1.本发明属于医药学领域，具体涉及一种包含叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物的新医药用途。更具体地，该医药用途指所述中药组合物在制备抑制肝癌术后复发的药物中的应用。
背景技术：2.原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌(primary hepatic cancer,phc)，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。
3.原发性肝癌中有95％比例属于肝细胞癌，所以日常所讲的原发性肝癌都专指肝细胞癌。因为初期无症状、恶性程度高、病情转变快、生存期短、病死率高，原发性肝癌被称为“癌中之王”。2012年全世界估计有782,500例新发的肝癌病例和745,500例死亡，仅中国就占病例和死亡总数的50％左右，是严重威胁我国人民健康和生命的重大疾病。
4.根治性手术是肝癌的首选治疗手段。随着诊断技术的进步和健康教育的普及，肝癌的早期诊断率不断提高，更多的患者获得手术的机会。但是肝癌术后复发已成为影响原发性肝癌远期疗效的主要因素之一。文献报道，原发性肝癌根治术后5年复发率为60％-75％，其中术后1年复发率高达51.4％-72％(张智坚，吴孟超，预防原发性肝癌术后复发临床研究进展，《国外医学外科学分册》，1999，26(2)：129)。术后6个月是复发的高峰时间，又以术后3-4月为最高峰，平均转移复发时间为(198
±
29)d(卢欣，赵海涛，毛一雷等，肝细胞肝癌患者术后早期复发情况，《中国医学科学院学报》，2008，30(4)：415；吴孟超，原发性肝癌的诊断及治疗进展，《中国医学科学院学报》，2008，30(4)：363)。甚至还有文献报道，在原发性肝癌中大肝癌根治性切除术后5年复发率高达80％,小肝癌亦达60％左右(罗时敏，原发性肝癌术后复发机理及其影响因素[j]，《实用癌症杂志》，2001，16(1)：108-110)。
[0005]
与原发性肝癌相比，肝癌术后复发的恶性程度更大，进程更快；由于术后复发患者对化疗不如原发性肝癌患者敏感，造成治疗难度加大且易造成癌症转移，因此，肝癌术后复发对患者造成的影响比原发性肝癌更大。所以，如何控制肝癌术后复发，是提高生存率、改善预后的关键。由此可见，研发预防和治疗肝癌术后的药物具有重要的意义。
[0006]
目前，虽然介入栓塞化疗、全身化疗、放射治疗、射频消融及生物治疗等多种治疗手段广泛应用于肝癌术后复发，但是疗效和预后均不理想，且费用昂贵，毒副作用较大。因此，肝癌术后复发的预防和治疗是一项远未得到满足的临床需求。
[0007]
中医药有着悠久的历史，在历代医家的治疗实践中，形成了对肝癌的认识和治疗法则。中医认为，肝癌属于本虚标实之证。本虚即气血不足，正气亏损，标实即邪气内蕴，血瘀火毒。在肝癌发生、发展中，气滞、痰饮、瘀血往往夹杂胶固，难分难解，而本虚基础上形成的燥湿相混、寒热胶结是导致肝癌的重要发病因素。结合上述所说，多数学者认为本病病因不外乎与饮食不节、情志失调、感受六淫邪毒、久病体虚等有关。其基本病机有正气亏虚、热
毒内结、气血瘀滞、痰湿凝聚多种因素阻滞于肝，正虚邪伏不断损伤机体，导致痰浊、淤血、邪毒与痰、瘀搏结，形成瘤块。
[0008]
根据上述中医机理，发明人对含有叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物进行研究。更具体地，发明人对紫叶丹胶囊进行研究，其药效成分包括叶下珠、云芝、丹参和紫草。君药叶下珠甘苦、凉，入肝、肺经，具有平肝清热、利水解毒等功效。云芝甘、平，有益气养阴、扶正祛邪、调和阴阳等功效，为臣药。君药解毒以祛邪，臣药补阴以扶正，君臣共奏祛邪扶正之功。丹参苦、微寒。入心、肝经，清营凉血，活血通经。此处用之活血化瘀、消肿止痛，是为佐使药。紫草苦、咸、寒，入心、肝经。凉血、活血，解毒。此处用之，与叶下珠配伍，既发挥清热凉血解毒之效，又增活血化瘀之功，也是佐使药。迄今未见有紫叶丹抑制肝癌术后复发的报道。
[0009]
发明人在研究中发现，君药叶下珠虽然在现有技术中常用于治疗乙型肝炎，但在动物长期毒性试验中均出现了肝脏和肾脏可逆性的毒性反应。而在寻找适合抑制肝癌术后复发的药物时，本领域技术人员都希望寻找安全有效的中药制剂，因而对于肝癌术后复发的患者，其肝功能已经受损，叶下珠这样的毒性反应显然是不利的。
技术实现要素：[0010]
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种含有叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物抑制肝癌术后复发的新的医药用途。更具体地，本发明提供了紫叶丹用于制备抑制肝癌术后复发的药物的应用。动物试验表明，紫叶丹对多个负瘤小鼠肿瘤复发模型有显著的肿瘤抑制，作用好于单用叶下珠；且安全性好，以人日用剂量的100、50、25倍给大鼠灌胃6个月，紫叶丹未见与药有关的毒性反应，亦未见蓄积性毒性反应。本发明为临床上抑制肝癌术后复发提供了一种新的选择。
[0011]
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
[0012]
一种包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物在制备抑制肝癌术后复发的药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的药材组成：叶下珠5-20份，云芝2-8份，丹参1-5份，紫草1-5份。
[0013]
优选的，所述肝癌包括原发性肝癌和继发性肝癌。
[0014]
所述原发性肝癌包括肝细胞癌、肝胚细胞癌、胆管性细胞癌、肝内胆囊腺癌、肝-胆管混合细胞癌、肝肉瘤、肝血管内皮细胞肉瘤、肝上皮样血管内皮细胞瘤和肝纤维板层癌。
[0015]
还优选的，所述包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物由如下重量份的药材组成：叶下珠10份，云芝4份，丹参1份，紫草1份。
[0016]
优选的，所述包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物，还包括药学上可以接受的辅料。
[0017]
所述药学上可以接受的辅料，包括(1)稀释剂，例如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐(如：硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等；(2)粘合剂，例如蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等；(3)崩解剂，例如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等；(4)润滑剂，例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等；(5)矫味剂，如：蔗糖、甜菊素等；(6)
溶剂，例如：水、酒精等。
[0018]
优选的，所述包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物为临床上可以接受的制剂，包括经胃肠道给药制剂和非经胃肠道给药制剂。
[0019]
优选的，所述经胃肠道给药制剂选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、乳剂或混悬剂；所述非经胃肠道给药制剂选自注射剂、喷雾剂、栓剂、灌注剂、贴剂或软膏剂。
[0020]
优选的，所述包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物为紫叶丹，原料药组成为叶下珠10份，云芝4份，丹参1份，紫草1份，通过如下方法制备：
[0021]
叶下珠用水提取，所得提取液上大孔吸附树脂吸附，用30-75％的乙醇洗脱完全，合并洗脱液，浓缩得浸膏i；叶下珠水煎煮后的药渣用乙醇提取，得醇提取液；丹参与紫草共同用乙醇提取，得醇提液，与叶下珠的醇提液合并，回收溶剂，得浸膏ii；云芝与丹参、紫草的药渣合并，水提取，得水提取液，回收溶剂，得浸膏iii；将浸膏i、ii、iii混匀，制粒，烘干，制成胶囊剂或颗粒剂，或制粒后压片制成片剂；如有必要，在制粒、成型过程中加入所述药学上可以接受的辅料。
具体实施方式
[0022]
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0023]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：
[0024]
(1)受试药物
[0025]
紫叶丹胶囊(以下简称“紫叶丹”)，由北京汉典制药有限公司提供，批号：13040102；通过如下工艺制备：
[0026]
处方：叶下珠2000g，云芝800g，丹参200g，紫草200g
[0027]
叶下珠用水提取，第一次加12倍量水，煎煮1.5小时，第二次加10倍量水，煎煮1小时。合并煎液，离心，上清液用h103大孔吸附树脂吸附，分别用30％和60％的乙醇洗脱完全，合并洗脱液，浓缩得浸膏i；叶下珠水煎煮后的药渣用12倍量95％乙醇提取，得叶下珠醇提取液；丹参与紫草共同用95％乙醇提取两次，第一次加醇10倍量，回流1.5小时，第二次加醇6倍量，回流1小时，得丹参-紫草醇提液，与叶下珠醇提液合并，回收溶剂，得浸膏ii；云芝与丹参、紫草的药渣合并，加水煎煮两次，每次12倍量水，第一次1.5小时，第二次1小时，得水提取液，回收溶剂，得浸膏iii；将浸膏i、ii、iii混匀，加入药学上可以接受的辅料至500g，制粒，烘干，装胶囊，0.5g/胶囊。
[0028]
叶下珠提取物(以下简称“叶下珠”)，由北京汉典制药有限公司提供；通过如下方法制备：
[0029]
使用传统水煎煮工艺提取，将叶下珠生药用煎煮法提取2次,合并两次煎液,过滤，滤液浓缩为1∶1(叶下珠生药重量：滤液体积)。
[0030]
注射用氟尿嘧啶(5-fu)，每瓶装0.25g/10ml，天津金耀氨基酸有限公司。
[0031]
(2)主要试剂
[0032]
rpmi-1640培养基，hyclone公司，gibco公司；
[0033]
胎牛血清，gibco公司
[0034]
0.25％胰酶(含0.04％edta)，hyclone公司；
[0035]
4％多聚甲醛，biotopped公司
[0036]
(3)主要仪器
[0037]
血球细胞计数板，上海化科实验器材有限公司；
[0038]
奥特bds200倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；
[0039]
超净工作台(yt-cj-2nd)，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；
[0040]
二氧化碳培养箱(sanyo)，北京东迅天地医疗仪器有限公司；
[0041]
低速离心机(sc-3616)，安徽中科中佳科学仪器有限公司；
[0042]
电子天平(al204)，mettler toledo；
[0043]
电子天平(lq-a10001)，瑞安市安特称重设备有限公司；
[0044]
酶标仪(multlskan mk3)，美国hyclone公司。
[0045]
实施例1叶下珠、云芝、紫草、丹参及其组合对肝癌细胞增殖的影响
[0046]
1.1实验仪器材料：
[0047]
(1)肝癌细胞株人肝癌细胞smmc-7721，购自中科院上海细胞库。
[0048]
(2)实验药物
[0049]
对叶下珠、云芝、紫草、丹参分别进行如下处理，得到药物1-8：
[0050]
药物1(叶下珠水提液过大孔树脂)：取叶下珠生药1100g，记录登记后，加水煎煮提取两次，第一次加12倍量水，煎煮1.5小时，第二次加10倍量水，煎煮1小时。每次煎煮后纱布过滤，收集滤液，则为叶下珠水提液，叶下珠药渣备用。该水提液上h103大孔吸附树脂柱，用纯水冲柱至洗脱液无色；依次用30％乙醇和60％乙醇洗脱完全，收集并合并洗脱液；测定出膏量为，浓缩至500ml，喷雾干燥，得喷干粉末10.5g，即为所述药物1；得率：10.5/1100*100＝0.95％。
[0051]
药物2(叶下珠醇提)：上步水提后的叶下珠药渣用95％乙醇加热回流提取二次，每次95％乙醇的用量为12倍量，第一次1.5小时，第二次1小时，合并醇提液，浓缩至相对密度为1.18-1.20(50℃)，离心，收集上清液，放于4℃冰箱中静置过夜，过滤，喷雾干燥，得到干粉12.9g，即为所述药物2；得率：12.9/1100*100＝1.17％。
[0052]
药物3(叶下珠水提)：取叶下珠生药500g，记录登记后，加水煎煮提取两次，第一次加12倍量水，煎煮1.5小时，第二次加10倍量水，煎煮1小时。每次煎煮后纱布过滤，收集滤液，则为叶下珠水提液，浓缩至300ml，喷雾干燥。得到干粉15.6g，即为所述药物3；得率：15.6/500*100＝3.12％。
[0053]
药物4(云芝水提)：取云芝生药500g，记录登记后，用水煎煮两次，第一次煎煮1.5小时，第二次煎煮1小时，每次用12倍量水；纱布过滤，收集并合并滤液；浓缩至620ml，喷雾干燥，得到喷干粉37.15g，即为所述药物4，得率：37.15/500*100＝7.43％。
[0054]
药物5(紫草和丹参醇提)：取紫草、丹参生药各500g(丹参粉碎机粉碎)，同放入提取容器内乙醇提取二次，第一次加入10倍药材量的95％乙醇10l，回流提取1.5h，第二次加入6倍药材量的95％乙醇6l，回流提取1h，趁热过滤，合并滤液，药渣备用；浓缩后离心计量浓缩液总体积为500ml；喷雾干燥，得到喷干粉57.80g，即为所述药物5；得率：57.80g/1000g*100＝5.78％。
[0055]
药物6(紫草和丹参水提)：取上步紫草和丹参醇提后的药渣，用水煎煮两次，第一
次煎煮1.5h，第二次煎煮1h，每次用12倍量水，趁热过滤，合并滤液；浓缩后离心计量浓缩液总体积为690ml，喷雾干燥，得到喷干粉166.72g，即为所述药物6，得率：166.72g/1000g*100＝16.67％。
[0056]
药物7(混合提取物)：按照紫叶丹的原料组成处方(叶下珠2100g，云芝800g，丹参200g，紫草200g)及其药物1-6的得率，按照表1所示的量分别取按照上述药物1-6所述方法制备的提取物，混合，即为药物7，共259.28g。
[0057]
表1药物7的配方组成
[0058][0059]
药物8(紫叶丹制剂)：取叶下珠生药2100g、云芝生药800g、丹参生药200g、紫草生药200g；叶下珠用水提取两次，第一次加12倍量水，煎煮1.5小时，第二次加10倍量水，煎煮1小时。所得提取液上h103大孔吸附树脂吸附，分别用30％和60％的乙醇洗脱完全，合并洗脱液，浓缩得浸膏i；叶下珠水煎煮后的药渣用12倍量95％乙醇提取，得叶下珠醇提取液；丹参与紫草共同用95％乙醇提取两次，第一次加醇10倍量，回流1.5小时，第二次加醇6倍量，回流1小时，得丹参-紫草醇提液，与叶下珠醇提液合并，回收溶剂，得浸膏ii；云芝与丹参、紫草的药渣合并，加水煎煮两次，每次12倍量水，第一次1.5小时，第二次1小时，得水提取液，回收溶剂，得浸膏iii；将浸膏i、ii、iii混匀，烘干，加入药学上可以接受的辅料至500g，即为药物8。
[0060]
1.2工作液配制
[0061]
按各药材在处方中的比例以及各部位提取率换算得到药物1-8的取样量，如表2所示，分别按照如下方法配制成工作液i和工作液ii：
[0062]
按照表2所示称取药物，加rpim-1640培养液(含10％fbs、100u
·
ml-1
青雾素、100μg
·
ml-1
硫酸链霉素)至10ml，4000rpm离心20min，无菌过滤，即为母液。临用时，母液用rpim-1640培养液稀释200倍，即为工作液i，母液用rpim-1640培养液稀释100倍，即为工作液ii。共计16个工作液。
[0063]
表2药物1-8的工作液配制
[0064] 药物1药物2药物3药物4药物5药物6药物7药物8称取0.0040g0.0049g0.0131g0.0119g0.0046g0.0133g0.0519g0.1000g工作液i(μg/ml)202566602367260500工作液ii(μg/ml)4050132120461345201000
[0065]
1.3实验方法：
[0066]
细胞培养
[0067]
smmc-7721细胞接种于25cm2培养瓶，加入约8mlrpim-1640培养液(10％fbs、100u
·
ml-1
青雾素、100μg
·
ml-1
硫酸链霉素)，于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中静置培养，每48h换液。约3～4d细胞长成致密单层，铺满培养瓶底，进行传代：弃去原培养液，用pbs液冲洗两遍，每瓶加入1ml的胰酶消化，倒置相差显微镜下观察细胞，约1～2min细胞收缩成圆形，弃去消化液，加培养液，吹打培养瓶底，使细胞脱落，制成细胞悬液。
[0068]
药物干预及检测
[0069]
1.5
×
104ml-1
的细胞悬液，以每孔200μl接种于96孔培养板，调零孔不加细胞，周围pbs填充。24h后换用上述16个工作液，每个工作5复孔，继续培养24h、48h或72h。每孔加入5mg
·
ml-1
的mtt溶液20μl，培养箱内孵育4h后，弃去孵育液，每孔加入150μl dmso，室温(22℃)振荡混匀15min。待沉淀完全溶解后，酶标仪上570nm测定光密度(a)。按照如下公式计算抑制率：
[0070]
抑制率(％)＝(a
空白孔-a
测量孔
)/(a
空白孔-a
调零孔
)*100％
[0071]
1.4实验结果
[0072]
各工作液处理24h、48h和72h时人肝癌细胞smmc-7721的抑制率，见表3。
[0073]
表3的数据示出：
[0074]
1)低浓度的药物1-6，对人肝癌细胞smmc-7721的增殖基本没有抑制作用，甚至有促进作用；尤其是药物4(云芝水提)，在整个观察培养时间内均表现出对肝癌细胞生长的促进作用。
[0075]
2)高浓度的药物1-3(均为叶下珠的不同提取物)和5长时间干预下(72h)，对肝癌细胞仅表现出非常微弱的抑制作用。
[0076]
3)高浓度的药物4(云芝水提)，在整个观察培养时间内均表现出对肝癌细胞生长的促进作用。
[0077]
4)低浓度的药物7和8，虽然在干预24h时显示对肝癌细胞增殖的促进作用，但是随着作用时间的延长，48h和72h均不同程度的抑制肝癌细胞增殖。高浓度的药物7和8对肝癌细胞增殖的抑制作用具有时间依赖效应，干预72h时，两者均表现出较强的抑制癌细胞生长的作用。其中药物8的作用强于药物7。
[0078]
表3药物1-8对人肝癌细胞smmc-7721增殖的影响(x
±
sd)(n＝5)
[0079]
[0080]
1.5实验结论
[0081]
单味叶下珠、云芝、紫草和丹参对人肝癌smmc-7721的增殖基本没有抑制作用，或者仅有很弱的作用，有的反而表现出促进癌细胞生长。令人意想不到的是，四味中药合用后能够抑制肝癌细胞的生长。说明本发明的中药组合物抗肝癌的作用不是各单味药材作用简单的加和，而是药味之间配伍后产生的新作用。
[0082]
而且通过特定工艺制备的药物8，作用强于四味中药分别提取得到的提取物简单混合而成的药物7，推测在药物8制备过程中，经过多步药学提取工艺，复方中各药材配伍合理，且所含有的多种化学成分之间相互作用，进而为其抗肿瘤作用提供了必要的物质基础。
[0083]
药物8的制备方法与紫叶丹的制剂工艺基本相同，因此下面的实验中都采用紫叶丹进行相应的研究。
[0084]
实施例2紫叶丹对h22荷瘤小鼠肿瘤复发的抑制作用
[0085]
2.1实验仪器材料：
[0086]
(1)实验动物
[0087]
icr小鼠，雄性，重约18-22g，120只，购买于华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：scxk(京)2014-0004。所有动物购入后，观察动物的一般生理指标、体重和进食情况。适应性喂养3天。标准颗粒饲料饲养，自由饮水。自然昼夜光线照明，室温18～26℃，相对湿度40％～70％。
[0088]
(2)肿瘤细胞株
[0089]
h22肝癌腹水瘤细胞，购自中科院上海细胞库。
[0090]
(3)实验药物
[0091]
紫叶丹胶囊
[0092]
成人剂量:成人60kg，成人口服一日3次，一次5粒，每粒装0.5g，即0.125g/kg，按等效剂量换算小鼠用药(提取物)剂量(g/kg)：
[0093]
0.125g/kg
×
9.01＝1.126g/kg
[0094]
叶下珠提取物
[0095]
注射用5-fu
[0096]
2.2实验方法：
[0097]
小鼠肝癌h22细胞体外培养，在5％co2，37℃恒温箱内，用10％灭活胎牛血清的rpmi-1640培养基进行常规培养，每2-3d例行传代，当细胞增殖呈指数生长期时收取细胞并计数进行肿瘤细胞接种。
[0098]
细胞动物体内传代：观察动物的一般生理指标、体重和进食情况，动物适应性喂养1周，观察动物一切正常后，取3-5只，左下腹腔注射0.2ml密度为1
×
107h22肿瘤细胞；正常饲养，观察动物状态，几天后产生腹水，取7-10天，动物状态良好的腹水饱满的小鼠取腹水，离心1000转、3分钟，生理盐水洗1次，计数肿瘤细胞稀释混匀。
[0099]
动物造模：观察动物的一般生理指标、体重和进食情况，动物适应性喂养1周，观察动物一切正常后，右颈肩部皮下注射0.1ml密度为2
×
107h22个/ml肿瘤细胞(上方腹水取得稀释)；每组的动物数和细胞数记录在实验设计表中。
[0100]
接种后第二天，称重，根据体重大小随机分组(随机区组设计)，每组10只，分组情况见表4。
[0101]
表4实施例2分组及给药表
[0102][0103]
2.3观察项目及评价指标
[0104]
2.3.1一般状态观察
[0105]
观察动物精神状态，反应性，毛发色泽，饮食及排泄状况。动物呈现恶化和不好状态和动物不能获得充足的食物和水(失能)用co2使其安乐死亡。
[0106]
2.3.2抑瘤作用
[0107]
(1)体重：每天称量体重，观察各组平均体重变化；
[0108]
(2)肿瘤体积：每周两次或隔天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：v＝0.5
×
ab2，a、b分别表示肿瘤的长径和短径。
[0109]
(3)肿瘤体重：给药结束后，剥离瘤组织，称重，比较各组平均瘤重大小变化。以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：
[0110]
肿瘤生长抑制率＝(1-t/c)
×
100％，
[0111]
式中t为给药组平均瘤重，c为对照组平均瘤重。
[0112]
2.4数据处理
[0113]
两组间比较，使用独立样本t检验。三个或以上的团体之间的比较，使用单向anova。如果计算f-统计(治疗方差误差方差的比率)，多重比较程序将被应用，方差分析。治疗之间的潜在协同效应，将双向方差分析。将分析所有数据采用spss17.0，p《0.05被认为有统计学意义。
[0114]
2.5实验结果：
[0115]
(1)体重：
[0116]
造模前小鼠活动、饮食、毛色均无异常。给药前后各组的体重均无显著性差异(p＞0.05)，结果见表5。
[0117]
表5用药前后体重的变化
[0118][0119]
与模型组组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01
[0120]
(2)对h22移植瘤的抑制作用：
[0121]
紫叶丹具有明显的抑瘤作用，且呈一定的量效关系，优于叶下珠组，并与5-fu组的抗肿瘤效果接近，其结果见表6。
[0122]
表6紫叶丹对h22肝癌肿瘤的抑制作用
[0123][0124]
与模型组组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01
[0125]
2.6结论：
[0126]
(1)紫叶丹对h22肝癌小鼠肿瘤复发模型体重无影响；
[0127]
(2)与模型组比较，紫叶丹高中低三个剂量组对h22肝癌小鼠肿瘤复发模型均具有显著或非常显著的抑瘤作用(p＜0.05，p＜0.01)，且呈量效依赖关系；
[0128]
(3)紫叶丹高剂量组对h22肝癌小鼠肿瘤复发模型的抑瘤作用与5-fu相当。
[0129]
(4)与模型组比较，叶下珠单用对h22肝癌小鼠肿瘤复发模型未表现出显著的抑瘤作用(p＞0.05)。该结果提示紫叶丹对肝癌复发的治疗作用好于叶下珠。
[0130]
实施例3紫叶丹对hepg2荷瘤小鼠肿瘤复发的抑制作用
[0131]
3.1实验仪器材料：
[0132]
(1)实验动物
[0133]
balb/c-nu裸鼠，雄性，5周，40只，购买于华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：scxk(京)2014-0004，实验动物质量合格证号：11401300032435。于北京市口腔医院动物室适应性喂养25天，采用标准颗粒饲料饲养，自由饮水，自然昼夜光线照明，室温18～26℃，相对湿度40％～70％。
[0134]
(2)肿瘤细胞株
[0135]
hepg2人肝癌细胞，广州中医药大学热带医学研究所惠赠
[0136]
(3)实验药物
[0137]
紫叶丹胶囊。
[0138]
成人剂量：成人60kg,成人口服一日3次，一次5粒，每粒装0.5g，即0.125g/kg，按等效剂量换算小鼠用药剂量(g/kg)：
[0139]
0.125g/kg
×
9.01＝1.126g/kg
[0140]
注射用氟尿嘧啶(5-fu)
[0141]
3.2实验方法：
[0142]
人肝癌hepg2细胞(来源于)体外培养，在5％co2，37℃恒温箱内，用10％灭活胎牛血清的1640培养基进行常规培养，每2-3d例行传代，当细胞增殖呈指数生长期时收取细胞并计数进行肿瘤细胞接种。
[0143]
细胞悬液制备：取对数生长期肝癌hepg2细胞，胰酶消化2-3min，用含10％fbs的1640培养液终止消化，1000转/分，离心4min，pbs洗3次，调整细胞密度为2
×
107个/ml。
[0144]
动物造模：观察动物的一般生理指标、体重和进食情况，动物适应性喂养1周，观察动物一切正常后，颈肩部皮下注射0.1ml密度为2
×
107个/ml肝癌hepg2细胞。
[0145]
将hepg2细胞接种于40只balb/c-nu裸鼠颈肩背部皮下，与接种第二天按体重大小随机区组分组，分为紫叶丹高剂量组、紫叶丹中剂量组、紫叶丹低剂量组、5-fu组、模型组，共5组，每组8只，连续给药7周，于末次给药后第二天，麻醉处死并取材。分组情况见下表7。
[0146]
表7实施例3分组及给药表
[0147][0148]
3.3观察项目及评价指标
[0149]
3.3.1一般状态观察
[0150]
观察动物精神状态，反应性，饮食及排泄状况，有无皮疹，肿瘤是否破溃。动物呈现恶化和不好状态和动物不能获得充足的食物和水(失能)用co2使其安乐死亡。
[0151]
3.3.2抑瘤作用
[0152]
(1)体重：每天称量体重，观察各组平均体重变化；
[0153]
(2)肿瘤体积：每周两次或隔天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：v＝0.5
×
ab2，a、b分别表示肿瘤的长径和短径。
[0154]
(3)肿瘤体重：给药结束后，剥离瘤组织，称重，比较各组平均瘤重大小变化。以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：
[0155]
肿瘤生长抑制率＝(1-t/c)
×
100％，
[0156]
式中t为给药组平均瘤重，c为对照组平均瘤重。
[0157]
3.4数据处理
[0158]
两组间比较，使用独立样本t检验，三个或以上的团体之间的比较，使用单向anova检验；若方差不齐，使用非参数秩和检验。所有数据采用spss19.0进行分析，p《0.05被认为有统计学意义。
[0159]
3.5实验结果：
[0160]
(1)体重：
[0161]
造模前balb/c-nu裸鼠的活动、饮食均无异常。给药前后各组的体重均无显著性差异(p＞0.05)。具体结果见表8。
[0162]
表8用药前后体重的变化
[0163][0164]
(2)对hepg2荷瘤小鼠肿瘤复发的抑制作用：
[0165]
紫叶丹可有效抑制人源肝癌细胞在小鼠体内的生长，提示其对肝癌的复发转移有抑制作用。其结果见表9。
[0166]
表9紫叶丹对hepg2荷瘤小鼠肿瘤复发的抑制作用
[0167][0168]
与模型组组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01。
[0169]
3.6结论：
[0170]
(1)紫叶丹对hepg2肝癌小鼠肿瘤复发模型体重无影响；
[0171]
(2)与模型组比较，紫叶丹高中低三个剂量组对hepg2肝癌小鼠复发模型均具有显著或非常显著的抑瘤作用(p＜0.05，p＜0.01)；且呈一定量效关系；
[0172]
(3)紫叶丹低组对hepg2肝癌小鼠复发模型的抑制作用与5-fu相当，紫叶丹高中剂量的作用强于5-fu。提示紫叶丹对肝癌复发的治疗作用好于5-fu。
[0173]
实施例4紫叶丹动物急性毒性(最大耐受量)试验
[0174]
4.1实验材料：
[0175]
(1)实验动物
[0176]
昆明小鼠，雌雄各半，20
±
2g，40只，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证：
陕医动09-003号。
[0177]
(2)实验药物
[0178]
受试药物：紫叶丹胶囊
[0179]
空白对照：蒸馏水
[0180]
4.2实验方法：
[0181]
(1)给药途径选择说明
[0182]
本品为中药胶囊剂，临床用药途径为口服，本试验采取灌胃给药途径，与临床用药途径一致。
[0183]
(2)实验分组及给药剂量
[0184]
将动物按体重随机分成2组，每组20只，雌雄各10只，其中一组为给药组，另一组为对照组。给药组小鼠按体重灌胃给予紫叶丹胶囊药粉水县液，0.3ml/10g，24小时内给药3次，间隔4小时，一日内总剂量相当于临床剂量的225倍。对照组给予同体积的蒸馏水，给药时间同给药组。
[0185]
(3)观察指标和时间
[0186]
给药后连续观察动物的反应情况(如一般表现、呼吸、活动及有无惊厥等)，中毒症状发生的时间、持续时间、恢复情况，逐日记录动物死亡数，隔日一次记录动物体重。死亡动物进行大体解剖，观察各主要脏器情况。观察时间为给药后7天期间。7天观察期结束后，对存活的动物进行大体解剖，观察各主要脏器情况。
[0187]
4.3实验结果：
[0188]
在给药后7天观察期内，紫叶丹给药组小鼠一般状况良好，毛发光泽，神态活动正常，未见异常分泌物及异常呼吸，体重由试验前的20.5
±
1.4g，增至24.5
±
2.7g，未见动物死亡。7天后将全部小鼠颈椎脱颈处死，行肉眼尸检，结果所有小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、胸腺、肾上腺、腹腔、胸腔等主要脏器及体腔等均未见病理改变。最大限度给药期间，对小鼠出现的某症状进行了观察。结果表明，紫叶丹225倍临床剂量一日内分三次给小鼠灌胃给药，动物未见明显的毒性反应，也未引起动物死亡。
[0189]
4.4结论：
[0190]
紫叶丹胶囊药粉小鼠灌胃给药的最大耐受量相当于临床人用量的225倍。
[0191]
实施例5紫叶丹大鼠长期毒性试验
[0192]
5.1实验材料：
[0193]
(1)实验动物
[0194]
sd大鼠，雌雄各半，10-112g，由西安医科大学实验动物中心提供，合格证：陕医动证字08-005号。
[0195]
(2)实验药物
[0196]
受试药物：紫叶丹胶囊、叶下珠
[0197]
空白对照：蒸馏水
[0198]
(3)动物饲养条件：大鼠适应性饲养2周，饲养于开放房间中，空调控温，室内最高温度27℃，最低温度24℃，相对温度58％-70％，常规通风，自然光源。固体饲料饲养，自由摄食和饮用常水。动物按性别分笼饲养，每笼5只，每天清洁鼠笼1次。
[0199]
5.2实验方法：
[0200]
(1)给药途径选择说明
[0201]
本品为中药胶囊剂，临床用药途径为口服，本试验采取灌胃给药途径，与临床用药途径一致。
[0202]
(2)实验分组及给药剂量
[0203]
将动物按体重随机分成5组，每组40只，雌雄各20只。分别为空白对照组(40ml/kg)、紫叶丹小剂量组(相当于成人日用量的25倍)、紫叶丹中剂量组(相当于成人日用量的50倍)、紫叶丹大剂量组(相当于成人日用量的100倍)、叶下珠组(451g/kg)。给药周期为6个月,其中各组部分动物(雌、雄各约1/3)于给药3个月后处死，其余动物继续给药至6个月或给药6个月后停药14天时处死。各组动物均每日上、下午各给药1次，二次间隔5-6小时，给药体积为40ml/kg体重，上午给药时间为8：00-10：00，下午给药时间为2：30-4：00，每周给药6天，周日停药一次。
[0204]
(3)观察指标和时间
[0205]
a、一般表现
[0206]
逐日观察动物的神态、毛发、行为、活动、饮食、粪便、分泌物等情况。
[0207]
b、血液学指标
[0208]
分别于给药3个月和6个月，停药2周时，各组动物取血，用全自动血球计数仪测定各组动物的白细胞(wbc)、血小板(pt)、中性细胞(ne)和淋巴细胞(ly)。
[0209]
c、血液生化学指标
[0210]
分别于给药3个月和6个月，停药2周时，各组动物取血，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转换酶(alt)、天门冬氨酸氨基转换酶(ast)、白蛋白(alb)、肌肝(cr)。
[0211]
d、组织病理学检查
[0212]
对各期处死的所有动物的脏器进行病理学检查，包括心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、肠系膜淋巴结、食道、胃、空肠、结肠、膀胱、胸骨(骨髓)、脑、垂体、大脑等20个组织，用10％的甲醛固定，石蜡包埋切片，he染色，作病理检查。
[0213]
5.3统计分析
[0214]
各组数据均分雌性和雄性分别计算组平均值
±
标准差，采用t检验比较各组给药组与对照组之间的差异，并且将测定的血细胞计数和血清生化检查数据与该种系大鼠的正常值范围比较，确定各项检查是否出现异常。
[0215]
5.4实验结果：
[0216]
(1)对大鼠一般状况的影响
[0217]
给药期期间，叶下珠组神态萎靡，毛发无光泽，行为活动倦怠，停药2周后上述症状消失。其余各组大鼠未见异常。
[0218]
(2)血液学检查
[0219]
于给药3个月和6个月，停药2周时，各组动物取血，进行血液常规检查。结果表明，叶下珠组给药6个月时，雌性和雄性大鼠的wbc、ne％明显升高，ly％、pt明显降低(p﹤0.05)，停药2周时恢复正常。紫叶丹组给药3个月、6个月以及停药2周，对血液学指标均无明显影响(p﹥0.05)。结果见表10。
[0220]
表10紫叶丹对大鼠血象的影响
[0221][0222]
注：与对照组比较，
*
p﹤0.05
[0223]
(3)血液生化检查
[0224]
于给药3个月和6个月，停药2周时，各组动物取血，分离血清，测定各项生化指标。结果表明，叶下珠组给药6个月时，雌性和雄性大鼠的alt、ast、cr明显升高，雌性alb明显降低(p﹤0.05)，停药2周时恢复正常。紫叶丹各剂量组在各时期的各项生化指标均无显著性差异(p﹥0.05)。结果见表11。
[0225]
表11紫叶丹对大鼠血液生化的影响
[0226][0227][0228]
注：与对照组比较，
*
p﹤0.05
[0229]
(4)组织病理学检查
[0230]
于试验3个月、6个月和停药2周后进行的病理检查结果显示，对照组和紫叶丹各剂
量组，除个别动物中肺、肾等组织有散在性非特异炎症外，其余各给药剂量组的各种组织包括心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、肠系膜淋巴结、食道、胃、空肠、结肠、膀胱、胸骨(骨髓)、脑、垂体、大脑等的细胞结构和形态均未见异常病理变化。给药6个月时，叶下珠组病理检查结果显示，肝脏中央静脉周围肝细胞弥漫性坏死，部分伴有单核细胞浸润及空泡化；肾脏组织可见皮质部肾小管上皮细胞空泡变性，伴不同程度的坏死，脱落。给药3个月和给药6个月时，叶下珠组病理检查结果未见异常。
[0231]
5.5结论：
[0232]
紫叶丹以人日用剂量的100、50、25倍给大鼠灌胃6个月，未见与药有关的毒性反应，亦未见蓄积性毒性反应。而叶下珠在肝脏和肾脏出现了可逆性的毒性反应。
[0233]
上述试验结果提示叶下珠、云芝、丹参和紫草合用，能够降低叶下珠的毒性。肝癌的治疗是一个长期的过程，肝癌术后复发的患者其生理机能由于疾病的影响已比较脆弱，治疗时应选择对肝肾功能影响小、更安全的药物。本发明的叶下珠、云芝、丹参和紫草构成活性原料的中药组合物，相较叶下珠，安全性更好、疗效更确切，因此更适于临床上抑制肝癌术后复发患者。
技术特征：1.一种包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物在制备抑制肝癌术后复发的药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的药材组成：叶下珠10份，云芝4份，丹参1份，紫草1份；通过如下方法制备：叶下珠用水提取，所得提取液上大孔吸附树脂吸附，用30-75％的乙醇洗脱完全，合并洗脱液，浓缩得浸膏i；叶下珠水煎煮后的药渣用乙醇提取，得醇提取液；丹参与紫草共同用乙醇提取，得醇提液，与叶下珠的醇提液合并，回收溶剂，得浸膏ii；云芝与丹参、紫草的药渣合并，水提取，得水提取液，回收溶剂，得浸膏iii；将浸膏i、ii、iii混匀，制粒，烘干，制成胶囊剂或颗粒剂，或制粒后压片制成片剂。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌包括原发性肝癌和继发性肝癌。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述原发性肝癌包括肝细胞癌、肝胚细胞癌、胆管性细胞癌、肝内胆囊腺癌、肝-胆管混合细胞癌、肝肉瘤、肝血管内皮细胞肉瘤、肝上皮样血管内皮细胞瘤和肝纤维板层癌。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在制粒、成型过程中加入必要的辅料。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述包括叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物为紫叶丹。
技术总结本发明涉及一种含有叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物在制备抑制肝癌术后复发的药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的药材组成：叶下珠10份，云芝4份，丹参1份，紫草1份。该中药组合物对多个肝癌复发模型有显著的抑制作用，且治疗效果和安全性均较好。且治疗效果和安全性均较好。
技术研发人员：林德良 郭平 康超 蒿长英 钟云 黄卉
受保护的技术使用者：北京汉典制药有限公司
技术研发日：2017.02.22
技术公布日：2022/7/5
