1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种核壳结构的载药纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：2.金黄色葡萄球菌(s.aureus)感染的人口约占总人口数的30％，是食源性疾病的主要原因。在伤口愈合过程中，止血、炎症、增殖和重塑等级联过程是有序发生的，细菌感染扰乱了皮肤修复的这些步骤，而延迟的伤口愈合反过来又会导致伤口部位的持续感染，导致感染的恶化。
3.在抗生素治疗效果日益下降的情况下，需要积极寻找各种具有替代作用的新型抗菌药物来对抗不断进化的多药耐药性细菌，其中，抗菌肽独特的杀菌机制让抗菌肽在有着高效、广谱抗菌效果的同时，还不易诱导细菌产生耐药性，被认为是抗生素的潜在替代品。但是抗菌肽所具有的非靶标毒性是掣肘抗菌肽广泛应用的原因之一。此外，在面对复杂的感染环境，特别是生物膜存在时，单一的抗菌肽并不能达到预期的治疗效果。
技术实现要素：4.本发明的目的是提供一种具有抗菌活性且生物相容性良好的核壳结构的载药纳米颗粒及其制备方法和应用，将抗菌效果优异的抗菌肽包埋至环境友好的明胶纳米粒中，外部再偶联上优良的光热剂cypate，对能释放明胶酶的细菌具有特定的识别和消灭能力。本发明制备的载药纳米颗粒整合多种抗菌手段为选择性治疗葡萄球菌皮肤感染和利用抗菌光动力疗法加速创面愈合提供了一种新的方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供的核壳结构的载药纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3由a型明胶、荧光标记的抗菌肽amp-cy3、光热剂cypate组成；
7.抗菌多肽用mbha树脂进行固相合成，即将固相树脂上被fmoc保护的单体氨基酸脱保护后，暴露氨基，再与下一个已活化羧基的氨基酸通过缩合反应形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，如此循环往复直至合成目标肽gkrwwkwwrr(amp)。
8.接着切除甘氨酸n端的fmoc保护集团，n端暴露的氨基与5倍过量的cy3在等摩尔比hobt、edc存在的情况下偶联12h，形成序列amp-cy3，最后，用含有三氟乙酸(tfa)的切割液将肽链从树脂上切下，高效液相色谱进行纯化。
9.核壳结构的载药纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3是经过两步去溶法合成，明胶以及经脱水缩合反应连接的cypate为纳米外壳，cy3标记的抗菌肽为嵌入式核心。
10.具体制备方法为：
11.(1)首先，将明胶一步去溶后加入amp-cy3，调节ph值为2.2～3；接着二步去溶后滴加交联剂50％w/v戊二醛水溶液，室温下搅拌16h，旋蒸、离心，取上层清液gnps@amp-cy3备用。
12.(2)cypate中的羧基经nhs、edc(nhs:edc＝1:1)调节活化后，加入至步骤(1)中反应3h，离心、透析得到复合纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3。
13.本发明核壳结构的载药纳米颗粒由a型明胶及其偶联的光热剂cypate共同组成纳米外壳，cy3标记的抗菌肽(amp-cy3)为嵌入式核心。在常驻微生物产生的明胶酶的环境中，明胶纳米粒响应性释放出抗菌肽，从而实现高效抗菌，而且纳米粒明胶核壳式的结构规避了抗菌肽的细胞毒性，还可以促进正常细胞的生理活性，而光热剂cypate优异的光热转换性能又进一步提升载药纳米粒的抗菌效果，在抑菌、细菌感染伤口治疗方面均有广泛的应用前景。
14.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.(1)本发明核壳结构的载药纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3在金色葡萄球菌菌液中会被明胶酶降解，释放出抗菌肽序列，从而达到抗菌目的。明胶核壳式结构的存在促进了正常细胞的生理活性，非常适用于促进感染伤口的愈合。
16.(2)本发明核壳结构的载药纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3中引入荧光染料cypate进行光热(ptt)抗菌，在近红外光照射下，产生光热效应。与抗菌肽的联合进一步提升了载药纳米粒的抗菌效果。
17.(3)本发明核壳结构的载药纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3制备工艺简便，成本低廉，适合广泛推广使用。
附图说明：
18.图1为抗菌肽(1a)、cy3标记的抗菌肽(1b)的hplc图；
19.图2为抗菌肽的质谱图；
20.图3为载药纳米颗粒的扫描电子显微镜(sem)图片；
21.图4为gnps、gnps@amp-cy3、cypate-gnps@amp-cy3的紫外吸收图；
22.图5为cypate(5a)、cypate-gnps@amp-cy3(5b)的光稳定性考察图；
23.图6为不同浓度载药纳米颗粒的光热升温曲线图；
24.图7为载药纳米颗粒透析电泳图；
25.图8为不同浓度载药纳米颗粒对s.aureus、e.coli的杀菌效果图；
26.图9为近红外激光照射前后载药纳米颗粒对s.aureus杀菌活性测定及活/死染色测定；
27.图10为近红外激光照射前后载药纳米颗粒对e.coli的杀菌活性测定及活/死染色测定；
28.图11为载药纳米颗粒对e.coli的生长曲线影响图；
29.图12为载药纳米颗粒对s.aureus的生长曲线影响图；
30.图13为载药纳米颗粒对l929细胞的生物相容性测定结果；
31.图14为载药纳米颗粒对huvec细胞的生物相容性测定结果；
32.图15为载药纳米颗粒对3t3细胞的迁移影响图；
33.图16为载药纳米颗粒对l929细胞的迁移影响图；
34.图17为载药纳米颗粒在体内治疗小鼠背部金黄色葡萄球菌感染伤口11天内的伤口愈合照片及感染伤口区域愈合面积的量化图。伤口愈合率的值(原始伤口的百分比)代表
来自三个独立实验的平均值；
35.图18为载药纳米颗粒在体内治疗小鼠背部大肠杆菌感染伤口11天内的伤口愈合照片及感染伤口区域愈合面积的量化图。伤口愈合率的值(原始伤口的百分比)代表来自三个独立实验的平均值；
36.图19为载药纳米颗粒动物伤口组织涂板实验图；
37.图20为对比实施例1载药纳米颗粒(3.2mg amp-cy3)对l929细胞的生物相容性测定结果；
38.图21为对比实施例1不同浓度载药纳米颗粒对s.aureus的杀菌效果图。
具体实施方式
39.以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。
40.实施例1
41.1.抗菌肽amp-cy3制备
42.首先，以α-氨基酸为原料，200mg mbha树脂为载体，通过fmoc固相合成法合成，即称取mbha树脂5倍当量的氨基酸，5倍当量的缩合剂hbtu和hobt，在4ml dmf中溶解后加入400μl diea，与树脂交联45min。
43.其次，加入哌啶/dmf(20％，v/v)反应30min切除氨基酸上的fmoc保护基团。每步均使用茚三酮进行颜色检验，重复上述步骤直至序列合成。
44.再使用哌啶/dmf(20％，v/v)将甘氨酸n端的fmoc基团切割掉，n端暴露的氨基与5倍当量的cy3以及等摩尔比的edc和hobt避光反应12h，形成序列amp-cy3。目标肽链使用切割液(tfa、edt、去离子水和tis(94:2.5:2.5:1,v/v/v/v))在室温下静置反应3h，使目标肽从树脂上分离，用冰乙醚沉淀，离心后，沉淀溶于超纯水，经hplc纯化收集产物峰，冻干后通过lc ms确定分子量。hplc纯化图和质谱图见附图1和附图2。
45.2.未载药的空白纳米粒gnps的制备
46.将1.25g a型明胶溶于25ml超纯水中，温度40℃，高速搅拌30min。然后加入40ml冷丙酮，室温下静置60min。丢弃上清液，再次溶解于25ml超纯水中，用1m hcl将明胶溶液的ph值调整为2.2～3，搅拌滴加冷丙酮40ml(2ml/min)，搅拌10min，滴加125μl交联剂(50％w/v戊二醛水溶液)，室温下搅拌16h，旋蒸除去有机试剂，高速离心30min，除去未交联明胶。
47.3.核壳结构的载药纳米颗粒制备
48.将1.25g a型明胶溶于25ml超纯水中，温度为40℃。高速搅拌30min。加入40ml冷丙酮，在室温下静置60min。丢弃上清液，沉淀用25ml超纯水溶解，加入4mg amp-cy3，用1m hcl将明胶溶液的ph值调整为2.2～3，搅拌滴加冷丙酮40ml(2ml/min)，搅拌10min，滴加125μl交联剂(50％w/v戊二醛水溶液)，室温下搅拌16h，旋蒸除去有机试剂，高速离心30min，除去未交联明胶。取上层清液(gnps@amp-cy3)备用。
49.2mg cypate中加入nhs、edc(即摩尔比nhs:edc＝1:1)，在ph＝7条件下反应30min，从而活化cypate的羧基，接着加入5ml gnps@amp-cy3反应3h。在去离子水中透析后，得到明胶酶响应性载药纳米颗粒。
50.edc的量是根据活化cypate结构中所存在的羧基量决定的，羧基量：edc＝1:1.2～
1.5；
51.4.载药纳米颗粒紫外吸收的测定实验
52.取200μlgnps、gnps@amp-cy3、cypate-gnps@amp-cy3溶液于96孔板中，用酶标仪扫描500nm～850nm全波长吸收，紫外吸收图谱如附图4所示。由图可知，单独的gnps在500nm～850nm没有特征吸收，而gnps@amp-cy3在550nm处有cy3的特征吸收峰，说明了amp-cy3成功嵌入明胶纳米粒中。cypate-gnps@amp-cy3在780附近的cypate特征吸收峰，说明cypate成功接到明胶纳米粒外壳上，并且780nm处较宽的吸收带，也说明了纳米粒具有良好的光热转换效能。
53.5.载药纳米颗粒紫外吸收的光稳定性评估
54.取200μl相同浓度的cypate-gnps@amp-cy3、cypate于96孔板中，808nm激光照射10min后于酶标仪采集其400nm～1000nm全波长吸收，未经光照的溶液作为对照组。如附图5(a、b)所示，经过808nm激光照射后，单独的cypate在780nm处的紫外吸收有明显的下降，cypate-gnps@amp-cy3在光照前后吸收峰强度几乎没有变化，表明cypate-gnps@amp-cy3优良的光稳定性。
55.6.载药纳米颗粒的光热性能测试
56.取300μl不同浓度的cypate-gnps@amp-cy3溶液(0μm、4μm、8μm、16μm、)于1.5ml离心管中，使用近红外激光(808nm 1.8w/cm2)照射6min，温度变化由热成像仪采集。结果见附图6，由图可知，cypate-gnps@amp-cy3具有良好的光热性能，升温效果与浓度呈正相关。
57.7.载药纳米颗粒透析不同时间段电泳图
58.将gnps@amp-cy3放于透析袋(mw:14000)中透析，各个时间段取出袋中透析液使用ce-fl进行分析，观察荧光信号的变化。样品选用480nm的波长激发，进样时间为20s，观察550nm通道(对应cy3的发射波长)的电泳谱图，结果见附图7(a、b)，由图可知，由于amp-cy3被嵌入进明胶纳米粒中，所以在285nm处出现了一个新的电泳峰，并且随着透析时间延长，amp-cy3在300nm处的电泳峰逐渐降低，12h时300nm处的电泳峰消失，说明amp-cy3已经透析完毕。而cypate-gnps@amp-cy3透析12h峰型变化可能是由于cypate影响的缘故。
59.8.载药纳米颗粒体外抗菌活性测定
60.将125μl cypate-gnps@amp-cy3与250μl金黄色葡萄球菌或大肠杆菌培养物(108cfu/ml)混合并孵育1h。孵育结束后稀释涂板并放入生化培养箱培养后，对琼脂板上的菌落进行计数(n≥3)以评估cypate-gnps@amp-cy3的抗菌性能。
61.s.aureus与e.coil的抗菌效果分别见于附图8，由图可知纳米粒对金黄色葡萄球菌的杀伤效果较好，15μm时就可达到90％以上的杀伤效果，但是，对大肠杆菌的杀伤效果明显降低，这也表明载药纳米颗粒优良酶响应的杀菌效果。
62.9.载药纳米颗粒光热抗菌活性测定以及细菌live/dead测定
63.将125μl cypate-gnps@amp-cy3与250μl金黄色葡萄球菌或大肠杆菌培养物(108cfu/ml)混合。然后将细菌和cypate-gnps@amp-cy3的混合物用nir激光(808nm，1.8w/cm2)照射6min，孵育1h，完成后稀释涂板并放入生化培养箱培养后，对琼脂板上的菌落进行计数(n≥3)以评估载药纳米颗粒的光热抗菌性能。结果见附图9、10。可见加上光热之后抗菌效果显著增强，可达到100％，良好的体外光热抗菌性能为下一步的活体应用提供了支持。
64.通过活/死细菌染色实验验证cypate-gnps@amp-cy3对s.aureus和e.coli作用前后的细菌死亡情况。各取1ml s.aureus、e.coli菌液冷冻离心(5000rpm，4℃，5min)，弃上清，然后向沉淀中加入250μl灭菌pbs重悬，然后向菌液中加入125μl cypate-gnps@amp-cy3，光照组用808nm近红外激光器(1.8w/cm2)照射细菌6min后，置于37℃恒温培养箱内共同孵育30min，对照组为pbs组。孵育结束后，冷冻离心。所有实验组均在室温下与含有3μm syto 9和3μm碘化丙啶(pi)的染料溶液混合20min，最后通过共聚焦显微镜成像。根据制造商的说明，活细菌细胞用syto 9染料(绿色)染色，而死细菌细胞因细胞壁和细胞膜受损而用碘化丙啶染料(红色)标记。结果见附图9、10，该结果表明载药纳米颗粒优良酶响应的杀菌效果的同时也提示其杀菌机制与细胞膜的破坏有关。
65.10.载药纳米颗粒对e.coli、s.aureus生长曲线的影响
66.为了探究载药纳米颗粒对细菌生长的影响，取96孔板加入50μl载药纳米颗粒，后加入150μl菌液(细菌浓度为105cfu/ml)，pbs为对照组，每组做三个平行样。使用酶标仪连续12h测定每孔在600nm处的吸光度值，评估载药纳米粒对细菌生长的影响。结果见附图11、12，由图可知pbs组的od600值在12h后达到峰值，而载药纳米颗粒的od600值变化不大，对大肠杆菌的抑制效果较差，但是加上激光照射之后两个细菌被显著抑制，该结果表明载药纳米颗粒优良酶响应的杀菌效果，加上激光照射产生的高温能进一步协同抑制细菌生长。
67.11.载药纳米粒的生物相容性测定
68.用mtt法来探究纳米材料对l929细胞和huvec细胞的毒性，以此来评估载药纳米颗粒的生物相容性。首先，将细胞接种在96孔微孔板(每孔104个细胞)上过夜，将载药纳米颗粒(92μm)加入dmem培养液稀释至2μm、4μm、8μm和16μm，将不同浓度(0μm、2μm、4μm、8μm和16μm)的载药纳米颗粒溶液与过夜培养的细胞共孵育，孵育24h及48h后，通过用酶标仪测量490nm处的吸光度来评估细胞的活力，以评估载药纳米颗粒的生物相容性。结果见附图13、14，由结果在载药纳米粒浓度16μm时细胞存活率均大于80％，结合纳米粒最小抑菌浓度，表明载药纳米粒在有效抑制细菌生长的同时还可以促进细胞的生理活性。
69.12.载药纳米粒的细胞迁移实验
70.用细胞划痕法来探究纳米材料对l929和3t3细胞的影响。首先，将细胞接种在9孔板(每孔5x104个细胞)上过夜，然后在各个孔板中心线划出相同平行线，pbs清洗后，与载药纳米颗粒(16μm)共同孵育，在0h、12h及24h时，通过荧光倒置显微镜观察细胞迁移生长状态，以评估载药纳米颗粒的生物相容性。结果见附图15、16，由结果可知载药纳米粒组的细胞迁移率均大于对照组，表明载药纳米粒在有效抑制细菌生长的同时还可以促进细胞的生理活性。
71.13.双伤口创面愈合实验
72.具体实验步骤为：
73.(1)balb/c小鼠背部双伤口细菌感染创伤模型
74.为了构建感染的小鼠双伤口模型，使用一次性活检穿孔器在小鼠的上背部和下背部创建两个贯穿肉膜的椭圆形全层伤口(8mm
×
6mm)，然后在伤口处接种细菌(107cfu/ml的s.aureus或e.coli)并感染72h。造模期间小鼠单笼饲养，自由饮水、进食。造模结束后，每个小鼠创口均感染细菌，呈发黄状态。
75.(2)动物分组
76.将15个小鼠随机分为5组：
77.a组为pbs对照组，给药剂量为200μl/伤口，外敷；
78.b组为gnps组，给药剂量为200μl/伤口，外敷；
79.c组为amp-cy3组，给药剂量为200μl/伤口，外敷；
80.d组为cypate-gnps@amp-cy3组，给药剂量为200μl/伤口，外敷；
81.e组为cypate-gnps@amp-cy3+ir组，给药剂量为200μl/伤口，外敷加光照
82.(3)分别将各组材料应用到小鼠背部伤口上，治疗五天后停止治疗，饲养观察至11天后处死小鼠。
83.经实验观察，第十一天时各个实验组小鼠背部伤口均有不同程度的修复。伤口图片、伤口面积定量及伤口组织涂板结果如附图17、18、19所示，可以看出d组(即cypate-gnps@amp-cy3组)金黄色葡萄球菌感染的伤口恢复有明显好转，而大肠杆菌感染伤口恢复效果较差。但是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌e组(即cypate-gnps@amp-cy3+ir组)的伤口恢复效果最好，瘢痕最小，验证了纳米材料的明胶酶响应性杀菌作用，并且在激光照射下产生光热效应具有更好的抗菌效果。
84.对照例1
85.明胶酶响应性载药纳米颗粒制备
86.加入3.2mg amp-cy3，得到cypate-gnps@amp-cy3(69μm)，其它同实施例1 3.明胶酶响应性载药纳米颗粒制备。
87.经dmem培养基稀释5.3倍后得浓度(0μm、2μm、4μm、7μm和13μm)，结果虽然显示出增值效果(见图20)，但无法达到抗菌肽抗菌浓度(15μm)(见图21)，因此，无法满足细胞毒性实验浓度需求(上限需将抗菌浓度(15μm)包括在内)。
88.以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
技术特征：1.一种核壳结构的载药纳米颗粒，其特征在于，所述载药纳米颗粒由a型明胶、cy3标记的抗菌肽amp-cy3和光热剂cypate组成；其中，抗菌肽的序列为gkrwwkwwrr，cy3偶联在抗菌肽序列的n端。2.如权利要求1所述的核壳结构的载药纳米颗粒，其特征在于，所述核壳结构载药纳米颗粒中，a型明胶及其偶联的cypate为纳米外壳，cy3标记的抗菌肽为嵌入式核心。3.如权利要求1所述的核壳结构的载药纳米颗粒，其特征在于，所述amp-cy3是通过fmoc固相合成法制得。4.如权利要求1所述的核壳结构的载药纳米颗粒，其特征在于，所述载药纳米颗粒粒径为150nm，电位为+0.873mv。5.一种如权利要求1所述的核壳结构的载药纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：(1)首先将明胶一步去溶后加入amp-cy3，调节ph值为2.2～3；接着二步去溶后滴加交联剂50％w/v戊二醛水溶液，室温下搅拌16h，旋蒸、离心，取上层清液gnps@amp-cy3备用；(2)cypate中的羧基经nhs、edc(nhs:edc＝1:1)调节活化后，加入至步骤(1)中反应3h，离心、透析得到复合纳米颗粒cypate-gnps@amp-cy3。6.一种如权利要求1所述的核壳结构的载药纳米颗粒的应用，其特征在于，所述核壳结构的载药纳米颗粒作为抗菌材料用于治疗伤口细菌感染。
技术总结本发明属于生物医药领域，具体涉及一种核壳结构的载药纳米颗粒及其制备方法和应用，该纳米颗粒是由明胶纳米粒、Cypate和荧光标记的抗菌肽构成的壳-核结构，A型明胶及其偶联的光热剂Cypate共同组成纳米外壳，Cy3标记的抗菌肽(AMP-Cy3)为嵌入式核心。当其存在于感染部位的明胶酶微环境中时，明胶外壳降解，内部荧光抗菌肽响应性释放，从而降低了抗菌肽的非靶标毒性。此外，光热剂Cypate经近红外光照射产生的热量也能为抗菌肽提供良好的杀菌协同作用，从而达到选择性快速根除感染部位细菌的目的。该复合纳米颗粒合成简便，生物相容性高，杀菌效果优异，作为抗菌剂具有潜在的临床转换价值。值。
技术研发人员：王建浩 李孟金 周心霈 惠泽轩 邱琳 崔朋飞 周舒文 王程 胡华安子
受保护的技术使用者：常州大学
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2022/7/5
