一种调控icp过程中胎盘滋养细胞凋亡与增殖的lncrna及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种调控icp过程中胎盘滋养细胞凋亡与增殖的lncrna及其应用。
背景技术：2.妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，icp)是一种妊娠期特发病，临床上以胆汁酸升高、肝功能异常及皮肤瘙痒为特征，对围产儿危害极大
[1-3]
。icp全球发病率约为4.5％-15％，国内发病率与其基本一致
[4,5]
。据流行病学调查显示，随着人们饮食习惯的改变以及生活环境的变化，妊娠期肝内胆汁淤积症的患病率呈现出逐年上升的状态
[6]
。icp发病可引起胎膜早破、早产、羊水粪染、胎儿宫内窘迫及胎儿不明原因死亡和孕妇产后出血等母婴预后不良
[7,8]
。值得一提的是，母体发生icp是引起新生儿黄疸发生率升高的原因之一，新生儿黄疸是新生儿时期最为常见的疾病，若得不到及时有效地干预，将会导致一系列严重全身性症状，影响正常生长发育，甚至造成脑损伤
[9-12]
。迄今，icp 的病因及确切的发病机制尚不清楚，多数研究认为免疫失衡、激素代谢异常、遗传、基因、细胞凋亡、氧化应激等因素起重要作用，各种临床治疗只能缓解孕妇的瘙痒等症状，并不能减轻对胎儿的危害
[13][2]
。因此，icp发病过程中的分子机制的研究一直是产科领域的重要课题。针对这一临床难题深入开展研究，无论对临床控制icp发生，还是对减少母婴并发症等均具有十分重要的意义。
[0003]
长链非编码rnas(long non-coding rnas，lncrnas)是一类内源性非编码长链 rna，长度大于200个核苷酸(nt)，进化上高度保守。近年来已证实可由细胞释放到胞外，在细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭迁移等生理和病理过程中发挥重要作用，通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，其功能几乎涉及到生命的所有领域
[14,15]
。近年来长链非编码rna与妊娠相关疾病研究已逐年增多，可参与调控胚胎发育、x染色体失活、子痫前期、fgr等生理病理性过程
[16-20]
。但目前长链非编码rna对icp中的作用机制研究尚少有人涉及，提示长链非编码rna可作为妊娠期肝内胆汁淤积症的一个新的研究热点。
[0004]
本课题组研究发现lncrnarp11-782c8.5在妊娠期肝内胆汁淤积症组胎盘中的表达显著高于对照组，并且可促进icp过程中胎盘滋养细胞的凋亡，并抑制细胞增殖。
[0005]
参考文献：
[0006]
[1]ovadia,c.and c.williamson,intrahepatic cholestasis of pregnancy:recent advances.clin dermatol,2016. 34(3):p.327-34.
[0007]
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[0008]
[3]kremer,a.e.,k.wolf and s.stander,[intrahepatic cholestasis of pregnancy:rare but important].hautarzt, 2017.68(2):p.95-102.
[0009]
[4]王晓东,孙琴与张丽,重视妊娠期肝内胆汁淤积症的规范化诊治.中华妇幼临
169.
[0025]
[20]shi,z.,et al.,microarray expression profile analysis of long non-coding rnas in umbilical cord plasma reveals their potential role in gestational diabetes-induced macrosomia.cell physiol biochem,2015. 36(2):p.542-54.
技术实现要素：[0026]
本发明的目的在于提供调控妊娠期肝内胆汁淤积症过程中胎盘滋养细胞凋亡与增殖的lncrnarp11-782c8.5及其应用。
[0027]
为实现上述目的，本发明通过以下方案实现：
[0028]
lncrnarp11-782c8.5作为治疗靶点在制备治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。
[0029]
lncrnarp11-782c8.5作为治疗靶点在筛选治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。
[0030]
本发明的调控胎盘滋养细胞凋亡与增殖的lncrnarp11-782c8.5是申请人在前期完成的icp组与对照组胎盘lncrna差异表达谱结果基础上，通过icp胎盘 vs对照组胎盘进行定量pcr筛选获得的一个功能未知的长链rna分子。所述的 lncrnarp11-782c8.5对应的cdna序列的长度为766bp，序列如seq id no.1所示。经研究，申请人发现根据本发明的调控妊娠期肝内胆汁淤积症过程中胎盘滋养细胞凋亡与增殖的lncrnarp11-782c8.5分子设计的sirna转染进入 htr8/svneo细胞中，与对照组相比，低表达lncrnarp11-782c8.5后，mtt实验结果显示细胞增殖明显上调。流式结果显示细胞凋亡下调。
[0031]
抑制lncrnarp11-782c8.5表达的物质在制备治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。
[0032]
作为本发明的一种优选，所述的抑制lncrnarp11-782c8.5表达的物质选自 lncrnarp11-782c8.5的sirna或抑制其表达的载体或其他物质。
[0033]
有益效果：
[0034]
本发明提供的一种调控妊娠期肝内胆汁淤积症过程中胎盘滋养细胞凋亡与增殖的lncrnarp11-782c8.5的荧光定量pcr检测引物。根据 lncrnarp11-782c8.5基因序列，设计特异性引物，利用荧光定量pcr检测该 lncrna的表达，然后根据pcr扩增产物及基因相对表达量判断待检测样本是否存在lncrnarp11-782c8.5基因及其表达情况(表1)。
[0035]
本发明发现lncrnarp11-782c8.5在妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘中高表达 (图1)，在icp模型的胎盘滋养细胞中高表达(图2)。通过设计sirna在 htr8/svneo细胞中低表达lncrnarp11-782c8.5成功后，可抑制细胞凋亡(图3) 并且促进细胞增殖(图4)。因此，lncrnarp11-782c8.5的sirna或抑制其表达的物质或载体可在制备缓解icp的药物中应用。
附图说明
[0036]
图1 lncrnarp11-782c8.5在icp组及正常组胎盘中表达情况
[0037]
图2 lncrnarp11-782c8.5在tca刺激模拟icp组、正常组及分别敲减incrna后的胎盘滋养细胞中表达情况
[0038]
从图中可以看出，tca处理后lncrna表达明显上升，进行干扰后lncrna表达下降。
[0039]
图3敲减lncrnarp11-782c8.5可以抑制icp胎盘滋养细胞的凋亡
[0040]
a.凋亡结果图十字散点图，左上象限是死细胞，左下象限是正常活细胞，右下象限是早期凋亡细胞，右上象限是晚期凋亡细胞。b.实验中使用one way anova统计的右上象限的细胞的比例。从结果中可以看出，加入tca处理后细胞凋亡增加，而干扰lcrna后，凋亡下调。
[0041]
图4敲减lncrnarp11-782c8.5可以促进细胞增殖
[0042]
从图中可以看出，与对照组比较，tca组经过牛磺胆酸处理，htr8/svneo细胞增殖明显下调；敲减lncrna后，细胞增殖明显上调。
[0043]
(*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001)。
具体实施方式
[0044]
材料与方法实验材料：人胎盘滋养细胞系htr8/svneo购自上海酶研生物公司。primescriptrt reagent kit with gdna eraser试剂盒购自takara公司、rna提取试剂购自 alladin公司、mtt试剂盒购自beyotime公司、pi annexinv fitc细胞凋亡检测试剂盒购自ebioscience公司、sirna干扰试剂盒订购自thermo fisher公司、lipo3000 购自thermofisher公司、dmem培养基及胎牛血清购自wisent公司。
[0045]
实施例1
[0046]
1.lncrnarp11-782c8.5基因
[0047]
本实施例所述lncrnarp11-782c8.5对应的cdna序列如seq id no.1所示，本发明的人lncrnarp11-782c8.5是申请人基于前期完成的胎盘组织基因芯片结果，通过对icp患者胎盘及正常孕产妇胎盘组织样品的基因芯片结果进行大量生物信息学分析筛选获得的一个功能未知的lncrna分子。cdna序列的长度为766bp。
[0048]
2.临床标本
[0049]
本研究标本来自于2019年至2020年在无锡市妇幼保健院生产的孕产妇，选取icp患者胎盘及同期对照各10例。所有切除组织均经组织病理学检查证实，所有样品均被快速保存于-80℃低温冰箱。本研究由无锡市妇幼保健院伦理委员会批准，并获得每位病人的知情同意。
[0050]
3.细胞株
[0051]
htr8/svneo细胞是贴壁细胞，培养在dmem培养基中，含10％胎牛血清， 100u/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，培养在37℃含5％co2的细胞培养箱中。细胞传代培养：当细胞长至80-90％时，去除培养基，加入pbs洗1-2次，去除pbs 后，加入1ml胰酶消化1-3min后，加入3ml完全培养基中和胰酶终止消化，将消化的细胞转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。倒掉上清后，加入3ml培养基重悬细胞，1:3传代至培养皿中培养。在细胞长至约70％时，通过加入100μm牛磺胆酸tca继续培养24h，即构建为icp细胞模型组。细胞使用预冷pbs洗一次后，加入1ml trizol，充分转移至ep管中
[0052]
4.样品总rna提取
[0053]
利用传统的trizol、氯仿法提取胎盘组织及细胞总rna，具体步骤如下：
[0054]
4.1液氮研磨，取50-100mg组织样品放于研钵中，倒入液氮少许，迅速研磨，待液氮
挥发干净再加入少量液氮，直至组织样品研为粉末，将组织样品转入1.5ml 离心管中，加入1ml trizol，试温放置5min，使其充分裂解，4℃12000g离心10min，将上清转入干净的无rnaase的1.5ml离心管中；细胞则使用预冷pbs洗一次后，加入1ml trizol，充分转入1.5ml离心管中。
[0055]
4.2加入氯仿200ul，用力振摇15s，室温静置15min，离心(4℃,12,000g,15min).
[0056]
4.3离心后液体分为三层，小心吸取上层无色液体移入一新的ep管中。
[0057]
4.4加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀,室温静置5min,离心 (4℃,12,000g,10min)。
[0058]
4.5去上清,沉淀加入75％乙醇1ml,轻微振荡15s，离心(4℃,7,500g,5min)。
[0059]
4.6小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min.最好是用枪头吸取上清,尽量除去。
[0060]
4.7加入50μl depc水溶解，nanodrop检测浓度，-80℃冰箱保存。
[0061]
rna纯度根据nano drop检测的浓度和od230，od260，od280决定。
[0062]
4.8逆转录
[0063]
逆转录实验步骤按照逆转录试剂盒说明书操作(takara,rr047)具体逆转录体系如下：
[0064]
去除基因组dna。
[0065][0066]
注：按照以上方法在冰上进行反应液的配制，然后放置于室温，反应10min。该部分就是根据上述体系将试剂混匀即可，由于是试剂盒，所以里面出现的试剂是试剂盒中的试剂。
[0067]
逆转录pcr反应
[0068][0069]
注：按照以上方法混合后，置于pcr仪中进行反转录，条件为50℃15min，85℃ 5min。上述去除基因组和逆转录反应，是takara primescript
tm rt reagent kitwith gdna eraser试剂盒中的试剂，根据试剂盒操作即可，就是将rna同上述反应体系的试剂混匀后，放入pcr中根据所需的温度反应即可。
[0070]
4.9荧光定量pcr
[0071][0072]
反应条件：95℃，10min；95℃，5s，60℃，1min，40cycles；95℃15s，65℃60s， 95℃15s，1个循环。
[0073]
定量pcr根据上述反应体系加入各种反应试剂，sybr green是混匀好的试剂，里面有taq polymerase，dntp，sybr green染液，反应缓冲液。引物由金斯瑞公司合成，序列见表1。
[0074]
整个试剂配制体系在冰上配制，根据上述反应体系轻轻混匀后，将8连管用盖子盖好后，在离心机中瞬时离心将贴在管壁上的液体沉到底部。将8连管放入定量 pcr检测，采用以上反应体系。pcr反应结束后，直接将8连管丢弃，直接根据仪器收集的数值对数据进行分析即可。
[0075]
结果见图1及图2。
[0076]
从图1可以看出，icp患者的胎盘中lncrnarp11-782c8.5表达情况，较正常组明显高表达。
[0077]
从图2可以看出，tca处理模拟icp后lncrnarp11-782c8.5表达明显上升。
[0078]
实施例2细胞转染
[0079]
lncrnarp11-782c8.5的干扰rna序列由上海吉玛基因公司设计与合成。将1
×
106个htr8/svneo细胞接种于六孔板中，待细胞贴壁后，使用脂质体转染si-lncrna。转染方法：a.稀释si-lncrna：用50μl不含血清培养基opti-mem稀释100nm si-lncrna，轻轻混匀，室温育5min；
[0080]
b.稀释lipo3000：用50μl不含血清培养基opti-mem稀释5μl lipo3000，轻轻混匀并室温孵育5min；
[0081]
将a与b轻轻混匀，室温孵育20min，加入6孔板中(6孔板1个孔100ul脂质体转染混合液)，放入培养箱培养48h。去除培养基，用pbs清洗细胞两次。根据分组加入100μm牛磺胆酸tca继续培养24h。收集细胞进行验证或后续实验。
[0082]
实施例3细胞凋亡实验
[0083]
使用pi-annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(ebioscience，bms500fi)进行实验，在实施例2的基础上，即各组加入100μm牛磺胆酸tca继续培养24h后，收集培养上清，用胰酶消化贴壁的细胞，1000rpm离心5min，弃上清。(将细胞培养上清中的细胞和贴壁细胞全部收集到离心管中)，用预冷的pbs洗三次细胞， 4℃，1000rpm离心5min，弃上清。加入1ml binding buffer洗细胞，4℃，1000rpm 离心5min，弃上清。加入100μl binding buffer重悬细胞，加入5μl pi和5μlfitc-annexin v，混合均匀，常温避光孵育15min，加入400μl binding buffer混匀，立刻用流式细胞仪进行检测，annexin v-fitc的绿色荧光通过fitc
通道(fl1)检测，pi红色荧光通过pi通道(fl2)检测。收集和分析数据。
[0084]
结果见图3，可见低表达lncrnarp11-782c8.5可以显著抑制胎盘滋养细胞凋亡。
[0085]
实施例4细胞增殖实验
[0086]
1、htr8/svneo细胞培养在dmem培养基中，含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，培养在37℃，5％co2的细胞培养箱中。
[0087]
2、将长到80％-90％的细胞用胰酶消化下来，1000rpm离心，去除上清，加入完全培养基重悬细胞，将细胞分别种在96孔板中，每孔5000个细胞。
[0088]
3、细胞分组：ctrl组、牛磺胆酸tca组、si-lncrna低表达组、tca+si-lncrna 组。待细胞贴壁后，si-lncrna低表达组与tca+si-lncrna组根据实施例2进行转染操作，即至将a与b轻轻混匀，室温孵育20min，加入96孔板中(96孔板1个孔10μl 脂质体转染混合液)，放入培养箱培养48h。48h后根据分组加入100μm牛磺胆酸tca培养24h，24h后取出细胞。
[0089]
4、每孔分别加入10μlmtt(5mg/ml)，在细胞培养箱中继续培养约3h。
[0090]
5、去除培养基，每孔加入150μl formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解。通常37℃孵育 4小时，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些，此时为加速溶解可以适当振摇数次。在570nm测定吸光度。
[0091]
结果见图4，可见低表达lncrnarp11-782c8.5可以促进胎盘滋养细胞增殖。
[0092]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0093]
表1 lncrnarp11-782c8.5荧光定量pcr引物序列
[0094]
技术特征：1.lncrnarp11-782c8.5作为治疗靶点在制备治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。2.lncrnarp11-782c8.5作为治疗靶点在筛选治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。3.抑制lncrnarp11-782c8.5表达的物质在制备治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的抑制lncrnarp11-782c8.5表达的物质选自lncrnarp11-782c8.5的sirna或抑制其表达的载体或其他物质。
技术总结本发明公开了一种调控ICP过程中胎盘滋养细胞凋亡与增殖的LncRNA及其应用。抑制LncRNARP11-782C8.5表达的物质在制备治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药物中的应用。本发明发现LncRNARP11-782C8.5在妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘中高表达(图1)，在ICP模型的胎盘滋养细胞中高表达(图2)。通过设计siRNA在HTR8/SVneo细胞中低表达LncRNARP11-782C8.5成功后，可抑制细胞凋亡(图3)并且促进细胞增殖(图4)。因此，LncRNARP11-782C8.5的siRNA或抑制其表达的物质或载体可在制备缓解ICP的药物中应用。用。用。
技术研发人员：邹萍 张婷 王高莹 王晶 董蕊锐 赵军 许耀辉 蒋其
受保护的技术使用者：无锡市妇幼保健院
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2022/7/5
