1.本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法。
背景技术：2.遗传毒性杂质(genotoxicimpurities，gti)是指能够直接或间接损伤细胞dna，造成dna突变并伴有致癌性危害人类健康的物质。近年来，药物中发现亚硝胺类遗传毒性杂质事件层出不穷。药品评价性抽验对市场上生产、销售的利福平、利福喷丁的进行抽验，结果发现不同厂家生产的利福平、利福喷丁均检测出不同浓度的遗传毒性杂质1-甲基-4亚硝基哌嗪(mnp)或1-环戊基-4-亚硝基哌嗪(cpnp)。
3.遗传毒性杂质会对患者产生极大危害，极微量水平即可诱发dna突变。因此对遗传毒性杂质的评价和限度控制分析至关重要。从杂质来源看，将杂质完全清除难以实现，也没有必要。只有通过合适的分析方法，并掌握杂质的成因才能对杂质的产生进行有效的控制，从而降低患者服用药物时对身体造成的危害，并为企业生产工艺的提升提供改进策略。申请人对利福平、利福喷丁中遗传毒性杂质的成因展开系统研究。亚硝胺类化合物产生的原因多样，包括药物合成中发生副反应，生成具有遗传毒性的n-亚硝胺类杂质，如仲胺类化合物与亚硝酸等亚硝化试剂相互作用；药物储存过程中发生氧化还原反应，如雷尼替丁中的结构中一个不稳定的二甲氨基，降解产生ndma等。
4.根据利福平、利福喷丁与其遗传毒性杂质mnp、cpnp结构可知，利福平或利福喷丁中亚硝基中n原子有可能来源于活性成分或辅料总残留的亚硝化试剂亚硝酸根离子。因此很有必要对利福平或利福喷丁原料及制剂中的亚硝酸根离子含量进行检测，以确定亚硝胺杂质中n原子的来源，从而可以进行更好的质控。
5.目前，对于亚硝酸盐的测定通常采取离子色谱法、滴定法、比色法、紫外-可见分光光度法等。其中，离子色谱法具有简便、快速、灵敏、选择性高的特点，因此在药物和食品中亚硝酸检测中使用的较多。而采用传统的离子色谱法对利福喷丁及利福平中亚硝酸盐进行检测，由于利福喷丁和利福平极性较低，在离子色谱的淋洗液洗脱时容易析出并且较难从离子交换柱洗脱下来，从而缩短色谱柱使用寿命，降低灵敏度。
技术实现要素：6.为了解决以上技术问题，本发明提供一种离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法。
7.本发明提供的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法包括以下步骤：将供试品溶液进样，然后通过预处理柱保留主成分并洗脱出亚硝酸根离子，所述亚硝酸根离子保留于富集柱，然后采用淋洗液对所述富集柱进行洗脱，对洗脱出的亚硝酸根离子采用离子色谱法测定；所述预处理柱为ng1柱，所述淋洗液的洗脱方式为淋洗液梯度洗脱，所述淋洗液的浓度为5～42mm，流速为0.8～1.2ml/min。
8.本发明通过上述测定方法能够有效检测利福霉素类药物中的亚硝酸根离子，通过采用ng1柱为预处理柱，使疏水性利福平或利福喷丁更好地保留在ng1柱中，而亚硝酸根离子流出保留在富集柱ag11-hc上，通过上述淋洗液将保留在富集柱上的亚硝酸根离子洗脱下来，能够明显提高测定的线性、准确度、定量限和检测限，更重要的是避免了原料药结合在离子交换柱，提高了色谱柱使用寿命。
9.发明人进一步发现，亚硝酸根在酸性条件下不稳定，因此也不能采用消解的方法去除基质的干扰。本发明采用了阀切换基质消除法，进一步建立了离子色谱测定利福平和利福喷丁中亚硝酸根离子的方法，为了进一步提高利福霉素类药物中的亚硝酸根离子检测效果，本发明对具体测定步骤及条件进行了优化，具体如下：
10.利福霉素类药物中亚硝酸根离子的测定方法包括以下步骤：
11.1)供试品溶液进样，将所述供试品溶液进样装载至定量环；
12.2)样品预处理：进行第一次阀切换，将所述定量环、预处理柱和富集柱依次连接，然后通入流动相a，使供试品溶液中的主成分保留于所述预处理柱，亚硝酸根离子保留于所述富集柱；
13.3)离子色谱测定：进行第二次阀切换，使所述富集柱与分析柱连接，通入所述淋洗液，将所述淋洗液洗脱出的亚硝酸根离子进行离子色谱检测；优选地，还包括向所述预处理柱通入流动相b，洗脱出所述主成分。
14.本发明所提供的测定方法采用阀切换结合特定固定相及流动相，能更好地测定疏水性利福平或利福喷丁中待测物亚硝酸根离子，减少利福平或利福喷丁中基质的干扰，并保护了离子交换柱，显著提高测定的线性、准确度、定量限和检测限。
15.根据本发明提供的所述利福霉素类药物中亚硝酸根离子的测定方法，所述测定方法采用的检测系统包括定量环、预处理柱、富集柱、分析柱、六通阀ⅰ、六通阀ⅱ、抑制器和电导检测器；其中所述预处理柱为ng1柱，所述富集柱为ag11-hc柱，所述定量环与所述六通阀ⅰ连接，所述预处理柱连接于所述六通阀ⅰ和所述六通阀ⅱ之间，所述富集柱与所述六通阀ⅱ连接，所述分析柱与所述六通阀ⅱ连接，所述抑制器和电导检测器与所述分析柱连接；优选的，还包括保护柱，所述分析柱与所述保护柱连接，所述保护柱为ag11-hc柱，所述六通阀ⅱ、所述保护柱、所述分析柱依次连接。
16.作为优选，所述步骤1)还包括通过去离子水对所述预处理柱进行平衡。进一步优选，步骤1)中所述富集柱与保护柱和所述分析柱依次相连，采用淋洗液对所述富集柱、保护柱与所述分析柱进行平衡。
17.本发明提供的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，优选的，所述淋洗液为氢氧化钾溶液；进一步优选的，所述淋洗液由eg淋洗液在线发生器生成。采用由eg淋洗液在线发生器生成的淋洗液能提高检测效率，无需手动配置淋洗液，安全且无污染。
18.进一步优选，所述淋洗液的梯度洗脱条件：
ionpac as11-hc阴离子交换色谱柱。本发明优选采用as11-hc阴离子交换色谱柱或效能相当的阴离子交换色谱柱，但效果最佳为dionex ionpac as11-hc阴离子交换色谱柱。本发明中，采用上述分析柱能够更好的使亚硝酸根离子与其他离子分离，尤其采用上述淋洗液与dionex ionpac as11-hc阴离子交换色谱柱配合使用，在上述梯度洗脱条件下，能够更好的将利福平或利福喷丁中亚硝酸根离子洗脱出来并进行检测。
29.作为优选，在所述分析柱前设置的保护柱为ag11-hc柱；更优选地，所述保护柱为dionex ionpac ag11-hc阴离子交换色谱柱，本发明采用上述保护柱能更有效地对分析柱进行保护，进一步提高耐用性。
30.本发明提供的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，离子色谱检测为抑制电导检测，检测器采用电导检测器。
31.本发明提供的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，优选所述供试品溶液的制备包括：将本品内容物与甲醇混合，再加入去离子水混合。
32.本发明中，所述利福霉素类药物为利福平或利福喷丁。
33.本发明的有益效果至少在于：本发明提供的测定方法能够很好地应用于利福平和利福喷丁胶囊中亚硝酸根(no
2-)的测定。本发明方法具有良好的线性、准确度、定量限和检测限，能够有效地检测利福平胶囊和利福喷丁胶囊中的亚硝酸根离子。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中需要使用的附图作简单介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中阀切换示意图；
36.图2为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中阀切换示意图；
37.图3为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中阀切换示意图；
38.图4为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中空白溶剂图；
39.图5为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中利福平胶囊供试品溶液图；
40.图6为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中利福喷丁供试品溶剂图；
41.图7为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中no
2-定量限溶液图；
42.图8为本发明提供的亚硝酸根的测定方法中no
2-检测限溶液图；
43.图9为本发明提供的测定方法中利福平、利福喷丁胶囊no
2-线性关系图(10～200ng/ml)；
44.图10为本发明中常规测定利福喷丁胶囊中亚硝酸根的检测图。
具体实施方式
45.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为
可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
46.本发明中，用语主成分指利福平或利福喷丁。
47.本发明实施例基于离子色谱法(用语“离子色谱法”为中国药典2020年版四部通则0513中规定)进行亚硝酸根离子的测定。
48.本发明实施例中对照品为亚硝酸根标准溶液，批号21d1433，含量100μg，来源gbtc。
49.本发明实施例中所用的其他试剂与材料为商购，甲醇和乙腈的供应商均为fisher。
50.本发明实施例中仪器及材料如下：
51.表1仪器及材料
[0052][0053]
本发明实施例中验证项目及可接受标准如下
[0054]
表2验证项目及可接受标准
[0055][0056][0057]
实施例1
[0058]
本实施例提供一种利福平和利福喷丁胶囊中亚硝酸根(no
2-)的测定方法，
[0059]
本发明实施例中各溶液的配制为：
[0060]
空白溶液：取溶剂甲醇与去离子水混合配成52％的甲醇溶液，作为空白溶液。
[0061]
灵敏度溶液(检测限溶液)：精密量取对照品溶液适量，用52％的甲醇溶液定量稀
释制成每1ml中约含5ng的溶液，即得。
[0062]
定量限溶液：精密量取对照品溶液适量，用52％的甲醇溶液定量稀释制成每1ml中约含10ng的溶液，即得。
[0063]
利福平胶囊供试品溶液制备：取本品内容物适量，约相当于利福平150mg，置50ml离心管中，精密加入甲醇7.8ml，摇匀，再精密加入去离子水7.2ml，振摇10分钟，取上清液过滤，取续滤液即得。
[0064]
利福喷丁胶囊供试品溶液制备：取本品内容物适量，约相当于利福喷丁150mg，置50ml离心管中，精密加入甲醇7.8ml，摇匀，再精密加入去离子水7.2ml，摇匀，取溶液过滤，取续滤液即得。
[0065]
利福平胶囊及利福喷丁胶囊回收率溶液制备：精密量取亚硝酸根标准溶液适量，用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含1000ng的溶液。在利福平胶囊(同上法配制)，利福喷丁胶囊(同上法配制)中，精密加入回收率试验溶液，使利福平胶囊与利福平注射剂加标终浓度为低(50ng/ml)、中(100ng/ml)、高(150ng/ml)三个浓度。每个浓度平行配制3份，作为回收率试验溶液。
[0066]
对照品溶液制备：精密称取亚硝酸根溶液适量，用52％甲醇定量稀释制成1ml中约5ng、10ng、25ng、50ng、100ng、200ng的对照品溶液。
[0067]
本实施例提供测定方法的色谱条件：
[0068]
采用dionex ionpac
tm as11-hc阴离子交换色谱柱；
[0069]
检测器为电导检测器；
[0070]
检测方式为抑制电导检测；
[0071]
柱温为30℃；
[0072]
淋洗液由eg淋洗液在线发生器生成，按下表3进行梯度洗脱。亚硝酸根(no
2-)的保留时间为15.0分钟。
[0073]
表3淋洗液梯度洗脱条件
[0074][0075]
用阀切换在线基体消除法对供试品溶液进样后在线处理，进样体积为50μl。
[0076]
本实施例采用阀切换在线基体消除法将主成分利福平或利福喷丁与no
2-分离。图1为进样状态，样品装载到定量环中，六通阀切换至图2状态。定量环中的样品随着去离子水进入ng1柱中，由于疏水性利福平或利福喷丁保留在ng1柱中，而no
2-被瞬间洗脱下来保留在ag11-hc中而富集。四分钟过后，六通阀切换至图3状态，被保留在ag11-hc中的no
2-随梯度淋洗液洗脱下来通过分析柱进行电导检测器进行分析。同时梯度泵(泵2)流动相切换为乙腈对ng1中的利福平或利福喷丁进行洗脱，具体梯度条件见表4。
[0077]
本实施例提供的利福平和利福喷丁胶囊中亚硝酸根(no
2-)的测定方法步骤如下：
[0078]
进样：供试品溶液装载到定量环，定量环也可与自动进样器相连，预处理柱(ngl柱，4mm
×
35mm)通过外接的梯度泵用去离子水进行平衡；富集柱(ag11-hc，4mm
×
50mm)与分析柱相连，在分析柱前、富集柱后还设有保护柱(ag11-hc，4mm
×
50mm)。(见图1)
[0079]
样品预处理过程：进样后，梯度泵用去离子水冲洗ngl柱和ag11-hc柱，供试品溶液随去离子水进入ngl柱和富集柱ag11-hc柱中，由于疏水性利福平或利福喷丁被吸附在ngl柱中，而待测物亚硝酸根在ngl柱中不保留，亚硝酸根经ngl柱洗脱后被富集在富集柱ag11-hc柱中(该分析过程约4分钟)。(见图2)
[0080]
测定过程：约4分钟后，六通阀切换至图3状态，富集柱ag11-hc柱与保护柱和分析柱连接，被富集的亚硝酸根经淋洗液梯度洗脱后，进行离子色谱分析；同时梯度泵流动相切换为乙腈，按图3洗脱ngl柱中截留的利福喷丁。
[0081]
表4泵2梯度条件
[0082][0083]
注：泵2a(流动相a)为去离子水，泵2b(流动相b)为乙腈。
[0084]
分别取对照品溶液和利福平胶囊供试品溶液或利福喷丁胶囊供试品溶液50μl注入离子色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，按标准曲线法计算。本实施例对所提供的利福平和利福喷丁胶囊中亚硝酸根的测定方法的专属性、检测限和定量限、重复性、线性与范围、准确度进行试验验证，具体如下：
[0085]
1专属性试验
[0086]
精密量取52％甲醇溶液与利福平胶囊、利福喷丁胶囊供试品溶液各50μl，注入离子色谱仪中，记录色谱图。结果：(1)空白溶剂在亚硝酸根离子的出峰处无干扰(图4)；(2)主成分利福平不干扰杂质测定(图5)；(2)主成分利福喷丁不干扰杂质测定(图6)。亚硝酸根(no
2-)的保留时间为15.0分钟。
[0087]
2检测限和定量限
[0088]
精密量取利福平胶囊、利福喷丁胶囊定量限溶液(10ng/ml)与检测限溶液(5ng/ml)各50μl注入液相色谱质谱联用仪，记录色谱质谱图，结果：(1)定量限溶液中亚硝酸根离子峰的信噪比s/n＝15.0；(2)检测限溶液亚硝酸根离子峰的信噪比s/n＝3.8，满足检测灵敏度要求(图7和8及表5)。
[0089]
表5定量限和检测限结果
[0090][0091]
3重复性
[0092]
精密量取亚硝酸根对照品溶液100ng/ml的样品溶液50μl注入离子色谱仪，记录色谱图，重复进样5次，所得峰面积计算相对标准偏差，利福平胶囊为2.80％，利福平注射剂为1.87％，重复性均良好。
[0093]
4线性与范围
[0094]
精密量取亚硝酸根离子溶液浓度范围为10～200ng/ml的系列对照品溶液50μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，由峰面积(x)对溶液浓度(y)作线性回归。以浓度对峰面积绘制标准曲线，结果如下所示(图9)。结果表明亚硝酸根离子在10～200ng/ml浓度范围内线性关系均良好。
[0095]
5准确度
[0096]
精密加入回收率试验溶液，使加标终浓度为低(50ng/ml)、中(100ng/ml)、高(150ng/ml)。
[0097]
结果显示，利福平胶囊高中低三个浓度平均回收率为98.83％，利福喷丁胶囊高中低三个浓度平均回收率为95.72％。见表6和7。
[0098]
表6利福平胶囊前加标回收率汇总(n＝9)
[0099][0100]
表7利福喷丁胶囊前加标回收率汇总(n＝9)
[0101][0102]
上述验证表明，本发明方法具有良好的线性、准确度、定量限和检测限；本发明方法能够有效地检测利福平胶囊和利福喷丁胶囊中的亚硝酸根离子。
[0103]
采用现有常规亚硝酸根离子的离子色谱测定方法，不能有效地检测利福平胶囊和利福喷丁胶囊中的亚硝酸根离子。如果采用直接进样方式，则会导致高浓度的利福平或利福喷丁吸附在色谱柱上无法洗脱下来对色谱柱造成污染，并且高浓度的利福平或利福喷丁进入离子色谱也会对检测器造成污染。如图10所示，利福喷丁的本底过高，覆盖了亚硝酸根离子的出峰位置。所以对于利福霉素类样品无法直接进样。本发明实施例方法能更好地使利福平或利福喷丁与亚硝酸根离子分离，从而使亚硝酸根离子的检测更加灵敏，保护了色谱柱，提高了检测效率和经济效率。
[0104]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
技术特征：1.一种离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，包括以下步骤：将供试品溶液进样，然后通过预处理柱保留主成分并洗脱出亚硝酸根离子，所述亚硝酸根离子保留于富集柱，然后采用淋洗液对所述富集柱进行洗脱，对洗脱出的亚硝酸根离子采用离子色谱法测定；所述预处理柱为ng1柱，所述淋洗液的洗脱方式为淋洗液梯度洗脱，所述淋洗液的浓度为5～42mm，流速为0.8～1.2ml/min。2.根据权利要求1所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述淋洗液为氢氧化钾溶液；优选的，所述淋洗液由eg淋洗液在线发生器生成。3.根据权利要求2所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述淋洗液的梯度洗脱条件：4.根据权利要求1-3任一项所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，流动相包括流动相a和流动相b，采用所述流动相a将供试品溶液中的主成分保留于所述预处理柱，亚硝酸根离子保留于所述富集柱，采用所述流动相b洗脱保留于所述预处理柱中的主成分；优选地，所述流动相a为去离子水，所述流动相b为乙腈。5.根据权利要求4所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述流动相a和所述流动相b进行洗脱的具体条件：6.根据权利要求5所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述富集柱为ag11-hc柱；优选地，所述富集柱为dionex ionpac ag11-hc阴离子交换色谱柱。7.根据权利要求1-6任一项所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，分析柱为as11-hc阴离子交换色谱柱；优选地，所述分析柱为dionex ionpac as11-hc阴离子交换色谱柱；更优选地，在所述分析柱前设有保护柱，所述保护柱为
ag11-hc柱。8.根据权利要求1-7任一项所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，离子色谱检测为抑制电导检测。9.根据权利要求1-8任一项所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括：将本品内容物与甲醇混合，再加入去离子水混合。10.根据权利要求1-9任一项所述的离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述利福霉素类药物为利福平或利福喷丁。
技术总结本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种离子色谱法测定利福霉素类药物中亚硝酸根的方法。所述方法包括以下步骤：将供试品溶液进样，然后通过预处理柱保留主成分并洗脱出亚硝酸根离子，所述亚硝酸根离子保留于富集柱，然后采用淋洗液对所述富集柱进行洗脱，对洗脱出的亚硝酸根离子采用离子色谱法测定；所述预处理柱为NG1柱，所述淋洗液的洗脱方式为淋洗液梯度洗脱，所述淋洗液的浓度为5～42mM，流速为0.8～1.2mL/min。本发明提供的测定方法能够有效检测利福霉素类药物中的亚硝酸根离子，具有良好的线性、准确度、定量限和检测限。定量限和检测限。
技术研发人员：田冶 姚尚辰 宁保明 尹利辉 陶晓莎 赵瑜 崇小萌 王立新 冯艳春 刘颖
受保护的技术使用者：中国食品药品检定研究院（国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心、中国药品检验总所）
技术研发日：2022.01.24
技术公布日：2022/7/5
