probe，
9.所述mg-f为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna；
10.所述mg-r为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna；
11.所述mg-probe的核苷酸序列是seq id no.4。
12.进一步地，上述的组合物中，所述mg-f、mg-r、mg-probe的物质的量比值为2:2:1。
13.为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述的组合物在如下a1)-a6)中的应用：
14.a1)制备检测或辅助检测鸡毒支原体的产品；
15.a2)制备检测或辅助检测待测样本是否感染鸡毒支原体的产品；
16.a3)制备检测或辅助检测待测病原是否为鸡毒支原体的产品；
17.a4)检测或辅助检测鸡毒支原体；
18.a5)检测或辅助检测待测样本是否感染鸡毒支原体；
19.a6)检测或辅助检测待测病原是否为鸡毒支原体。
20.本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。
21.为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供检测或辅助检测鸡毒支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述中任一组合物中所述的鸡毒支原体特异引物探针。
22.进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。
23.进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子。
24.进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述mg-f、mg-r和mg-probe可分别单独包装；所述阳性标准品质粒单独包装。
25.为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供检测或辅助检测鸡毒支原体的方法，所述方法包括使用上述任一项所述的组合物或上述的试剂或试剂盒对待测样品进行数字pcr，根据数字pcr产物确定或辅助确定待测样品是否为鸡毒支原体或，是否含有鸡毒支原体或，是否感染鸡毒支原体。
26.进一步地，上述的方法中，所述数字pcr采用的pcr体系中所述mg-f的含量为1μmol/μl，所述mg-r的含量为1μmol/μl，所述mg-probe的含量为0.5μmol/μl。
27.进一步地，上述的方法中，所述数字pcr中采用的引物退火条件为55℃1分钟。
28.本发明中，所述mg-probe为特异性识别鸡毒支原体的探针，所述mg-probe的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。
29.荧光基团可选自但不限于fam(5/6-羧基荧光素)、vic(绿色荧光蛋白)、tet(四氯-6-羧基荧光素)、joe(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、hex(六氯-6-甲基荧光素)、cy3、tamra(6-羧基四甲基若丹明)、rox(羧基-x-罗丹明)、texas red、lc red640、cy5(花菁染料)、lc red705、fitc(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重pcr检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同即可。
30.所述淬灭基团可选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。
31.以20μl反应体系为例，具体检测方法如下：
32.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，20μmol/μl mg-f、mg-r引
物各1μl，10μmol/μl探针mg-probe 1μl，dna/rna模板2μl，用ddh2o补足至20μl。反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度55℃1min，40个循环；98℃10min；4℃结束。
33.本发明还提供一种前述的检测体系和反应程序在检测鸡毒支原体中的应用。所述检测体系由mg的引物mg-f、mg-r、mg-probe、2
×
supermix反应液、模板dna和depc水组成。
34.进一步地，所述mg-f、mg-r、mg-probe的物质的量比值为分别为2:2:1。
35.上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
36.本发明实现的有益效果如下：
37.1、本发明提供的用于检测鸡毒支原体的引物及探针组合物具有高度的灵敏性，检测线可为8.4copies
·
μl-1
，同时具有良好的特异性和重复性。
38.2、本发明提供的用于检测鸡毒支原体的微滴式数字pcr检测技术，通过读取每个发光和不发光反应的微滴数，实现对鸡毒支原体绝对定量的检测，适用于生产实践中低拷贝浓度(低模板浓度)的鸡毒支原体的检测。
39.3、本发明提供的技术方案适用于产业化，同时为鸡毒支原体病防控提供了更高水准的检测方法。
附图说明
40.图1为mg ddpcr退火温度优化结果图。
41.图2为mg ddpcr引物浓度优化结果图。
42.图3为mg ddpcr探针浓度优化结果图。
43.图4为mg ddpcr特异性检测结果图。
44.图5为mg ddpcr灵敏性检测结果图。
45.图6为mg qpcr灵敏性检测结果图。
46.图7为mg ddpcr标准曲线图。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
48.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.鸡毒支原体毒株mg s6由本室保存，在文献“黄莉等，鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒的实时荧光定量pcr快速检测.动物医学进展,2018,39(02):1-6.”中公开(文献中的名称为鸡毒支原体s6株(mycoplasma galliscepticum，mg)，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
50.鸡传染性喉气管炎病毒(iltv北京株)有本室保存，在文献在文献“谢志勤等，鸡传
染性喉气管炎病毒lamp检测方法的建立.畜牧与兽医,2012,44(11):52-55.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
51.鸡传染性支气管炎标准毒株(ibv m41)由本室保存，在文献“罗思思等，鸡传染性支气管炎病毒rt-lamp可视化检测方法的建立.中国农学通报,2012,28(20):83-87.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
52.鸡滑液囊支原体(ms)由本室保存，在文献“黄莉等，鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒的实时荧光定量pcr快速检测.动物医学进展,2018,39(02):1-6.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
53.鸡新城疫病毒lasota株(ndv lasota)、禽流感h9n2弱毒株(aiv h9n2 066c)和禽偏肺炎病毒(apv mn-10)由本室保存，在文献“谢志勤等，鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立.中国兽医杂志，2017，53(2):6-9.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
54.禽脑脊髓炎病毒(ae van)由本室保存，在文献“谢志勤等，环介导等温扩增(lamp)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立.中国兽医学报,2013,33(04):516-519+537.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
55.ddpcr supermix for probe(no dutp(catalog#:1863024)；
56.ddpcr droplet generation oil for probes、droplet reader oil购自美国bio-rad公司；
57.easypure virual dna/rna kit(目录号：er201-01)购自北京全式金生物技术有限公司；
58.pcr试剂盒、100bp dna marker等购自宝生物工程(大连)有限公司。
59.实施例1、ddpcr反应的建立及优化
60.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，5-40μmol/μl上、下游引物各1μl，2.5-40μmol/μl探针1μl，阳性标准品质粒模板2μl，用ddh2o补足至20μl。
61.生成微滴：在微滴生成卡dg8的第二、三排孔分别加入上述反应液20μl和微滴生成油70μl，盖上专用胶垫，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排。
62.封膜：吸取生成的微滴至96孔板内，加盖铝膜置px1热封仪上，180℃10s进行封膜。
63.pcr扩增：封膜的96孔板放入pcr扩增仪上进行扩增，反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度50-60℃1min(2℃/s)，40个循环；98℃10min；4℃结束。
64.数据读取及分析：反应结束后将96孔板置qx200微滴读取仪上读取信号并进行数据分析。
65.1.1、ddpcr反应退火温度的优化
66.ddpcr反应中，退火温度设为50、51、52、54、55、56、58、60℃共8个不同梯度，结果如图1所示，图1中，a01表示50℃、b01表示51℃、c01表示52℃、d01表示54℃、e01表示55℃、f01
表示56℃、g01表示58℃、h01表示60℃。图1中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图1中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
67.当退火温度在54-56℃时，阳性微滴显示为蓝色，阴性微滴显示为黑色，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。综合这些因素，最佳的退火温度为55℃。
68.1.2、ddpcr反应引物及探针浓度的优化
69.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，上、下游引物各1μl，探针1μl，dna/rna模板2μl，用ddh2o补足至20μl。
70.反应程序：95℃10min；94℃30s，按照每秒降低2℃的速率降至55℃进行退火，设置退火温度55℃1min，40个循环；98℃10min；4℃结束。
71.1.2.1、ddpcr反应引物浓度的优化
72.上述反应体系中保持探针浓度为10μmol/μl，设置4组引物浓度的梯度实验，分别为第一组：正向引物和反向引物分别10μmol/μl，第二组：正向引物和反向引物分别20μmol/μl，第三组：正向引物和反向引物分别30μmol/μl，第四组：正向引物和反向引物分别40μmol/μl。使用等量浓度为250copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次。
73.结果如图2所示，图2中，e09表示引物浓度为10μmol/μl、f09表示引物浓度为20μmol/μl、g09表示引物浓度为30μmol/μl、h09表示引物浓度为40μmol/μl，图2中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图2中左图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
74.结果表明：第二组的拷贝数平均值最高，为223copies。因此选取最佳引物浓度分别为20μmol/μl。
75.1.2.2、ddpcr反应探针浓度的优化
76.上述反应体系中保持引物浓度分别为20μmol/μl，设置4组探针浓度的梯度实验，分别为第一组：探针浓度为2.5μmol
·
l-1
，第二组：探针浓度为5μmol/μl，第三组：探针浓度为10μmol/μl，第四组：探针浓度为15μmol/μl。使用等量浓度为250copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次。
77.结果如图3所示，图3中，a09表示探针浓度为2.5μmol/μl、b09表示探针浓度为5μmol/μl、c09表示探针浓度为10μmol/μl、d09表示探针浓度为15μmol/μl，图3中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图3中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
78.结果表明：第三组的拷贝数平均值最高，为263copies。因此选取最佳探针浓度为10μmol/μl。
79.以上结果表明：当上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μl和10μmol/μl时，即终浓度分别为1μmol/μl和0.5μmol/μl时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。
80.1.3、优化后的ddpcr反应体系及反应程序
81.优化后的反应体系及反应程序如下：
82.20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，20μmol/μl上、下游引物
各1μl，10μmol/μl探针1μl，dna/rna模板2μl，用ddh2o补足至20μl。
83.反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度55℃1min(按照每秒降低2℃的速率降至55℃进行退火)，40个循环；98℃10min；4℃结束。
84.实施例2、引物设计与合成
85.根据已发表的鸡毒支原体毒株mg mgpc基因(no.jx869132.1)保守序列，利用在线https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/软件设计ddpcr引物和探针，应用blast在线对设计的引物和探针序列进行比对份分析，在探针引物的5’端标志fam荧光基团，3’端标志bhq1淬灭基团。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成合成，引物和探针寡核苷酸序列见表1。
86.表1.引物和探针寡核苷酸序列
[0087][0088]
实施例3、标准质粒的构建
[0089]
3.1、病毒核酸的提取
[0090]
参照easypure virual dna/rna提取试剂盒说明书，提取mg s6以及对照毒株的dna/rna，提取的dna/rna保存于-80℃备用。
[0091]
3.2、标准模板的制备
[0092]
以3.1提取的mg s6毒株的dna为模板，用设计的引物mg-f、mg-r扩增mg mgpc基因，扩增的pcr产物经15g/l琼脂糖凝胶电泳，染色后将目的片段的凝胶切下，用凝胶回收试剂盒回收目的片段获得核苷酸序列是seq id no.1所示的dna分子。
[0093]
将获得的dna分子与pmd18-t载体(购买于takara生物公司，货号：6011)连接，转染到大肠杆菌dh5α中。通过蓝白班筛选出阳性克隆，送生物公司测序，将测序正确的单菌落，扩大培养，抽提质粒，获得的阳性质粒命名为pmd18-t-mg，pmd18-t-mg含有seq id no.1所示的dna片段。
[0094]
pmd18-t-mg为鸡毒支原体阳性标准品质粒。
[0095]
测定阳性标准品质粒pmd18-t-mg的od260/od280值，计算阳性质粒dna的浓度，按公式换算成拷贝数，拷贝数＝(浓度
×
阿伏加德罗常数)/(一个碱基对的平均分子量
×
总长度)。
[0096]
结果表明pmd18-t-mg质粒的浓度为64mg/ml。
[0097]
实施例4、ddpcr特异性测定
[0098]
将aiv h9n2 066c、ibv m 41、ndv lasota、apv/mn-10、aev van的rna反转录为cdna，然后将mg s6、ms、iltv bj的dna及反转录的cdna(aiv h9n2066c、ibv m 41、ndv lasota、apv/mn-10、aev van)分别加入实施例1中已优化好的ddpcr反应体系中进行特异性检测。
[0099]
将aiv h9n2 066c、ibv m 41、ndv lasota、apv/mn-10、aev van的rna反转录为cdna，然后将mg s6、ms、iltv bj的dna及反转录的cdna分别加入已优化好的ddpcr反应体系
中进行特异性检测，结果各孔扩增总微滴的生成量都达1万以上，且较均衡，微滴扩增条件成立，结果如图4所示，图4中a07表示mg s6；b07表示ms；c07表示aiv h9n2 066c；d07表示ibv m 41；e07表示aev van；f07表示ndv lasota；g07表示apv mn-10；h07表示iltv bj。图4中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图4中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
[0100]
图4结果表明出现阳性微滴的样品只有mg s6，其它样品没有出现阳性微滴，说明设计的引物具有特异性。
[0101]
实施例5、ddpcr灵敏性及重复性测定
[0102]
5.1、灵敏性
[0103]
测定mg阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)dna的浓度，然后以10倍梯度稀释，使浓度在10-2-10-9
copies
·
μl-1
，每个稀释度取2μl作为模板加入已优化好的ddpcr反应中，测定ddpcr反应的灵敏性。
[0104]
同时用相同的引物、探针浓度和试剂进行荧光定量pcr检测，比较两种方法的灵敏性。
[0105]
取10-2-10-9
每个稀释度的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)2μl作为模板加入实施例1中已优化好的dd pcr反应体系中，结果如图5所示，图5中a02表示10-2
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)；b02表示10-3
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)；c02表示10-4
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)；d02表示10-5
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)e02表示10-6
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)；f02表示10-7
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)；g02表示10-8
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)；h02表示10-9
copies
·
μl-1
的阳性标准品质粒(pmd18-t-mg)。图5中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图5中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。
[0106]
qrt-pcr检测结果见图6，结果只检测出10-7
稀释度，低拷贝8.1copies/μl(10-8
稀释度)没有检出。
[0107]
结果表明：ddpcr最低检测限为8.1copies/μl(10-8
稀释度)，而qpcr只检测出10-7
稀释度，低拷贝8.1copies/μl(10-8
稀释度)没有检出。
[0108]
分别用核酸稀释度和阳性拷贝数10的对数值绘制标准曲线，发现线性方程为y＝-0.73x+6.84，线性关系r2值为0.9703，结果见图7。图7中横坐标表示样品稀释度的对数值，纵坐标表示获得的阳性拷贝数的对数值。
[0109]
5.2、重复性
[0110]
取10-4-10-6
三个梯度稀释的模板进行3次重复试验，以检测dd pcr的重复性。
[0111]
采用三组不同拷贝数浓度的dna模板来评估ddpcr方法的重复性，测试结果如表2所示，每个稀释度的变异系数(cv)均小于5％，说明该方法的重复性好、准确度高，检测结果稳定、可靠。
[0112]
表2 ddpcr重复试验结果
[0113][0114]
实施例6、临床样品的检测结果
[0115]
对60份鸡病料临床样品的检测，ddpcr检测结果9份为mg阳性，核酸拷贝数在90-1020copies/μl，45份样品为阴性，阳性检出率为15％(9/60)。qpcr检测获得同样结果。
[0116]
进一步进行临床样品检测，保存在-70℃的临床样品按1:5加入pbs溶液进行研磨，2000rpm/min离心5min，取上清200μl，按easypure virual dna/rna提取试剂盒说明书提取核酸模板，然后进行下一步反应。
[0117]
20μl反应体系：2
×
supermix for probe(no dutp)10μl，20μmol/μl引物mg-f、mg-r各1μl，10μmol/μl探针mg-probe 1μl，核酸模板2μl，用ddh2o补足至20μl。
[0118]
生成微滴：在微滴生成卡dg8的第二、三排孔分别加入上述反应液20μl和微滴生成油70μl，盖上专用胶垫，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排。
[0119]
封膜：吸取生成的微滴至96孔板内，加盖铝膜置px1热封仪上，180℃10s进行封膜。
[0120]
pcr扩增：封膜的96孔板放入pcr扩增仪上进行扩增，反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度55℃1min(按照每秒降低2℃的速率降至55℃进行退火，)，40个循环；98℃10min；4℃结束。
[0121]
数据读取及分析：反应结束后将96孔板置qx200微滴读取仪上读取信号并进行数据分析。检测临床样品9份mg阳性结果见表3。
[0122]
表3检测临床样品9份mg阳性结果
[0123][0124]
本试验建立了一种绝对定量检测mg的ddpcr方法，并对方法中的引物和探针浓度、退火温度进行优化，发现引物终浓度为1μmol/μl、探针浓度为0.5μmol/μl的情况下，反应具有最低的负荧光幅度(灰色)，阳性微滴信号(蓝色)高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。退火温度为55℃，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。
[0125]
本试验建立的ddpcr方法，与qpcr检测方法在灵敏性检测方面进行了比较。在定量
检测相同稀释度的mg质粒dna时，ddpcr和qpcr的定量值均呈线性正相关，且ddpcr方法比qpcr方法检测的拷贝数更低1个滴度，更为灵敏。
[0126]
本方法中，阳性模板浓度过高，ddpcr扩增的阳性产物超出10000copies/μl时，系统会读不出拷贝数，在这种情况下，为更准确获取扩增阳性的阳性拷贝数，应对模板浓度进行一定浓度的稀释后才能成功获得检测的拷贝数。而对临床样品的检测，往往由于样品中的目的模板含量低，因而本方法更适合于临床样品的检测。
[0127]
本方法中，由于对操作的要求较高，在操作过程中所吸取的液体不能有气泡，而且扩增后读取的微滴总数(阳性和阴性微滴)应大于10000，这样ddpcr读取仪读出来的阳性微滴数比较准确。
[0128]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
技术特征：1.检测或辅助检测鸡毒支原体的组合物，所述组合物包括鸡毒支原体特异引物探针，所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1的dna片段在内的鸡毒支原体基因组dna片段的pcr引物和与核苷酸序列是seq id no.1的dna片段特异结合的探针组成。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述pcr引物由mg-f和mg-r组成，所述探针为mg-probe，所述mg-f为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna；所述mg-r为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna；所述mg-probe的核苷酸序列是seq id no.4。3.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于：所述mg-f、mg-r、mg-probe的物质的量比值为2:2:1。4.权利要求1-3中任一项所述的组合物在如下a1)-a6)中的应用：a1)制备检测或辅助检测鸡毒支原体的产品；a2)制备检测或辅助检测待测样本是否感染鸡毒支原体的产品；a3)制备检测或辅助检测待测病原是否为鸡毒支原体的产品；a4)检测或辅助检测鸡毒支原体；a5)检测或辅助检测待测样本是否感染鸡毒支原体；a6)检测或辅助检测待测病原是否为鸡毒支原体。5.检测或辅助检测鸡毒支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括权利要求1-3中任一组合物中所述的鸡毒支原体特异引物探针。6.如权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。7.如权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子。8.检测或辅助检测鸡毒支原体的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1-3中任一项所述的组合物或权利要求5-7中任一项所述的试剂或试剂盒对待测样品进行数字pcr，根据数字pcr产物确定或辅助确定待测样品是否为鸡毒支原体或，是否含有鸡毒支原体或，是否感染鸡毒支原体。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述数字pcr采用的pcr体系中所述mg-f的含量为1μmol/μl，所述mg-r的含量为1μmol/μl，所述mg-probe的含量为0.5μmol/μl。10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述数字pcr中采用的引物退火条件为55℃1分钟。
技术总结本发明公开了微滴式数字PCR检测鸡毒支原体的组合物及其应用，属于微生物的测定或检验方法技术领域。该组合物包括鸡毒支原体特异引物探针，所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段在内的鸡毒支原体基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。本发明提提供的ddPCR检测的组合物灵敏性高，特异性强，适用于低拷贝样品的检测。适用于低拷贝样品的检测。
技术研发人员：谢芝勋 谢志勤 张艳芳 范晴 谢丽基 万丽军 罗思思 李孟
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
