禽呼肠孤病毒微滴数字pcr检测引物组合物及其检测方法
技术领域
1.本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域，具体涉及禽呼肠孤病毒微滴数字pcr检测引物组合物及其检测方法。
背景技术：2.禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)是呼肠孤病毒科(reoviridae)，正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)的双链rna病毒，能够引起禽类病毒性关节炎、腱鞘炎、免疫抑制等疾病。arv在商品禽类中极其常见，其大部分毒株无致病性，但和其他病原微生物混合感染将会造成严重的后果，在病死鸡中一般都能分离出arv。因此对于arv的防控检测尤为重要。
3.微滴数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)具有灵敏度强、准确度高、可绝对定量且快速等优点。目前ddpcr已广泛应用在基因突变、病原微生物、转基因食品、肿瘤相关基因检测等多方面，尚未见该技术应用在检测arv病毒的报道。
技术实现要素：4.本发明要解决的技术问题是如何快速、准确的检测样品是否感染禽呼肠孤病毒。
5.为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的数字pcr试剂或试剂盒，所述数字pcr试剂或试剂盒包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段在内的禽呼肠孤病毒基因组dna片段的引物和与核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段特异结合的探针组成。
6.进一步地，上述的数字pcr试剂或试剂盒中，所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物arv-f和引物arv-r、探针arv-probe，
7.所述引物arv-f为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的单链dna或其衍生物；
8.所述引物arv-r为核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna或其衍生物；
9.所述探针arv-probe的核苷酸序列是序列表中seq id no.4。
10.本发明中，所述arv-probe为特异性识别禽呼肠孤病毒的探针，所述arv-probe的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。
11.荧光基团可选自但不限于fam(5/6-羧基荧光素)、vic(绿色荧光蛋白)、tet(四氯-6-羧基荧光素)、joe(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、hex(六氯-6-甲基荧光素)、cy3、tamra(6-羧基四甲基若丹明)、rox(羧基-x-罗丹明)、texas red、lc red640、cy5(花菁燃料)、lc red705、fitc(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重pcr检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同即可。
12.所述淬灭基团可选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。
13.进一步地，上述的数字pcr试剂或试剂盒中，所述arv-f、arv-r、arv-probe的物质的量比值为4:4:1。
14.进一步地，上述的数字pcr试剂或试剂盒中，所述数字pcr试剂或试剂盒还包括阳
性标准品质粒。
15.进一步地，上述的数字pcr试剂或试剂盒中，所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子。
16.进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述arv-f、arv-r和arv-probe可分别单独包装也可组合包装。所述阳性标准品质粒单独包装。
17.所述组合包装可为禽呼肠孤病毒引物探针组合物arv-f、arv-probe和arv-r作为一组包装。
18.本发明中，所述arv阳性标准品质粒含有核苷酸如seq id no.1所示的dna分子。
19.为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的组合物，所述组合物包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段在内的禽呼肠孤病毒基因组dna片段的引物和与核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段特异结合的探针组成。
20.进一步地，上述的组合物中，所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物arv-f和arv-r、探针arv-probe，
21.所述arv-f为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的单链dna或其衍生物；
22.所述arv-r为核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna或其衍生物；
23.所述arv-probe的核苷酸序列是序列表中seq id no.4。
24.进一步地，上述的组合物中，所述arv-f、arv-r、arv-probe的物质的量比值为分别为4:4:1。
25.为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述的组合物在如下a1)-a6)中的应用：
26.a1)检测或辅助检测禽呼肠孤病毒；
27.a2)检测或辅助检测待测样本是否感染禽呼肠孤病毒；
28.a3)检测或辅助检测待测病原是否为禽呼肠孤病毒；
29.a4)制备检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的产品；
30.a5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染禽呼肠孤病毒的产品；
31.a6)制备检测或辅助检测待测病原是否为禽呼肠孤病毒的产品。
32.本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。
33.为解决上述技术问题，第四个方面本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的方法，所述方法包括使用上述的数字pcr试剂或试剂盒或上述的组合物对待测样品进行数字pcr，根据数字pcr产物确定或辅助确定待测样品是否为禽呼肠孤病毒或，是否含有禽呼肠孤病毒或，是否感染禽呼肠孤病毒。
34.上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
35.所述数字pcr中采用的数字pcr反应体系由arv-f、arv-r、arv-probe、2
×
supermix反应液、模板dna和depc水组成。
36.进一步地，所述arv-f、arv-r和arv-probe在pcr反应体系内的体积比为4:4:1。
37.本发明实现的有益效果如下：
38.1、本发明提供的用于检测禽呼肠孤病毒的引物及探针组合物具有高度的灵敏性，检测线可为10copies
.
μl-1
，同时具有良好的特异性和重复性。适用于生产实践中禽呼肠孤病毒的检测。
39.2、本发明提供的技术方案适用于产业化，同时为禽呼肠孤病防控提供了更高水准的检测方法。
附图说明
40.图1为禽呼肠孤病毒ddpcr退火温度的优化。
41.图2为ddpcr标准品反应微滴生成数。
42.图3为ddpcr标准品反应浓度。
43.图4为ddpcr标准曲线。
44.图5为禽呼肠孤病毒ddpcr方法特异性试验结果。
具体实施方式
45.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
46.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
47.下述实施例中的禽呼肠孤病毒为禽呼肠孤病毒arv s1133株在文献“黄莉等.禽呼肠孤病毒感染对spf鸡外周血淋巴细胞中天然免疫相关基因转录的影响.畜牧兽医学报.2017,48(1)：116-123”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
48.流感病毒(aiv)aiv h5亚型在文献“何莹等，h5亚型和n6亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测方法的建立.动物医学进展,2017,38(03):1-4.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
49.新城疫病毒(ndv)ndv f48e9株在文献“谢芝勋等.应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的研究.中国预防兽医学报,2000,22(6)：443-446.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
50.鸡细小病毒(chpv)chpv在文献“张艳芳,谢芝勋,邓显文,谢志勤,张民秀,罗思思,谢丽基,范晴,曾婷婷,黄娇玲,王盛,刘加波.鸡传染性贫血病毒与鸡细小病毒双重pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2021,57(04):21-24.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0051]
鸡传染性贫血(ciav)gx1801在文献“邓显文等.3株鸡传染性贫血病毒的全基因组
序列分析.中国兽药杂志,2020,54(03):7-14.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0052]
禽腺病毒(fadv)血清4型禽腺病毒fadv-4在文献“石勇丽,谢芝勋,罗思思,韦悠,王盛,任红玉,谢丽基,万丽军,李孟,黄娇玲.血清4型禽腺病毒感染lmh细胞中toll样受体mrna转录水平的动态变化[j].中国兽医科学,2022,52(01):85-92.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、引物和探针的设计
[0053]
选取arv s1133核酸序列的保守区(genebank登录号为l39002.1)，设计标准曲线引物bq-f、bq-r，在此区间内设计检测引物arv-f、arv-r，以及命名为arv-probe的特异性探针(见表1)，
[0054]
表1：arv ddpcr的引物和探针
[0055][0056]
实施例2、标准质粒的构建
[0057]
以禽呼肠孤病毒s1133株反转录的cdna为模板，使用引物bq-f、bq-r进行pcr扩增获得核苷酸序列如seq id no.1所示的目的片段，将扩增的目的片段克隆至pmd18-t(购买于takara生物公司，货号：6011)，通过蓝白班筛选出阳性克隆，送生物公司测序，将测序正确的单菌落，扩大培养，抽提质粒，获得的阳性质粒命名为pmd18-t-arv，pmd18-t-arv含有seq id no.1所示的dna片段。
[0058]
pmd18-t-arv为arvs阳性标准品质粒。
[0059]
实施例3、ddpcr反应条件的优化
[0060]
ddpcr包含微滴生成、pcr扩增和微滴读取这3个步骤，具体操作步骤如下：
[0061]
1、配置pcr反应体系具体见表2，配置完成后振荡混匀，离心除气泡，加入新的微滴生成板中间一排8孔中，在最低一排8个孔中加入70μl微滴生成油，然后平稳放入微滴生成仪中，生成微滴；
[0062]
2、微滴生成于最上面一排孔内，缓慢吸出，加入96孔板内，封膜，放入pcr仪中按照表3程序进行反应；
[0063]
3、pcr反应完后，将96孔板放入微滴读取仪中，打开quantasoft软件根据试验样品填写信息，完成后开始运行，结束后自动分析。按照这3个步骤建立arv ddpcr检测方法，首先对引物、探针浓度及退火温度进行优化。
[0064]
表2：ddpcr反应体系
[0065][0066][0067]
表3：ddpcr反应条件
[0068][0069]
其中，dna模板为标准品质粒。
[0070]
3.1、引物和探针浓度的优化
[0071]
设置4组引物和探针的浓度，分别为第一组：1000nmol
.
l-1
+250nmol
.
l-1
，第二组：1000nmol
.
l-1
+500nmol
.
l-1
，第三组：450nmol
.
l-1
+250nmol
.
l-1
，第四组：450nmol
.
l-1
+250nmol
.
l-1
。使用等量浓度为1
×
102copies
.
μl-1
标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次，其中第一组的拷贝数平均值最高，为108copies。因此选取最佳引物和探针浓度分别为1000和250nmol
.
l-1
。
[0072]
3.2、退火温度优化
[0073]
设置7个温度梯度分别为：65、64.4、63.1、61.2、59、57.1、55.8℃及使用等量的标准品质粒为模板进行反应，结果如图1所示，图1中，a03表示65℃、b03表示64.4℃、c03表示
63.1℃、d03表示61.2℃、e03表示59℃、f03表示57.1℃、g03表示55.8℃、h03表示ck(退火温度是55℃)。图1结果表明，在退火温度为57.1℃时，上面蓝色部分形成条带的阳性微滴较高，且与下面黑色部分形成条带的阴性微滴分离清晰，说明信号强度最强，因此选取最佳退火温度57.1℃。
[0074]
优化后的反应体系和反应程序为：采用20μl的pcr反应体系，加入的引物终浓度为1000nmol
.
l-1
，加入的探针终浓度为250nmol
.
l-1
,检测标准品时加入的质粒模板量在1-20000copies范围内，检测病体组织抽提的病毒rna反转录得到的cdna的模板量在1-100000copies范围内；配置好pcr反应体系后生成微滴，然后进行pcr反应，pcr反应包括酶激活、变性、退火/延伸、酶失活、保存。其中变性到退火/延伸这步循环40次，其他步骤均一次，退火延伸温度采用57.1℃，反应结束后保存时间不易过长，应尽快进行下一步：读数。读数可以直观读出20μl反应体系生成的微滴数、阳性微滴数以及模板的浓度。
[0075]
实施例4、灵敏度
[0076]
将实施例构建的阳性标准品质粒pmd18-t-arv稀释成1
×
104、1
×
103、1
×
102、1
×
101、1
×
100copies
.
μl-1
，分别标记为arv10000、arv1000、arv100、arv10、arv1。以arv10000、arv1000、arv100、arv10、arv1为模板，按照实施例3优化的反应体系和反应程序进行ddpcr扩增获得目的片段，每个标准品进行三次实验，生成标准曲线。
[0077]
结果如图2所示，反应的最高微滴数为18081，最低微滴数为13498，总微滴数均超过了10000，结果全在可信区间，说明微滴生成过程正常，确定了质粒标准品的准确性，保证实验结果分析的有效性。图3和图4可以看出四个梯度定量拷贝数呈现一定倍比关系，arv ddpcr标准曲线为：y＝0.617x+37.204、r2＝0.9997，线性关系良好，说明arv ddpcr检测方法定量可靠，建立的arv ddpcr最低能检测到10copies
.
μl-1
，灵敏度极高，可用于对临床样品的检测。
[0078]
实施例5、特异性
[0079]
用实施例3优化后的arv ddpcr检测方法检测流感病毒aiv h5亚型、新城疫病毒ndv f48e9株、鸡细小病毒chpv、鸡传染性贫血病毒gx1801、禽腺病毒(fadv)fadv-4及禽呼肠孤病毒s1133株，即分别以aiv h5亚型、ndv、chpv、ciav、fadv及arv病毒cdna为模板采用检测引物f(1000nmol
.
l-1
)、r(1000nmol
.
l-1
)、arv-探针(250nmol
.
l-1
)，按照实施例3优化的反应体系和反应程序进行ddpcr扩增获得目的片段，结果如图5显示：arv阳性，其他均为阴性，说明该检测引物arv-f、arv-r、arv-探针的特异性良好。
[0080]
实施例6、重复性
[0081]
实验的过程：取7日龄spf鸡通过足垫注射法以0.1ml、104tcid50/0.1ml的arv s1133株病毒进行攻毒处理，随机选取攻毒3天后的脾脏样品(3d脾脏)、攻毒1天后的胸腺样品(1d胸腺)、攻毒2天后的胸腺样品(2d胸腺)、攻毒5天后的法氏囊样品(5d法氏囊)，使用终浓度为1000、1000和250nmol
.
l-1
的引物arv-f、arv-r及arv-探针，配置pcr反应体系，生成微滴，退火温度为57.1℃进行pcr反应，反应结束后放入微滴读取仪进行读数，该实验重复10次)，结果如表4所示，变异系数均小于15％，说明本研究建立的arv ddpcr检测方法重复性好，检测结果稳定可靠。
[0082]
表4：arv ddpcr重复性实验
[0083][0084]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
技术特征：1.检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的数字pcr试剂或试剂盒，所述数字pcr试剂或试剂盒包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段在内的禽呼肠孤病毒基因组dna片段的引物和与核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段特异结合的探针组成。2.如权利要求1所述的数字pcr试剂或试剂盒，其特征在于：所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物arv-f和引物arv-r、探针arv-probe，所述引物arv-f为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的单链dna或其衍生物；所述引物arv-r为核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna或其衍生物；所述探针arv-probe的核苷酸序列是序列表中seq id no.4。3.如权利要求1或2所述的数字pcr试剂或试剂盒，其特征在于：所述arv-f、arv-r、arv-probe的物质的量比值为4:4:1。4.如权利要求1-3中任一项所述的数字pcr试剂或试剂盒，其特征在于：所述数字pcr试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。5.如权利要求4所述的数字pcr试剂或试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子。6.检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的组合物，所述组合物包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段在内的禽呼肠孤病毒基因组dna片段的引物和与核苷酸序列是seq id no.1第472-551位的dna片段特异结合的探针组成。7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物arv-f和arv-r、探针arv-probe，所述arv-f为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的单链dna或其衍生物；所述arv-r为核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna或其衍生物；所述arv-probe的核苷酸序列是序列表中seq id no.4。8.如权利要求6或7所述的组合物，其特征在于：所述arv-f、arv-r、arv-probe的物质的量比值为分别为4:4:1。9.权利要求6-8中任一项所述的组合物在如下a1)-a6)中的应用：a1)检测或辅助检测禽呼肠孤病毒；a2)检测或辅助检测待测样本是否感染禽呼肠孤病毒；a3)检测或辅助检测待测病原是否为禽呼肠孤病毒；a4)制备检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的产品；a5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染禽呼肠孤病毒的产品；a6)制备检测或辅助检测待测病原是否为禽呼肠孤病毒的产品。10.检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1-5中任一项所述的数字pcr试剂或试剂盒或权利要求6-8中任一项所述的组合物对待测样品进行数字pcr，根据数字pcr产物确定或辅助确定待测样品是否为禽呼肠孤病毒或，是否含有禽呼肠孤病毒或，是否感染禽呼肠孤病毒。
技术总结本发明公开了禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测引物组合物及其检测方法，属于微生物的测定或检验方法技术领域。本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的引物及探针组合物，所述引物及探针组合物包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段在内的禽呼肠孤病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。本发明提供的用于检测禽呼肠孤病毒的引物及探针组合物具有高度的灵敏性，检测线可为10copies
技术研发人员：谢芝勋 万丽军 王盛 任红玉 谢丽基 谢志勤 邓显文 范晴 罗思思 张艳芳 黄娇玲 曾婷婷 张民秀
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
