓缩胶(表3)。按顺序加各溶液，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，不要有气泡，立即将梳子插入，凝固后将梳子拔出。
[0053]
表3浓缩胶配制方案
[0054][0055]
配制电泳液running buffer(tris 25mm(国药集团,30188336)，gly 192mm(国药集团,62011519)，10％sds 10ml(国药集团,30166480)，用ddh2o定容至1000ml)和转膜液transfer buffer(tris 25mm，gly 192mm，甲醇100ml(国药集团,10014108)，用ddh2o定容至1000ml)，置于4℃预冷。
[0056]
(3)将做好的制胶槽置于冰上，倒入电泳液running buffer，每个孔上样10～35μl。利用电泳仪(上海天能科技,eps300)电泳(上层胶60v,30min；下层胶110v,120min)。
[0057]
(4)电泳结束后将胶放在pbs(beyotime,c0221a)润洗2min，再放入transfer buffer中浸泡平衡。
[0058]
(5)将pvdf膜(millipore,ipvh00010)，在甲醇中浸泡2min后在ddh2o中浸泡2min，最后在转膜液transfer buffer中浸泡平衡15min。
[0059]
(6)组合放置垫子、膜和胶，放置顺序为：红、(+)白架子、垫子、滤纸、膜、胶、滤纸、垫子、黑架子(-)、黑。转膜条带从-到+。
[0060]
(7)利用转移电泳槽(上海天能科技,ve186)冰上转移50min，电压条件为100v。转移结束后将膜放入pbs中浸泡5min。
[0061]
(8)在37℃条件下用pbs稀释的5％脱脂牛奶封闭2h。
[0062]
(9)利用1
×
pbst(solarbio,p1031)洗膜三次，每次5min。
[0063]
(10)稀释一抗后(hsp70抗体：1:1000(proteintech,10995-1-ap)；tsg101抗体：1:1000(proteintech,28283-1-ap)；cd9抗体：1:1000(abcam,ab92726)；gapdh抗体：1:10000(proteintech,60004-1-lg)；)置于摇床，4℃孵育过夜。
[0064]
(11)利用1
×
pbst洗膜三次，每次5min。
[0065]
(12)加入二抗(兔二抗1:5000(beyotime,a0208)；鼠二抗1:10000(beyotime,a0216))，置于摇床，37℃孵育2h。
[0066]
(13)利用1
×
pbst洗膜五次，每次5min。
[0067]
(14)ecl化学发光显影(beyotime,p0018s)后拍照记录并分析。
[0068]
实施例1
[0069]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0070]
(1)配制刺参等渗抗凝剂及刺参等渗缓冲液
[0071]
刺参等渗抗凝剂(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.02m egta、0.34m nacl、0.019m kcl、0.068m tri-hcl。刺参等渗缓冲液(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.001m egta、0.34m nacl、0.01m tri-hcl。
[0072]
(2)体腔液样品提取：
[0073]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0074]
(3)体腔液样本处理：
[0075]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入等体积量的刺参等渗抗凝剂混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0076]
(4)低温中速离心：
[0077]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0078]
(5)低温高速离心过滤：
[0079]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0080]
(6)低温超高速离心：
[0081]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0082]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0083]
用100μl预冷至4℃的刺参等渗缓冲液重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0084]
实施例2
[0085]
刺参波里氏囊体液(polian vesicle fluid,pvl)样品外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0086]
(1)配制刺参等渗抗凝剂及刺参等渗缓冲液
[0087]
刺参等渗抗凝剂(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.02m egta、0.34m nacl、0.019m kcl、0.068m tri-hcl。刺参等渗缓冲液(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.001m egta、0.34m nacl、0.01m tri-hcl。
[0088]
(2)波里氏囊体液样品提取：
[0089]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取波里氏囊体液5ml样品后，经300目筛绢过滤，滤液(即波里氏囊体液)置于无菌无酶的离心管中。
[0090]
(3)波里氏囊体液样品处理：
[0091]
向装入过滤后的波里氏囊体液样品的离心管中，加入等体积量的刺参等渗抗凝剂混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0092]
(4)低温中速离心：
[0093]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0094]
(5)低温高速离心过滤：
[0095]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0096]
(6)低温超高速离心：
[0097]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0098]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0099]
用100μl预冷至4℃的刺参等渗缓冲液重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0100]
实施例3
[0101]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0102]
(1)配制等渗抗凝剂a及刺参等渗缓冲液
[0103]
等渗抗凝剂a(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.02m egta、0.36m nacl、0.01m kcl、0.03m tri-hcl。刺参等渗缓冲液(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.001m egta、0.34m nacl、0.01m tri-hcl。
[0104]
(2)体腔液样品提取：
[0105]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0106]
(3)体腔液样本处理：
[0107]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入等体积量的等渗抗凝剂a混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0108]
(4)低温中速离心：
[0109]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0110]
(5)低温高速离心过滤：
[0111]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0112]
(6)低温超高速离心：
[0113]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0114]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0115]
用100μl预冷至4℃的刺参等渗缓冲液重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进
行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0116]
实施例4
[0117]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0118]
(1)配制刺参等渗抗凝剂及等渗缓冲液a
[0119]
刺参等渗抗凝剂(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.02m egta、0.34m nacl、0.019m kcl、0.068m tri-hcl。等渗缓冲液a(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.001m egta、0.32m nacl、0.06m tri-hcl。
[0120]
(2)体腔液样品提取：
[0121]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0122]
(3)体腔液样本处理：
[0123]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入等体积量的刺参等渗抗凝剂混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0124]
(4)低温中速离心：
[0125]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0126]
(5)低温高速离心过滤：
[0127]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0128]
(6)低温超高速离心：
[0129]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0130]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0131]
用100μl预冷至4℃的等渗缓冲液a重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0132]
实施例5
[0133]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0134]
(1)配制抗凝剂b及缓冲液b
[0135]
抗凝剂b(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.2m nacl、0.01m kcl、0.02m tri-hcl。缓冲液b(ph＝7.6)各组分浓度分别为0.32m nacl、0.01m tri-hcl。
[0136]
(2)体腔液样品提取：
[0137]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0138]
(3)体腔液样本处理：
[0139]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入等体积量的抗凝剂b混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0140]
(4)低温中速离心：
[0141]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0142]
(5)低温高速离心过滤：
[0143]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0144]
(6)低温超高速离心：
[0145]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0146]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0147]
用100μl预冷至4℃的缓冲液b重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0148]
实施例6
[0149]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0150]
(1)配制抗凝剂c
[0151]
抗凝剂c为曾报道的海洋生物长牡蛎血窦细胞实验适用抗凝剂(ph＝7.5)，其组分及浓度分别为20.8g/l葡萄糖、8.0g/l柠檬酸、3.36g/l edta、22.5g/l柠檬酸钠。
[0152]
(2)体腔液样品提取：
[0153]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0154]
(3)体腔液样本处理：
[0155]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入等体积量的抗凝剂c混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0156]
(4)低温中速离心：
[0157]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0158]
(5)低温高速离心过滤：
[0159]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0160]
(6)低温超高速离心：
[0161]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0162]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0163]
用100μl预冷至4℃的pbs重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0164]
实施例7
[0165]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0166]
(1)配制抗凝剂d和缓冲液d
[0167]
抗凝剂d为曾报道的hek293t(dmem)/lncap(rpm1640)/ball(rpm1640)三种细胞系培养上清液提取外泌体适用的200mm tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)，缓冲液d为同实验中的68mm hepes缓冲液(ph＝7.4)。
[0168]
(2)体腔液样品提取：
[0169]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0170]
(3)体腔液样本处理：
[0171]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入等体积量的抗凝剂d混合。通过40μm网状过滤器，滤液收集过滤至离心管中，进行后续提取；
[0172]
(4)低温中速离心：
[0173]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0174]
(5)低温高速离心过滤：
[0175]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0176]
(6)低温超高速离心：
[0177]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0178]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0179]
用100μl预冷至4℃的缓冲液d重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0180]
实施例8
[0181]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0182]
(1)配制抗凝剂e
[0183]
抗凝剂e为曾报道的人血液适用的抗凝剂——肝素溶液(a051-1-1,南京建成)，依据厂家说明书确定其用量比例。
[0184]
(2)体腔液样品提取：
[0185]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0186]
(3)体腔液样本处理：
[0187]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，加入1ml抗凝剂e混合。通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0188]
(4)低温中速离心：
[0189]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0190]
(5)低温高速离心过滤：
[0191]
将步骤(4)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0192]
(6)低温超高速离心：
[0193]
将步骤(5)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0194]
(7)外泌体样品获取与保存：
[0195]
用100μl预冷至4℃的pbs重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0196]
实施例9
[0197]
刺参(apostichopus japonicus,aj)体腔液样品(coelomic fluid,cl)外泌体分离提取包括以下操作步骤：
[0198]
(1)体腔液样品提取：
[0199]
解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器吸取20ml体腔液样本后，经300目筛绢过滤，滤液(即体腔液)置于无菌无酶的离心管中。
[0200]
(2)体腔液样本处理：
[0201]
向装入过滤后的体腔液样本的离心管中，通过40μm网状过滤器过滤，滤液收集至离心管中，进行后续提取；
[0202]
(3)低温中速离心：
[0203]
4℃下以3000
×
g的速度离心15min，去除滤液中的碎片，将上清转移至新的离心管中；
[0204]
(4)低温高速离心过滤：
[0205]
将步骤(3)中取得的上清液，4℃下以10000
×
g的速度离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0206]
(5)低温超高速离心：
[0207]
将步骤(4)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，4℃下以120000
×
g的速度离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0208]
(6)外泌体样品获取与保存：
[0209]
用100μl预冷至4℃的pbs重悬沉淀，转移至无菌1.5ml无菌ep管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为-80℃。
[0210]
图1表明视野里背景清晰，杂质较少；刺参外泌体大小均匀、形态规则，主要呈现为圆形及椭圆形膜性囊泡盘状(杯托状)结构，其外周包被脂质膜，中心淡染，边缘清晰，有明显的外泌体形态。
[0211]
图2表明外泌体的表面具有丰富的蛋白标志物，包括cd9、tsg101、hsp70等。表1粒径结果表明，应用本方法从刺参体腔液和波里氏囊体液中所提取的外泌体含量较多、浓度佳。结合上述结果，认定本方法可通用提取刺参体液样品中的外泌体。实施例3、实施例4的电镜结果显示所提取的外泌体呈圆形杯托状结构，外周包被脂质膜，边缘清晰，形态与图1基本一致，背景清晰，表明刺参等渗抗凝剂及等渗缓冲液各组分在一定范围内调整比例保持等渗，不影响提取外泌体的完整性及纯度。
[0212]
图3表明实施例5使用缺少关键组分且其余组分比例发生较大变化的抗凝剂和缓冲液处理刺参体腔液样品、实施例6使用海洋生物长牡蛎适用的抗凝剂和pbs处理刺参体腔液样品、实施例7使用细胞系培养上清适用的试剂处理刺参体腔液样品、实施例8使用人血
液适用的抗凝剂和pbs处理刺参体腔液样品、实施例9不使用等渗缓冲液处理刺参体腔液样品，提取出的外泌体形态较差、不规则、不完整，且杂质过多，背景值偏高，纯度不足，具体体现为外泌体呈现出扭曲的杯状形态、或呈皱缩状、或呈三角状，部分外泌体膜破裂，或呈花瓣状、或呈半圆盘状，内容物释出明显。电镜图背景杂质明显较多，可能是外泌体破碎后的膜及内容物释出，说明提取的外泌体纯度下降，可见分离的外泌体质量受到较大影响，对下游实验造成潜在负面影响。
[0213]
从实施例1、例2可以看出本发明中外泌体提取方法，适用于刺参不同类型体液样品；从实施例1、例2、例3、例4、例5、例6、例7、例8、例9可以看出已有的提取方法不适合刺参外泌体的分离提取，应用本发明中的刺参体液样品外泌体提取方法所提取的外泌体完整性好、纯度高；本发明中的刺参体腔液样品外泌体提取方法，稳定有效且操作简单。粒径结果及电镜结果说明所提取的外泌体含量较多、纯度较高、完整性较强，可以用于一系列生物实验。
技术特征：1.一种刺参体液样品外泌体分离的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)取刺参体液与刺参等渗抗凝剂混合，刺参体液与刺参等渗抗凝剂的体积比为1.5:1～1:1.5(优选1:1～1:1.2)；通过孔径20～60(优选35～45)μm筛网过滤，收集滤液；刺参等渗抗凝剂(ph＝7.0～8.5(优选范围7.3～8.0))，于水溶液中各组分浓度分别为0.015～0.03m egta、0.30m～0.60m nacl、0.005～0.05m kcl、0.01～0.2m tri-hcl；(2)2～6℃下以300～6000
×
g(优选1000～4000
×
g)的速度离心，去除滤液中的碎片，收集上清液；(3)将步骤(2)中取得的上清液，2～6℃下以8000～20000
×
g(优选10000～16500
×
g)的速度离心，得到的上清液使用孔径0.18～0.30(优选0.21～0.24)μm筛网进行过滤处理，去除样品中杂质及大颗粒囊泡，得到上清液；(4)将步骤(3)中取得的上清液，2～6℃下以90000～200000
×
g(优选100000～150000
×
g)的速度离心；弃上清液，得到的沉淀即为刺参外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用预冷至2～6℃的等渗缓冲液重悬沉淀，用于刺参外泌体的保存，等渗缓冲液的使用量为30～300μl(优选50～150μl)，对应原始刺参体液样品体积为500μl～50ml；刺参等渗缓冲液(ph＝7.0～8.5(优选范围7.3～8.0))，于水溶液中各组分浓度分别为0.0005～0.002m egta、0.20～0.53m nacl、0.005～0.10m tri-hcl。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，刺参等渗缓冲液(ph＝7.3～8.0)，于水溶液中各组分最佳浓度分别为0.0008～0.0012m egta、0.32～0.34m nacl、0.01～0.06m tri-hcl。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中刺参等渗抗凝剂(ph＝7.3～8.0)，于水溶液中各组分最佳浓度分别为0.019～0.023m egta、0.32m～0.48m nacl、0.01～0.03m kcl、0.03～0.1mtri-hcl。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体液样品提取过程为：解剖刺参后收集体液样品，通过孔径200～600(优选250～350)目筛绢过滤，得体液样品；刺参体液包括体腔液或波里氏囊体液中的一种或二种。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的离心时间为5～30min(优选10～20min)；步骤(3)中的离心时间为30～60min(优选40～50min)；步骤(4)中的离心时间为60～90min(优选70～80min)。
技术总结本发明涉及一种刺参体液样品外泌体分离方法。针对刺参的体液样品，初步过滤后混合等渗抗凝剂进行预处理，随后利用低温中速离心、高速离心、超速离心结合多次过滤的方法，提取分离刺参中的外泌体，并利用等渗缓冲液进行重悬，用于后续实验。本发明提出的刺参外泌体分离方法稳定有效，操作简单，所提取的外泌体完整性较强、含量较多、纯度较高。纯度较高。纯度较高。
技术研发人员：霍达 孙丽娜 林承刚 杨红生 张立斌 刘石林 崔玮 苏芳
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2022/7/5
