1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法。
背景技术：2.微生物无处不在，是世界正常运转、人类生存不可缺少的。微生物包含了细菌、病毒、真菌等，其中，细菌是所有生物中数量最多的一类。细菌与人类健康密切相关。一方面，细菌是许多疾病的病原体，并可通过接触、消化道、呼吸道等在正常人群中传播疾病，另一方面，人类也与细菌和谐共处。人的肠道栖息的细菌占肠道微生物总量的90％，定植有400～500种不同的细菌，其数量约是人体细胞数量的10倍左右。众多研究表明肠道内的菌群对人体的健康、正常的生理代谢有着重要的作用。肠道微生物以一定比例组合，各菌种之间相互制约相互依存，维持肠道的稳定性。细菌主要以无性二分裂方式，即细菌生长到一定时期，在细胞中间逐渐形成横隔，由一个母细胞分裂为两个大小相等的子细胞。肠道内细菌通过不断增殖维持着肠道黏膜屏障的稳定，抑制病原体的侵袭。尽管关于肠道细菌的研究越来越多，然而，关于其作用机制的研究仍暂不明确。研究细菌如何发挥作用的一个有效的方法就是标记和追踪细菌在肠道内的繁殖、定植情况。
3.hoechst荧光染料属于细胞核性染料，在水溶液中荧光很微弱，当它与dna结合时发出强烈的蓝色荧光；这类染料具有高荧光性、毒性低、荧光衰减慢、可穿透细胞膜等特点，用于标记活细胞或体内追踪细胞。常用的hoechst荧光染料有hoechst 33342、hoechst 33258，其中，hoechst 33342较hoechst 33258毒性更低。大肠杆菌是肠道内常见的革兰氏阴性菌，属于兼性厌氧菌，其繁殖速度快且在体外易培养。大肠杆菌以二分裂增殖方式繁殖。
4.我们通过查阅文献，发现在现有技术中，暂未有利用细胞核荧光染料hoechst对细菌进行追踪、定量分析其增殖速度的相关技术。目前，益生菌发挥作用的机制并不清楚，细菌在肠道内的存活、定植的研究极少，尚缺乏可行的方法跟踪、评估细菌的生存能力，因此，我们在理论基础上探索用细胞核荧光染料hoechst 33342对活菌进行染色并追踪，利用荧光染料追踪稀释法分析其增殖。这对未来利用该方法对探究菌株间的相互作用、追踪细菌在体内的定植提供了新的方向。
技术实现要素：5.本发明目的是提供一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法，该方法是通过每个细菌平均荧光强度和细菌分裂次数的标准曲线，实现对体外不同细菌的增殖速度的测定，该方法可应用于追踪其在小鼠肠道内繁殖及定植情况。
6.本发明的目的之一在于：一种利用细胞核荧光染料定量检测、追踪细菌在肠道内繁殖与定植的方法，其特征在于包括如下步骤：
7.a)染色溶液的配制：在细胞核荧光染料中加入ddh2o配置10mg/ml储液，用pbs按照1:1000稀释储液至浓度为10μg/ml的工作液；
8.b)细菌的复苏：将保存菌种1:100接种至10ml lb液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡12h，收集菌液，以5000rpm速度离心5min，弃上清，沉淀用1000μl pbs缓冲液重悬；
9.c)以细胞核荧光染料染细菌：将荧光染料配制成工作浓度为15μg/ml的染液；将染液与培养基中的细菌悬液以10:1混合，然后置于37℃摇床中孵育30min，完成染色；重新离心并用pbs重悬，洗去多余的荧光染料；
10.d)细菌生长曲线的绘制：将菌种1:100接种至200ml lb液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡，在0小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、9小时、12小时、15小时、24小时、36小时吸取菌液至96孔板中，每孔加样100μl，酶标仪测定其吸光度，每组设置5个复孔，取平均值，以未染色的大肠杆菌为对照组，绘制生长曲线；
11.e)体外细菌增殖模型的建立：在培养0小时、5小时、6小时、7小时、8小时后收取细菌，用标准平板计数法对细菌进行计数，用流式细胞仪检测每孔细菌的平均荧光强度；以m为细菌平均荧光强度，n为细菌个数，t为时间，对细菌平均荧光强度及数量进行统计分析，建立m与n的拟合关系公式，绘制出拟合线；
12.f)体内细菌繁殖与定植的定量测定：将步骤c)染色后的细菌回接至肠道内，通过测定粪便中的平均荧光强度m和细菌数量n绘制标准曲线，可以得到细菌在肠道内的增殖与定植。
13.进一步地，所述细菌为肠道内细菌。
14.进一步地，所述细菌为大肠杆菌。
15.进一步地，所述细胞核荧光染料为hoechst 33342。
16.本发明的一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法，通过对每个细菌平均荧光强度和细菌数量的标准曲线，实现对细菌增殖速度的测定，通过对细菌的追踪，可以定量检测其在小鼠肠道内繁殖分裂速度与定植数量。该本发明相对于现有技术的有益效果如下：
17.1.采用本发明的方法，细胞核荧光染料染细菌后，可以直接用流式细胞仪的定量检测定细菌的平均荧光强度及数量，而且由于所选用的细胞核荧光染料较稳定，衰减慢，对细菌几乎无毒，故本发明操作较容易；
18.2.本发明的方法可应用于体外细菌增殖的定量检测；
19.3.本发明利用荧光染料对细菌进行染色，可以观察其单独或多种细菌混合培养条件下的增殖速度，从而可以进一步探究细菌间的相互关系影响；
20.4.采用本发明方法标记益生菌有助于建立其在体内的增殖、定植模型，为探究益生菌在肠道内发挥作用及其机制提供新的方向及方法。
附图说明
21.图1为本发明实施例hoechst 33342染色后的大肠杆菌荧光显微镜图(a：荧光显微镜100
×
；b：荧光显微镜200
×
)；
22.图2为本发明实施例大肠杆菌体外生长曲线图；
23.图3a为本发明实施例大肠杆菌体外增殖模型的大肠杆菌细菌数量-时间的拟合曲线；
24.图3b为本发明实施例大肠杆菌体外增殖模型的细菌平均荧光强度-时间的拟合曲线；
25.图3c为本发明实施例大肠杆菌体外增殖模型的大肠杆菌细菌数量-平均荧光强度间的线性相关图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明设计、阳性样本验证和结果分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
27.实施例
28.1、大肠杆菌的染色、涂片
29.将大肠杆菌1：100接种至10ml lb液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡12h，收集菌液，以5000rpm速度离心5min，弃上清，沉淀用1000μlpbs缓冲液重悬；将荧光染料hoechst33342配制成工作浓度为15μg/ml的染液；将工作浓度的染液100μl与培养基中的细菌悬液10μl混合，轻轻吹打，使之充分混匀，然后置于37℃孵箱，避光孵育30min，完成染色；重新离心并用pbs重悬，洗去多余的荧光染料；将5μl悬液滴至玻片，轻轻摊开，在荧光显微镜下观察染色后的细菌(如图1所示)。
30.2、大肠杆菌在体外增殖速度的测定
31.将染色后的大肠杆菌1:100接种至200ml lb液体培养基中，在37℃恒温摇床200r/min避光条件下进行常规培养，在0小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、9小时、12小时、15小时、24小时、36小时吸取菌液至96孔板中，每孔加样100μl，酶标仪测定其吸光度，每组设置5个复孔，取平均值，以未染色的大肠杆菌为对照组，绘制其生长曲线(图2)；分别在培养0小时、5小时、6小时、7小时、8小时后收集细菌，用流式细胞仪检测细菌数量及细菌的平均荧光强度，以m为平均荧光强度，n为细菌的个数，t为时间；利用各个时间点得到细菌数量及平均荧光强度，用excel绘制出对数拟合曲线，建立了体外监测大肠杆菌的增殖模型，包括染色细菌数量与时间的指数模型、染色细菌的平均荧光强度与时间的对数模型以及细菌平均荧光强度与细菌数量间的线性模型(如图3a-3c所示)：
32.细菌数量-时间：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
y＝1325.6
×20.52x
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
r2＝0.9983
33.平均荧光强度-时间：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
y＝-438.4log2(x)+3550
ꢀꢀꢀꢀꢀ
r2＝0.9896
34.细菌数量-平均荧光强度：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
y＝-50.32x+134536
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
r2＝0.877
35.3、大肠杆菌体内繁殖与定植的定量测定
36.将染色后的大肠杆菌对6周龄c57bl/6spf级雄性小鼠进行灌胃操作，收集并测定小鼠排出的所有粪便，细菌保存液溶解混匀，按比例随机采样，过滤、离心、洗涤得到细菌悬液。利用流式细胞仪检测收集粪便的平均荧光强度，记为m1、m2、m3…mn
，细菌计数为n1、n2、n3…nn
。通过对细菌的计数及平均荧光强度的测定，可建立一个可以粗略计算出每24小时内肠道内细菌数量的模型。在理想状态下，用于灌胃的细菌总荧光强度是恒定的，即m
初
*n
初
，且
细菌的定植也处于动态平衡，那么第一个24小时，m
定植
*n
定植
＝m
初
*n
初-m1*n1，第二个24小时，m
定植
*n
定植
＝m
初
*n
初-m1*n
1-m2*n2，以此类推，第n个24小时，m
定植
*n
定植
＝m
初
*n
初-m1*n
1-m2*n2‑…‑mn
*nn。利用对排出粪便中的细菌数量及平均荧光强度测定，从而得到在肠内的定植数量。
37.以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
技术特征：1.一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法，其特征在于包括如下步骤：a)染色溶液的配制：在细胞核荧光染料中加入ddh2o配置10mg/ml储液，用pbs按照1:1000稀释储液至浓度为10μg/ml的工作液；b)细菌的复苏：将保存菌种1:100接种至10ml lb液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡12h，收集菌液，以5000rpm速度离心5min，弃上清，沉淀用1000μl pbs缓冲液重悬；c)以细胞核荧光染料染细菌：将荧光染料配制成工作浓度为15μg/ml的染液；将染液与培养基中的细菌悬液以10:1混合，然后置于37℃摇床中孵育30min，完成染色；重新离心并用pbs重悬，洗去多余的荧光染料；d)细菌生长曲线的绘制：将菌种1:100接种至200ml lb液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡，在0小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、9小时、12小时、15小时、24小时、36小时吸取菌液至96孔板中，每孔加样100μl，酶标仪测定其吸光度，每组设置5个复孔，取平均值，以未染色的大肠杆菌为对照组，绘制生长曲线；e)体外细菌增殖模型的建立：在培养0小时、5小时、6小时、7小时、8小时后收取细菌，用标准平板计数法对细菌进行计数，用流式细胞仪检测每孔细菌的平均荧光强度；以m为细菌平均荧光强度，n为细菌个数，t为时间，对细菌平均荧光强度及数量进行统计分析，建立m与n的拟合关系公式，绘制出拟合线；f)体内细菌繁殖与定植的定量测定：将步骤c)染色后的细菌回接至肠道内，通过测定粪便中的平均荧光强度m和细菌数量n绘制标准曲线，可以得到细菌在肠道内的增殖与定植。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌为肠道内细菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞核荧光染料为hoechst 33342。
技术总结本发明提供了一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法，包括如下步骤：a)染色溶液的配制；b)细菌的复苏；c)以细胞核荧光染料染细菌；d)细菌生长曲线的绘制；e)体外细菌增殖模型的建立；f)体内细菌增殖与定植的定量测定。本发明的一种利用细胞核荧光染料实现对细菌的定量分析，通过对细菌平均荧光强度和细菌数量的测定，建立了细菌增殖模型，并利用对这一方法，探索益生菌在小鼠肠道内增殖与定植。肠道内增殖与定植。肠道内增殖与定植。
技术研发人员：聂飚 郁冰清 林创珍 杨玉平
受保护的技术使用者：暨南大学附属第一医院（广州华侨医院）
技术研发日：2022.05.11
技术公布日：2022/7/5
