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1.本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种海参通用扩增引物、扩增方法及应用。
背景技术：2.海参隶属于无脊椎动物(invertebrate)、棘皮动物门(echinodermata)、海参纲(holothuroidea)，是海产八珍之一，海参既具有重要的食用和药用价值，也具有重要的生态功能，是著名的“海洋清道夫”。目前全球有记录的海参纲物种有约有1700种，自然分布在温带或亚热带海域海参种类非常少，绝大多数的海参种类分布在印度和太平洋的热带海域。我国南海海域有记录的海参种类约有40种，其中具有食用价值的多达28种。
3.近年来，随着我国居民消费水平的提高，海参消费逐年增加，海参的消费多样化需求也在增加，特别是热带海参的消费需求增加明显，由于加工后海参难以识别导致的乱贴标牌现象时有发生。另一方面，热带海参资源可持续开发利用以及生态增养殖成为当前以及未来海洋生物领域重要的研究方向。海参的鉴定是海参研究中重要的一环，但依靠形态很难进行区分，特别是形态相近种，因此分子鉴定是解决这些问题的最有效方法，分子鉴定具有快速、精准的优点。
4.专利cn101659993a公开了一种基于线粒体coⅰ基因片段pcr扩增，对扩增片段进行限制酶切，根据条带的带形大小及数量对四种海参进行鉴定，但此方法并不能广泛用于种类繁多的海参区分。专利cn108018360b公开了一种dna微条形码的食用海参物种鉴定方法，其dna微条形码基于对线粒体coⅰ基因片段的扩增，coⅰ基因进化速度化，随着海参测序序列的增加，几乎难以发现coⅰ基因保守的区域用于引物设计。此前我们在专利cn103923972b中公开了基于coⅰ基因片段的扩增以及后续酶切显示dna带形的刺参科海参的鉴定方法，该方法仅限于刺参科的海参，不具有通用性。专利cn103484553a公开了一种基于线粒体16s基因扩增的快速鉴定10种海参种特异性pcr方法，但该方法仅对于4个属10种海参成功进行了扩增，并未对遗传跨度巨大、来源更为广泛的海参进行扩增，因此其通用性性未知，此外其扩增片段只有270bp左右，基于16s基因的高度保守性，短片段序列无法提供足够的分辨率对更为广泛来源的海参进行区分。因此，综合上述，由于研究积累薄弱以及早期海参线粒体基因组序列不完善等原因，至今没有类似于细菌或藻类的基于保守看家基因的通用分子鉴定方法用于海参的分子鉴定。
技术实现要素：5.为了解决上述问题，本发明提供了一种用于海参的分子鉴定、种系发生研究以及海域的海参种群的分子监测的海参通用扩增引物、扩增方法及应用。
6.本发明的第一个目的是提供一种海参通用扩增引物，引物序列如下：
7.16s-nuf:gtcatcatgaccgttctgcaaccgtgcdaaggtagcataat；
8.16s-nur:cagggtacggatgtgcgagcgtcggtctgaactcagatcatg。
9.其中划线部分为5’端测序接头部分，用于提高pcr产物直接测序时，两端有效测序的长度，增加有效测序基因片段的长度。
10.本发明的第二个目的是提供一种鉴别海参的试剂盒，其包括上述海参通用扩增引物。
11.本发明的第三个目的是提供一种鉴别海参的方法，其是提取待测样品的dna，然后以上述海参通用扩增引物进行扩增，如果扩增片段的大小约为511bp，则是海参，否则则不是。
12.优选，所述的pcr扩增，其pcr反应体系为：dna模板0.5-1.5μl，5-15μm上游引物和5-15μm下游引物各0.5-1.5μl，premix extaq酶25μl，用灭菌水补足至50μl。
13.进一步优选，所述的pcr扩增，其pcr反应体系为：dna模板1.0μl，10μm上游引物和10μm下游引物各1.0μl，premix extaq酶25μl，用灭菌水补足至50μl。
14.优选，所述的pcr扩增，其pcr反应程序为：94℃预变性2-5min；94℃变性15-60sec，54-58℃退火20-40sec，72℃延伸30-90sec，30-35个循环；72℃延伸4-6min。
15.进一步优选，pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸60sec，32个循环；72℃延伸5min。
16.优选地，扩增片段(产物)可以通过琼脂糖电泳进行检测，具体方法是：取pcr扩增产物3-6μl，与0.5-2μl上样缓冲液混合；以移液器取混合物，点于0.8-1.5％的琼脂糖胶(含核酸染料)中，然后进行电泳，电压80-120v，电泳时间25-50min。电泳后，取出琼脂糖胶，置于紫外凝胶成像系统中，拍照成像，判断扩增dna片段的大小，正确的扩增产物大小约为511bp。
17.进一步优选，取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合；以移液器取混合物，点于1％的琼脂糖胶(含核酸染料)中，然后进行电泳，电压100v，电泳时间30min。电泳后，取出琼脂糖胶，置于紫外凝胶成像系统中，拍照成像，判断扩增dna片段的大小。
18.本发明的第四个目的是提供上述海参通用扩增引物在鉴别海参中的应用。
19.第一种应用可以为未知海参的分子鉴定以及获得16s rrna基因片段序列后与其它海参的种系发生分析。将上述正确片段大小的扩增产物，直接递交测序公司，进行pcr产物常规测序。
20.测序引物如下：
21.scu-1s:gtcatcatgaccgttctgc；
22.scu-2rs:cagggtacggatgtgcgag。
23.获得测序结果后，采用常规生物信息学方法进行处理、比对以及种系发生分析。
24.第二种应用是用于海域中海参种类以及丰度的分子监测。取海域沉积物样品，采用海洋动物基因组提取试剂盒(天根生化)或其它沉积物(土壤)dna提取方法进行提取，然后采用上述鉴别海参的方法进行扩增以及电泳检测方法进行检测，正确扩增片段大小的pcr产物直接递交测序公司，进行pcr产的高通量测序，采用常规生物信息学方法分析序列的组成以及出现频率，以此反映样品中代表的海参种类组成和丰度。
25.海参具有非常丰富的种类，近年来特别是热带海参的研究、开发成为热点。本发明提供了一种海参通用扩增引物、扩增方法及应用，可以用于海参的分子鉴定、种系发生研究以及海域的海参种群的分子监测。
附图说明：
26.图1为正向引物序列来源位点；
27.图2为反向引物序列来源位点；
28.图3用于16s-nuf/16s-nur引物效果验证的10种海参的pcr扩增结果，其中：m，dna maker；阴：长棘海星；1，方柱翼手参；2，花刺参；3，黄玉参；4，蛇目白尼参；5，黑海参；6，绿刺参；7，棘辐肛参；8，黑斑海参；9，糙刺参；10，玉足海参；
29.图4为海参16s rrna基因扩增的通用引物及扩增方法方法用于未知海参样品dna扩增结果，其中：m，dnamaker；1，海参样品1；2，海参样品2；3，海参样品3；4，海参样品4；
30.图5为海参16s rrna基因扩增的通用引物及扩增方法用于海域沉积物提取dna样品扩增结果，其中m，dnamaker；1，长棘海星阴性对照；2，海域沉积物样品。
具体实施方式：
31.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
32.实施例1：海参16s rrna基因扩增的通用引物设计
33.获取表1所列的22种海参的线粒体基因组序列，从中获取完整的16s rrna基因序列，采用bioedit软件中的clustal w进行排列，选取如图1所示的区域作为正向引物序列来源，选取如图2所示的区域作为反向引物序列来源。由此获得海参16s rrna基因扩增的通用引物，引物序列如下:
34.16s-nuf:gtcatcatgaccgttctgcaaccgtgcdaaggtagcataat
35.16s-nur:cagggtacggatgtgcgagcgtcggtctgaactcagatcatg
36.其中划线部分为5’端接头部分，用于提高pcr产物直接测序时，两端有效测序的长度，增加有效测序16s rrna基因片段的长度。
37.表1用于16s rrna基因扩增的通用引物设计来源海参种类及线粒体序列
38.[0039][0040]
实施例2：设计引物以及扩增方法的效果验证
[0041]
对采自热带海域的方柱翼手参(colochirus quadrangularis)、花刺参
(stichopus monotuberculatus)、黄玉参(stichopus hermanni)、蛇目白泥参(bohadschia argus)、黑海参(holothuria atra)、绿刺参(stichopus chloronotus)、棘辐肛参(actinopyga echinites)、黑斑海参(bohadschia vitiensis)、糙刺参(stichopus horrens)、玉足海参(holothuria leucospilota)个体，取体壁组织50mg，采用海洋动物基因组提取试剂盒(天根生化，中国)进行基因组dna提取。
[0042]
配制pcr反应体系：dna模板各1.0μl，上游引物16s-nuf(10μm)和下游引物16s-nur(10μm)各1.0μl，premix extaq酶(takara)25μl，用灭菌水补足至50μl。
[0043]
pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸60sec，32个循环；72℃延伸5min。
[0044]
扩增产物的琼脂糖电泳检测方法：取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合；以移液器取混合物，点于1％的琼脂糖胶(含核酸染料)中，然后进行电泳，电压100v,电泳时间30min。电泳后，取出琼脂糖胶，置于紫外凝胶成像系统中，拍照成像，判断扩增dna片段的大小。
[0045]
电泳结果(图3)显示，10种不同种属的海参dna样品均获得扩增结果，扩增片段的大小约为511bp，与预期相符。表明引物和扩增方法可用于不同种属的海参的16s rrna基因有效扩增。
[0046]
实施例3：海参16s rrna基因扩增引物和扩增方法用于未知海参样品的分子鉴定
[0047]
从市场采集四种干货海参样品(1、2、3、4)，分别取30mg体壁组织，采用海洋动物基因组dna提取试剂盒(天根生化，中国)进行常规的基因组dna提取。
[0048]
配制pcr反应体系：dna模板各1.0μl，上游引物16s-nuf(10μm)和下游引物16s-nur(10μm)各1.0μl，premix extaq酶(takara)25μl，用灭菌水补足至50μl。
[0049]
pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸60sec，32个循环；72℃延伸5min。
[0050]
扩增产物的琼脂糖电泳检测方法：取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合；以移液器取混合物，点于1％的琼脂糖胶(含核酸染料)中，然后进行电泳，电压100v,电泳时间30min。电泳后，取出琼脂糖胶，置于紫外凝胶成像系统中，拍照成像，判断扩增dna片段的大小。
[0051]
电泳结果(图4)显示，四种干货海参的dna样品均获得扩增结果，扩增片段的大小约为511bp，与预期相符。
[0052]
将四种干货海参pcr产物直接递交公司做常规测序，测序引物为scu-1s、scu-2rs(scu-1s:gtcatcatgaccgttctgc；scu-2rs:cagggtacggatgtgcgag)，测序结果分别见序列seq id no.1-4，进行blast比对，比对结果显示四种海参分别为红腹海参(holothuria edulis)、白尼参(bohadschia argus)、灰海参(holothuria grisea)、墨西哥海参(holothuria mexicana)。
[0053]
上述结果表明本发明设计的海参16s rrna基因扩增引物和扩增方法完全可用于未知海参样品的分子鉴定。
[0054]
实施例4：海参16s rrna基因扩增引物和扩增方法用于海域海参种类和丰度监测
[0055]
从南海七连屿海域取海底沉积物样品20g，采用海洋动物基因组提取试剂盒提取dna。
[0056]
配制pcr反应体系：dna模板各1.0μl，上游引物16s-nuf(10μm)和下游引物16s-nur(10μm)各1.0μl，premix extaq酶(takara)25μl，用灭菌水补足至50μl。
[0057]
pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30s，72℃延伸60sec，32个循环；72℃延伸5min。
[0058]
pcr扩增产物的琼脂糖电泳检测方法：取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合；以移液器取混合物，点于1％的琼脂糖胶(含核酸染料)中，然后进行电泳，电压100v,电泳时间30min。电泳后，取出琼脂糖胶，置于紫外凝胶成像系统中，拍照成像，判断扩增dna片段的大小。
[0059]
电泳结果(图5)显示，显示该样品提取dna获得扩增结果，扩增片段的大小约为511bp，与预期相符。将pcr产物直接递交公司做高通量测序，采用常规生物信息学方法分析测序结果即可。
技术特征：1.一种海参通用扩增引物，其特征在于，靶引物序列如下：16s-nuf:gtcatcatgaccgttctgcaaccgtgcdaaggtagcataat；16s-nur:cagggtacggatgtgcgagcgtcggtctgaactcagatcatg。2.一种鉴别海参的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的海参通用扩增引物。3.一种鉴别海参的方法，其特征在于，提取待测样品的dna，然后以权利要求1所述的海参通用扩增引物进行pcr扩增，如果扩增片段的大小约为511bp，则是海参，否则则不是。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增，其pcr反应体系为：dna模板0.5-1.5μl，5-15μm上游引物和5-15μm下游引物各0.5-1.5μl，premix extaq酶25μl，用灭菌水补足至50μl。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增，其pcr反应体系为：dna模板1.0μl，10μm上游引物和10μm下游引物各1.0μl，premix extaq酶25μl，用灭菌水补足至50μl。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增，其pcr反应程序为：94℃预变性2-5min；94℃变性15-60sec，54-58℃退火20-40sec，72℃延伸30-90sec，30-35个循环；72℃延伸4-6min。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸60sec，32个循环；72℃延伸5min。8.权利要求1所述的海参通用扩增引物在鉴别海参中的应用。
技术总结本发明公开了一种海参通用扩增引物、扩增方法及应用。海参通用扩增引物，引物序列如下：16S-NUF:GTCATCATGACCGTTCTGCAACCGTGCDAAGGTAGCATAAT；16S-NUR:CAGGGTACGGATGTGCGAGCGTCGGTCTGAACTCAGATCATG。海参具有非常丰富的种类，近年来特别是热带海参的研究、开发成为热点。本发明提供了一种海参通用扩增引物、扩增方法及应用，可以用于海参的分子鉴定、种系发生研究以及海域的海参种群的分子监测。生研究以及海域的海参种群的分子监测。生研究以及海域的海参种群的分子监测。
技术研发人员：罗鹏 夏淑贤 鄂子譞 尹佳悦 胡超群 马波 任春华 王艳红
受保护的技术使用者：南方海洋科学与工程广东省实验室（广州）
技术研发日：2022.01.25
技术公布日：2022/7/5
