1.本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎病毒无症状感染者筛查试剂盒中的用途。
背景技术：2.新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，covid-19)，简称“新冠肺炎”，新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。从目前收治的病例情况看，多数患者预后良好，少数患者病情危重。老年人和有慢性基础疾病者预后较差。儿童病例症状相对较轻。
3.新型冠状病毒无症状感染者的特点有以下几个方面，首先无症状感染者也具有传染性，也可以发生人传人的现象。只是其传染性较有症状的确诊患者要小，传播范围要小，此时亦需要早期发现无症状感染者，并予以隔离的处理。此外，无症状感染者较为隐密，因其无明显的临床症状，容易发生误诊或漏诊。此时，对于有流行病学史的人员通常需要常规的进行新型冠状病毒的核酸检测和抗体检测以发现无症状感染者。但由于无明显症状，病毒载量低，通过咽拭子核酸检测易造成漏诊、进而增加病毒传染传播风险。抗体检测虽然准确性高，但其采集的是血液，是有创的，受试者顺应性差。
技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种新的筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的生物标志物，以及该标志物的检测试剂在制备新冠肺炎病毒无症状感染者筛查试剂盒和/或装置中的用途。
5.本发明的技术方案包括：
6.尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎病毒无症状感染者筛查试剂盒和/或装置中的用途，所述生物标志物为次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基
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2(3h)-呋喃酮。
7.进一步地，所述尿液中生物标志物检测试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。
8.更进一步地，所述尿液中生物标志物检测试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
9.本发明还提供了一种筛查新冠肺炎病毒无症状感染者试剂盒，它包括用于检测尿液中生物标志物的试剂；所述生物标志物为次黄嘌呤、尿酸和二氢
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5-戊基-2(3h)-呋喃酮。
10.进一步地，所述检测尿液中生物标志物的试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。
11.进一步地，所述检测尿液中生物标志物的试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分
析试验用试剂。
12.本发明还提供了一种筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的装置，所述装置包括：
13.1)检测装置；所述检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮；
14.2)分析装置；
15.所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
16.所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者群体尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)
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呋喃酮的检测结果，得到新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者的二分类模型；
17.所述分析装置还能将待检者尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)
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呋喃酮的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者群体尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基
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2(3h)-呋喃酮检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者的判断结果。
18.进一步地，所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪。
19.进一步地，所述检测结果为生物标志物的丰度值。
20.进一步地，所述机器学习算法为随机森林算法。
21.本发明最后提供了一种前述装置在制备筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的仪器中的用途。
22.本发明用尿液中3种代谢物作为筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的生物标志物，在筛查应用过程中，约登指数为0.82，可满足临床筛查要求。相对现有技术中的咽拭子核酸检测用试剂和血清学抗原抗体试剂，使用3种生物标志物的检测用试剂及设备，可有效弥补新冠肺炎病毒无症状感染患者由于无明显症状、核酸检测易漏诊等原因而造成的漏诊，传染风险；其次，通过检测尿液中的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮筛查，方便快捷，传染风险较低，对病人无伤害，具备临床推广应用价值。
23.本发明的关键在于对待检测尿液生物指标物集合，不在于检测生物标志物的具体技术手段，因为具体检测生物标志物的技术手段都是本领域常规手段。检测尿液中次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮这3个生物标志物的试剂，在用于制备筛查新冠肺炎病毒无症状感染者试剂盒的用途，无论具体试剂是什么，均在本发明的保护范围内。
24.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
25.以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
26.图1患者尿液代谢组学特征与covid-19严重程度相关[a、pca分析显示，无症状患者(asy,n＝60，绿点)、和hc患者(n＝102，蓝点)的代谢组学特征存在显著差异；b、用于区分asy和hc的尿液代谢标志物组合诊断模型的roc曲线(auc＝0.981)；c、用于评估尿液代谢物分类器的混淆矩阵； d用于区分asy和hc的尿液代谢标志物组合模型(次黄嘌呤、尿酸和二
氢
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5-戊基-2(3h)-呋喃酮)的诊断效能)：注释：假如a是患者被诊断为阳性的例数，即真阳性；b是非患者被诊断为阳性的例数，即假阳性；c是患者被诊断为阴性的例数，即假阴性；d是非患者被诊断为阴性的例数，即真阴性。误诊率(％)＝b/(b+d)
×
100％，漏诊率(％)＝c/(a+c)
×
100％，约登指数＝a/(a+c)+d/(b+d)－1]
具体实施方式
[0027]
实施例1本发明用于筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的装置
[0028]
1)检测装置；所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪；检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基
ꢀ‑
2(3h)-呋喃酮；
[0029]
2)分析装置；
[0030]
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
[0031]
所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者群体尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)
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呋喃酮的检测结果，得到新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者的二分类模型；
[0032]
所述分析装置还能将待检者尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)
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呋喃酮的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者群体尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基
ꢀ‑
2(3h)-呋喃酮检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者的判断结果。
[0033]
以下通过实验例进一步说明本发明的有益效果
[0034]
实施例1尿液中生物标志物次黄嘌呤(hypoxanthine)、尿酸(uric acid) 和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮(dihydro-5-pentyl-2(3h)-furanone)与新冠肺炎病毒无症状感染的关系。
[0035]
一、临床资料
[0036]
本发明共纳入sars-cov-2感染患者248例，其中非重症患者(包括轻、中度患者)161例，无症状患者60例，重症患者(包括重症和危重型患者)27 例。健康组(hc)为102例的健康个体，其中女性40例，男性62例，中位年龄41.0岁。hc组与covid-19组无人口学差异(性别:p＝0.125，卡方检验；年龄：p＝0.952，t检验)。收集重庆市公共卫生医疗中心248例新冠肺炎患者的横断面尿液样本。
[0037]
二、用于代谢组学的尿液样本制备
[0038]
所有covid-19患者和hc的尿样rt-pcr均为阴性。尿液样本56℃灭活灭菌30min，并进行一些修饰前处理。150微升的尿液样本、450微升甲醇-氯仿混合物溶液(甲醇和氯仿的体积比是1：2)和10微升的内参溶液(0.3 毫克/毫升2-cl-phe，甲醇作为溶剂)混匀，放置在-20℃2h，收集150微升上清液，用于uplc-q-tof/ms检测，-80℃保存，待分析。取每个代谢产物样品的等份上清(10微升)汇集在一起作为质量控制样品(qc)。
[0039]
三、高效液相色谱/飞行时间质谱分析(uplc-q-tof/ms)
[0040]
代谢产物样品应用uplc-q-tof/ms分析，采用waters i-class acquityuplc(waters,uk)+vion ims qtof(waters，uk)，beh酰胺柱(100mm
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2.1mm，1.7μm)(waters，uk)进行hilic分离。流动相a为10mm甲酸铵水溶液，流动相b为乙腈与10mm甲酸铵水溶液(乙腈与水的体积比为95： 5)。在以下条件下，梯度洗脱分离代谢产物：0.0min，92％b；0.5min，
92％b；5.0min，80％b；9.0min，70％b，10.0min，50％b；11.0min，20％ b；12.0min，20％b；12.5分钟，92％b；15.0min，92％b；流速0.4ml/min。柱内注射2μl，柱温保持在45℃。加热电喷雾电离(hesi)质谱在正负两种模式下工作。
[0041]
仪器参数如下：加热器温度350℃；护套气流量，50arb；辅助气体流量， 15arb；喷雾电压，3.2kv(正模式)和2.8kv(负模式)；毛细管temp，320℃； s-lens射频电平，50％；ms1扫描范围，67-1000。全扫描分辨率，70000； ms/ms的分辨率，17500。
[0042]
四、代谢组学分析
[0043]
通过代谢组学处理软件progenesis qi(waters corporation)进行基线过滤、峰识别、整合、保留时间校正、峰对齐和归一化，利用原始数据获得保留时间、质量-电荷比和峰强度的数据矩阵。准确识别的分子通过kegg代谢途径数据库进一步注释。生物功能分析采用在线软件metaboanalyst 5.0。利用在线数据库ipa version 13.0提供代谢物的疾病相关信息。
[0044]
将归一化代谢产物数据矩阵导入simca-p+14.0软件包(umea,umea, sweden)进行无监督主成分分析(non-supervised principal components analysis, pca)，观察样本的总体分布和分析过程的稳定性。然后，使用监督(正交)偏最小二乘法(o)pls-da来区分总体代谢谱的差异，并识别组间的代谢产物差异。在预测变量重要度(vip)得分大于1的变量被认为是差异变量。为防止模型过拟合，采用7个交互验证周期和200个响应排序试验对模型的质量进行了研究。
[0045]
通过uplc-q-tof/ms对受试者尿液代谢物检测，并用pca等多元统计方法，比较分析了新冠肺炎病毒无症状感染者(asy)与hc的尿液代谢组学特征，并发现二者之间有显著差异(p＝5.03e-13，图1a)，且确定了asy 和hc之间存在37种不同尿液代谢物。
[0046]
五、尿液代谢标志物组的建立
[0047]
使用一个随机森林分类器(python的scikit-learn包)来识别具有潜在预测价值的代谢物，生成分类模型，并评估预测器面板的性能。获得受试者工作特征(receiver operating characteristic,roc)曲线(medcalc v19)用于显示所构建的模型，然后用曲线下面积(area under the curve,auc)表示roc效应。此外，通过误诊率、漏诊率和约登指数(yi)来评估covid-19患者中存在的潜在生物标志物的筛查效果。所有筛选模型采用五倍交叉验证作为内部验证。为了调整合并症(高血压和糖尿病)的影响，我们进行了额外的统计，排除了高血压或糖尿病患者。当代谢物在无合并症患者和hc之间的比较变得不显著时，将其排除。
[0048]
借助随机森林分类器，构造了仅包含3种尿液代谢物(次黄嘌呤、尿酸、二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮，)的二分类模型。该模型能有效区分asy患者和hc，其诊断效能如下：roc曲线下面积为0.981(95％ci，0.946-0.996，准确度＝0.901，图1b)、误诊率、漏诊率、约登指数分别为5.88％、16.67％和0.77(图1c-d)。因此，这些尿液代谢生物标志物在新冠肺炎病毒无症状感染人群中显示出巨大的诊断筛查潜力。
[0049]
六、模型准确性验证
[0050]
从60例新冠无症状患者和102例正常人尿液中，随机挑选32人的尿液，挑选5次，采用高效液相色谱/飞行时间质谱分析检测尿液中的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮三种代谢物。将尿液中三种代谢物的丰度值输入二分类模型中，模型计算样品中三
种代谢物丰度值与数据库中新冠病毒无症状感染者的相似度分数，并根据相似度分数与0.5的大小关系判断是否为新冠肺炎病毒无症状感染者。即相似度分数结果大于0.5，则为新冠肺炎病毒无症状感染者；小于0.5，则为健康人。
[0051]
5次诊断的内验证准确性(准确性是指该尿液代谢物组合诊断模型的分析测定值与其“真值”之间的一致性。此处用五折交叉计算的平均准确度，即抽样计算5次，每次用python scikit-learn计算出预测准确度，共计算5次后求平均值。)分别为：0.66666667、0.87878788、0.8125、0.6875、0.75；平均准确性为0.759090909090909。从结果可见，基于次黄嘌呤、尿酸和二氢-5
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戊基-2(3h)-呋喃酮三种尿液代谢物的二分类模型，可有效的筛查出新冠肺炎病毒无症状感染者。
[0052]
综上，本发明用尿液中次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮3种代谢物作为筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的生物标志物，在筛查过程中，准确性高，可满足临床筛查要求。相对现有技术中的咽拭子核酸检测用试剂和血清学抗原抗体试剂，使用3种生物标志物的联合检测用试剂及设备，可有效弥补新冠肺炎病毒无症状感染患者由于无明显症状、核酸检测易漏诊等原因而造成的漏诊，传染风险；其次，通过检测尿液标志物可实现高通量筛查新冠肺炎病毒无症状感染患者，方便快捷，传染风险较低，对病人无伤害，具备临床推广应用价值。
技术特征：1.尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎病毒无症状感染者筛查试剂盒和/或装置中的用途，其特征在于：所述生物标志物为次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述尿液中生物标志物检测试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述尿液中生物标志物检测试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。4.一种筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的试剂盒，其特征在于，它包括用于检测尿液中生物标志物的试剂；所述生物标志物为次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测尿液中生物标志物的试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测尿液中生物标志物的试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。7.一种筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的装置，其特征在于：所述装置包括：1)检测装置；所述检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮；2)分析装置；所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮的检测结果，得到新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者的二分类模型；所述分析装置还能将待检者尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者群体尿液的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3h)-呋喃酮检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎病毒无症状感染者和非新冠肺炎病毒感染者的检测结果。8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪。9.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述检测结果为生物标志物的丰度值；所述机器学习算法为随机森林算法。10.权利要求7～9任一项所述的装置在制备筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的仪器中的用途。
技术总结本发明提供了一种筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的试剂盒和装置。本发明用于筛查新冠肺炎病毒无症状感染者的试剂盒及装置，在筛查过程中，准确性好，约登指数为0.82，可满足临床对筛查方法的要求。相对现有技术的咽拭子核酸检测用试剂和血清学抗原抗体试剂，可有效弥补无症状感染患者由于无明显症状、病毒不易脱落而核酸检测易出现假阴性等原因造成的漏诊，导致病毒传播风险增加；其次，通过非侵入性采集尿液标本，检测筛查尿液标本中的次黄嘌呤、尿酸和二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮，方便快捷，传染风险较低，对病人无伤害，具备临床推广应用价值。价值。价值。
技术研发人员：陈耀凯 景一娴 王静 郑鹏 武靖
受保护的技术使用者：重庆市公共卫生医疗救治中心
技术研发日：2022.03.25
技术公布日：2022/7/5
